甲鈷胺對牙髓干細胞體外成神經(jīng)向分化的影響

吳作棟，潘爽，李艷萍，何麗娜，張維甲，牛玉梅

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院牙體牙髓病科，哈爾濱 150001)

面神經(jīng)損傷是口腔科常見疾病之一，可由外傷、腫瘤、炎癥以及醫(yī)源性損傷引起，會導(dǎo)致患者出現(xiàn)語言障礙、進食困難、無法傳達面部表情等，嚴重影響患者身心健康。目前神經(jīng)損傷的治療仍是臨床上的挑戰(zhàn)之一，近年來應(yīng)用干細胞治療神經(jīng)損傷成為研究熱點。干細胞能夠增強運動神經(jīng)元的再生能力，并且干細胞可以分化為神經(jīng)元樣細胞以代替受損的神經(jīng)元，恢復(fù)神經(jīng)支配以避免肌肉的早期萎縮[1-2]。牙髓干細胞和神經(jīng)細胞均起源于神經(jīng)嵴細胞，有較強的神經(jīng)分化潛能，可分化為功能性神經(jīng)元以及神經(jīng)膠質(zhì)細胞，還能分泌和表達多種神經(jīng)營養(yǎng)因子。牙髓干細胞可通過拔除的阻生第三磨牙獲取，是較為理想的替代受損神經(jīng)細胞的來源[3-4]。甲鈷胺是內(nèi)源性維生素B12，在維生素B12中心的鈷分子上結(jié)合了1個甲基，其活性更高，可促進核酸、蛋白和脂肪的代謝。甲鈷胺是甲硫氨酸合成酶的輔酶，在高半胱氨酸向甲硫氨酸轉(zhuǎn)化過程中起重要作用。神經(jīng)組織發(fā)生損傷時，甲鈷胺可以促進損傷區(qū)域施萬細胞的分裂以及髓鞘的再生，從而促進受損神經(jīng)恢復(fù)，是臨床上治療神經(jīng)系統(tǒng)病變的常用藥物[5]。研究表明，甲鈷胺能夠誘導(dǎo)大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)元樣細胞[6]，而甲鈷胺對牙髓干細胞成神經(jīng)向分化的影響鮮有報道。本研究主要分析甲鈷胺對牙髓干細胞成神經(jīng)向分化的作用，以期為臨床上應(yīng)用甲鈷胺及牙髓干細胞治療面神經(jīng)損傷提供理論參考。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器 甲鈷胺(上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產(chǎn)，批號：20191203)，0.25%胰酶/乙二胺四乙酸二鉀、青霉素/鏈霉素、胎牛血清(美國Gibco公司)，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)、DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium assay,MTT)(美國Sigma公司)，巢蛋白(Nestin)、神經(jīng)絲H(nerve filament H，NF-H)、S100一抗(武漢博士德生物工程有限公司)，倒置熒光顯微鏡IX73(日本Olympus公司)，酶標儀ELX800(美國BioTek公司)等。

1.2兔牙髓干細胞的分離和培養(yǎng) 清潔級健康新西蘭家兔8只，雄性，體重2.0～2.5 kg，購自哈爾濱珍寶藥業(yè)有限公司，許可證號：SCXK(黑)2018-0001，實驗于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物實驗中心進行(實驗動物及方案通過哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物倫理委員會批準)，飼養(yǎng)條件：室溫20～25 ℃,濕度55%～65%。完整拔除兔牙，無菌環(huán)境中取出牙髓組織，采用酶解組織塊法分離和培養(yǎng)兔牙髓干細胞[7]。

1.3MTT法測定 MTT法檢測不同濃度甲鈷胺對兔牙髓干細胞活性的影響，將第四代兔牙髓干細胞以3×103個/孔的密度接種于96孔板中，放入孵箱24 h，待細胞貼壁后，去除培養(yǎng)基。將細胞按照不同的處理方式分為對照組和實驗組，對照組加入含10% FBS、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，實驗組分別加入含有25、50和100 mg/L甲鈷胺的DMEM高糖培養(yǎng)基，分別于第1、2和3天時加入MTT溶液(0.5 mg/mL)，放入孵箱4 h后小心吸取培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜15 min后在490 nm處測量吸光度值，每組設(shè)置3個平行對照。

1.4牙髓干細胞的神經(jīng)誘導(dǎo)及分組 配制神經(jīng)誘導(dǎo)液進行神經(jīng)誘導(dǎo)[8]，A液是包含10 ng/mL堿性纖維母細胞生長因子、500 μmol/L β-巰基乙醇和10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基；B液是含有100 μmol/L丁基羥基茴香醚和2%二甲基亞砜的無FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基。按照不同的處理方式分為4組，對照組：兔牙髓干細胞在DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h；甲鈷胺組：兔牙髓干細胞在含有100 mg/L甲鈷胺的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h；神經(jīng)誘導(dǎo)液組：兔牙髓干細胞在DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)42 h，然后依次在A液、B液中培養(yǎng)24 h和6 h；甲鈷胺+神經(jīng)誘導(dǎo)液組：兔牙髓干細胞在含有100 mg/L甲鈷胺的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)42 h，然后依次在A液和B液中培養(yǎng)24 h和6 h，每組設(shè)置3個平行對照。

