老年大鼠慢性阻塞性肺疾病模型建立后認(rèn)知功能的變化

萬朝暉 劉冰 景珩 吳蘇寧

【摘要】 目的：探討老年大鼠慢性阻塞性肺疾病模型建立后認(rèn)知功能的變化。方法：選擇60只老年雄性SD大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為COPD組（30只）和對照組（30只）。COPD組大鼠采用氣道內(nèi)滴注脂多糖和香煙煙熏法建立慢性阻塞性肺疾病模型。模型建立后，采用HE染色法觀察兩組的組織形態(tài)學(xué)變化。在慢性阻塞性肺疾病模型建立后的第1、7、14、30天，采用Morris水迷宮系統(tǒng)檢測兩組的平均逃避潛伏期。采用t檢驗(yàn)和重復(fù)測量方差分析比較兩組平均逃避潛伏期的差異和變化。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)期間，COPD組3只大鼠死亡，對照組2只大鼠死亡，其余大鼠存活良好。HE染色顯示兩組間有顯著性差異。干預(yù)前，兩組平均逃避潛伏期比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;慢性阻塞性肺疾病模型建立后第1、7、14、30天，COPD組老年大鼠的平均逃避潛伏期均明顯長于對照組（P<0.05），差異逐漸增大。結(jié)論：慢性阻塞性肺疾病模型建立后，老年大鼠的平均逃避潛伏期增加，認(rèn)知功能下降，隨著時(shí)間的推移，老年大鼠的認(rèn)知功能越來越差，應(yīng)早期進(jìn)行臨床干預(yù)。

【關(guān)鍵詞】 慢性阻塞性肺疾病 老年 認(rèn)知功能

Changes of Cognitive Function after Establishment of Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Elderly Rats/WAN Zhaohui， LIU Bing， JING Heng， WU Suning. //Medical Innovation of China， 2021， 18（33）： 00-008

[Abstract] Objective： To explore the changes of cognitive function of aged rats after the establishment of chronic obstructive pulmonary disease model. Method： A total of 60 aged male SD rats were selected and divided into the COPD group （30 rats） and the control group （30 rats） according to the method of random number table. The COPD group rats were established COPD model by intratracheal instillation of lipopolysaccharide and fumigation. After the establishment of the model， HE staining was used to observe the histopathological changes of the two groups. On the first day and the 7th， 14th and 30th day after the establishment of the COPD model， Morris water maze system was used to detect the average escape latency of the two groups， t-test and repeated measurement analysis of variance were used to compare the differences and changes of the average escape latency of the two groups. Result： During the experiment， 3 rats in the COPD group died， 2 rats in the control group died， and the other rats survived well. HE staining showed that there was significant difference between the two groups. Before intervention， there was no significant difference in the average escape latency between the two groups （P>0.05）; on the first day， the 7th， 14th and 30th day after the establishment of COPD model， the average escape latency time of the old rats in the COPD group were significantly longer than those of the control group （P<0.05）， the difference gradually increased. Conclusion： After the establishment of COPD model， the average escape latency of elderly rats increases and the cognitive function decreases， with the passage of time， the cognitive function of elderly rats becomes worse and worse， so clinical intervention should be carried out early.

[Key words] COPD Elderly Cognitive function

First-author’s address： Jining First People’s Hospital， Jining 272100， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.33.002

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）具有顯著的肺外合并癥，神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙是COPD的主要肺外并發(fā)癥之一，通常表現(xiàn)為感覺運(yùn)動功能障礙[1]，也有不同程度的短期和長期記憶障礙和注意力障礙[2-3]。認(rèn)知功能障礙是指患者存在一項(xiàng)或多項(xiàng)功能受損如記憶、視空間覺、執(zhí)行能力、計(jì)算和理解能力等。合并認(rèn)知功能障礙的COPD患者生活質(zhì)量明顯下降，再住院率及死亡率升高[4]。COPD患者認(rèn)知障礙的風(fēng)險(xiǎn)隨著COPD持續(xù)時(shí)間而增加[5]。當(dāng)血氧飽和度低于88%時(shí)，認(rèn)知障礙的發(fā)生率增加了2.5倍[6]。Hoiland等[7]報(bào)道，長期氧療的COPD患者認(rèn)知功能評分高于未進(jìn)行氧療患者。因此，認(rèn)知障礙與COPD嚴(yán)重程度存在相關(guān)性，但目前有關(guān)COPD病程中認(rèn)知功能變化特征的研究較少。因此，本研究旨在建立老年大鼠COPD模型，同時(shí)評估不同時(shí)間點(diǎn)老年大鼠認(rèn)知功能的變化，并與正常老年大鼠進(jìn)行對比分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 本研究選用60只雄性SD大鼠，月齡18～20個(gè)月，體重450～500 g，均購自北京乾信實(shí)驗(yàn)動物有限公司。將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為COPD組（n=30）和對照組（n=30）。大鼠被飼養(yǎng)在室溫26～28 ℃、每天日照時(shí)間為12 h的動物實(shí)驗(yàn)室，所有大鼠能夠自由進(jìn)食和飲水。在動物實(shí)驗(yàn)室中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，對大鼠進(jìn)行測試。

1.2 建立COPD模型 大鼠COPD模型采用氣道內(nèi)滴注脂多糖和香煙煙熏法建立[8]。模型在30 d內(nèi)完成。在第1、14天，將10%水合氯醛注射到大鼠的腹腔中進(jìn)行麻醉。麻醉成功后，將200 μL脂多糖（1 g/L）注射入氣道。在第2天至第30天（第14天除外），大鼠每天早上和下午接受兩次煙熏，間隔時(shí)間超過6 h。將大鼠置于1 m3的密閉房間中，每天連續(xù)吸入香煙煙霧2次，每次10支香煙。對照組氣道內(nèi)注射0.9%氯化鈉溶液。

1.3 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) （1）組織形態(tài)學(xué)觀察。第31天應(yīng)用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察兩組支氣管肺組織病理學(xué)變化。乙醇脫水、二甲苯透明、蠟杯浸泡、包埋和切片后，將染色的載玻片干燥。在光學(xué)顯微鏡下觀察兩組大鼠染色支氣管和肺組織的病理變化，進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，確認(rèn)COPD建模成功。（2）認(rèn)知功能檢測。采用北京碩林苑科技有限公司設(shè)計(jì)的Morris水迷宮系統(tǒng)檢測大鼠的認(rèn)知功能。控制室溫度為25 ℃，內(nèi)部環(huán)境保持低光和安靜。向水池中加入水，水面覆蓋1 cm的平臺，調(diào)節(jié)水溫到25 ℃，水面被分成四個(gè)象限，即1、2、3、4，平臺被放置在第一象限的中心。大鼠分別從四個(gè)象限的中央面向池壁放入水中。觀察60 s，記錄大鼠找到并停留在平臺頂部的時(shí)間，即為逃避潛伏期，若60 s內(nèi)未找到平臺或僅發(fā)現(xiàn)平臺的被記錄為60 s。取四個(gè)象限所用時(shí)間的平均值來計(jì)算平均逃避潛伏期。干預(yù)前，用上述方法訓(xùn)練大鼠3 d，大鼠在進(jìn)入水中前平均每次在平臺頂部停留20 s[8-9]。在COPD模型建立后的第1、7、14、30天，根據(jù)上述方法檢測并記錄平均逃避潛伏期。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以（x±s）表示。兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。重復(fù)測量的數(shù)據(jù)采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 老年大鼠肺組織形態