1.5蛋白免疫印跡 采用蛋白免疫印跡法檢測神經(jīng)誘導(dǎo)后兔牙髓干細胞NF-H和S100蛋白的表達情況。以3×105個/孔的密度將第四代兔牙髓干細胞接種于6孔板中，24 h細胞貼壁后進行神經(jīng)誘導(dǎo)實驗。神經(jīng)誘導(dǎo)實驗后用含有苯甲基磺酰氟的組織快速裂解液(苯甲基磺酰氟∶組織快速裂解液=100∶1)提取細胞總蛋白，二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。每孔總蛋白上樣量25 μg，8% Tris-甘氨酸十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上，配制5%脫脂奶粉封閉液，室溫條件下封閉2 h。孵育、Nestin、NF-H和S100一抗4 ℃過夜，用含0.05% Tween-20的Tris-HCl緩沖鹽溶液漂洗3次，室溫條件下進行二抗孵育1 h，Tris-HCl緩沖鹽溶液漂洗3次，采用電化學(xué)發(fā)光液曝光顯影。用Image J軟件分析圖像的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，每組設(shè)置3個平行對照。

1.6免疫熒光 兔牙髓干細胞接種于24孔板中，每孔接種量為1×104個/mL。用含有100 mg/L甲鈷胺的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，對照組為不含甲鈷胺的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d。PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次，0.1% Triton X-100透膜15 min，PBS漂洗3次，1%封閉液封閉20 min，孵育NF-H和S100一抗4 ℃過夜，PBS漂洗一遍，避光下孵育熒光二抗1 h，PBS漂洗一遍后熒光顯微鏡下拍照，每組設(shè)置3個平行對照。

1.7茜素紅染色 兔牙髓干細胞接種于24孔板中，每孔接種量為1×104。用含有100 mg/L甲鈷胺的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，對照組為不含甲鈷胺的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d。PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次，配置濃度為1%的茜素紅染色染液，然后加入1 mL室溫保持30 min，蒸餾水沖去表面染色，自然風(fēng)干，顯微鏡下觀察，拍照，隨機選取5個視野統(tǒng)計礦化結(jié)節(jié)數(shù)量，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1細胞形態(tài)學(xué)觀察 采用酶解組織塊法分離和培養(yǎng)兔牙髓干細胞，原代細胞培養(yǎng)2 d時可見組織塊周圍有細胞游出，細胞貼壁，呈紡錘形和梭形(圖1a)，培養(yǎng)7 d傳代，細胞呈單一長梭形(圖1b)。

1a：原代細胞形態(tài)；1b：傳代細胞形態(tài)

2.2甲鈷胺對兔牙髓干細胞活性的影響 MTT結(jié)果顯示，第1、2和3天時，各組間OD值比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 不同濃度甲鈷胺OD值的比較

2.3甲鈷胺誘導(dǎo)兔牙髓干細胞成神經(jīng)向分化的濃度選擇 蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示,不同濃度甲鈷胺處理兔牙髓干細胞3 d后Nestin蛋白的相對表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，25 mg/L、50 mg/L 和100 mg/L甲鈷胺組Nestin蛋白的相對表達量高于對照組，50 mg/L和100 mg/L甲鈷胺組高于25 mg/L甲鈷胺組，100 mg/L甲鈷胺組高于50 mg/L甲鈷胺組(P<0.05)，見圖2和表2。因此，選擇100 mg/L甲鈷胺用于后續(xù)實驗。

Nestin：巢蛋白;β-actin:β-肌動蛋白

表2 不同濃度甲鈷胺處理兔牙髓干細胞3 d后Nestin蛋白的相對表達量比較

2.4甲鈷胺對兔牙髓干細胞成神經(jīng)向分化的影響 蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，各組細胞的NF-H和S100蛋白相對表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，100 mg/L甲鈷胺組、神經(jīng)誘導(dǎo)液組、100 mg/L甲鈷胺+神經(jīng)誘導(dǎo)液組NF-H和S100蛋白相對表達量高于對照組，神經(jīng)誘導(dǎo)液組、100 mg/L甲鈷胺+神經(jīng)誘導(dǎo)液組高于100 mg/L甲鈷胺組，100 mg/L甲鈷胺+神經(jīng)誘導(dǎo)液組高于神經(jīng)誘導(dǎo)液組(P<0.05)，見圖3和表3。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)過100 mg/L甲鈷胺處理3 d后，兔牙髓干細胞的NF-H和S100明顯呈陽性表達，見圖4。

NF-H：神經(jīng)絲H;β-actin:β-肌動蛋白

表3 各組細胞的NF-H和S100蛋白相對表達量比較

2.5甲鈷胺對兔牙髓干細胞礦化結(jié)節(jié)的影響 茜素紅染色結(jié)果顯示，經(jīng)過100 mg/L甲鈷胺處理3 d后細胞排列呈以礦化結(jié)節(jié)為中心的火山口樣、漩渦狀，局部聚集成灶，礦化結(jié)節(jié)數(shù)為(2.41±0.14)個，對照組為(0.82±0.11)個，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.468，P<0.001)。見圖5。

3 討 論

面神經(jīng)缺損的修復(fù)一直是口腔醫(yī)學(xué)界的難題之一，神經(jīng)受損后患者的生活質(zhì)量大大降低。自體神經(jīng)移植仍是目前修復(fù)神經(jīng)缺損的金標準，但該技術(shù)有一定的局限性，包括可移植的神經(jīng)數(shù)量有限、造成供區(qū)額外損傷、形成神經(jīng)瘤等[9]。

近年來，神經(jīng)損傷的干細胞療法備受關(guān)注。牙髓干細胞是來源于神經(jīng)嵴的間充質(zhì)干細胞，其增殖能力強，具有多向分化潛能，在體外可被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細胞[10]。牙髓干細胞可以從阻生齒或正畸拔除的牙中提取出來，其不僅能表達多種神經(jīng)標志物(Nestin、膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體、S100等)，還能分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子[11]，是一種理想的促進神經(jīng)損傷恢復(fù)的干細胞。甲鈷胺作為內(nèi)源性維生素B12，對維持神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定發(fā)揮著重要作用，人體缺乏甲鈷胺會引起神經(jīng)系統(tǒng)病變[12]。甲鈷胺參與甲基化循環(huán)過程，為該循環(huán)中的某些甲基化反應(yīng)提供甲基供體[13]。有研究表明，甲鈷胺可以促進大鼠小腦顆粒神經(jīng)元神經(jīng)突觸的生長[14]，大鼠骨髓間充質(zhì)細胞經(jīng)甲鈷胺誘導(dǎo)后會分化為神經(jīng)元樣細胞[6]。甲鈷胺還能促進大鼠脫髓鞘坐骨神經(jīng)中施萬細胞的分化和髓鞘的再生[15-16]。本研究采用酶解組織塊法分離和培養(yǎng)兔牙髓干細胞開展研究，MTT檢測結(jié)果顯示，經(jīng)過含有不同濃度甲鈷胺的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)后，第1、2和3天時各組OD值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明甲鈷胺對兔牙髓干細胞的活性無抑制作用，不會影響牙髓干細胞的增殖。

圖4a-4f為NF-H的染色；圖4g-4l為S100的染色；NF-H：神經(jīng)絲H

圖5 用含和不含100 mg/L甲鈷胺的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)兔牙髓干細胞3 d后兔牙髓干細胞礦化結(jié)節(jié)情況(茜素紅染色，×400)

Nestin主要在胚胎期的神經(jīng)干細胞和神經(jīng)前體細胞中表達，被廣泛用于神經(jīng)干細胞鑒定，并被視為神經(jīng)細胞再生的生物學(xué)標志物[17-18]。本實驗蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示,不同濃度的甲鈷胺在3 d后均明顯促進兔牙髓干細胞Nestin蛋白的表達，證明甲鈷胺可促進兔牙髓干細胞的神經(jīng)向分化，且100 mg/L甲鈷胺組表達量高于50 mg/L甲鈷胺組和25 mg/L甲鈷胺組。神經(jīng)絲是細胞骨架的一種，其主要存在于神經(jīng)元，能夠支持細胞，對細胞間的物質(zhì)交換以及細胞的分化起重要作用。NF-H是高分子神經(jīng)絲蛋白，其出現(xiàn)代表著神經(jīng)元的成熟[19]。S100蛋白能夠調(diào)節(jié)細胞的能量代謝和鈣離子水平，具有營養(yǎng)神經(jīng)的作用，能夠促進神經(jīng)損傷的修復(fù)[20-21]。本實驗中蛋白免疫印跡法和免疫熒光實驗檢測NF-H和S100蛋白相對量，結(jié)果顯示，經(jīng)過甲鈷胺處理后，兔牙髓干細胞的NF-H和S100表達升高；免疫熒光實驗也顯示，經(jīng)過甲鈷胺處理后，兔牙髓干細胞的NF-H和S100呈明顯的陽性表達，神經(jīng)向分化的最終環(huán)節(jié)是細胞外基質(zhì)礦化，經(jīng)過100 mg/L甲鈷胺處理3 d后細胞排列呈以礦化結(jié)節(jié)為中心的火山口樣、漩渦狀，局部聚集成灶，均證明了甲鈷胺能夠促進兔牙髓干細胞的成神經(jīng)向分化，但具體的調(diào)節(jié)機制還有待進一步實驗探究。

綜上所述，甲鈷胺處理3 d后能夠促進兔牙髓干細胞的成神經(jīng)向分化，且不影響細胞的活性，進一步應(yīng)用于動物實驗是可行的，該實驗可為未來臨床應(yīng)用甲鈷胺及牙髓干細胞治療面神經(jīng)損傷及其他神經(jīng)系統(tǒng)病變提供理論參考。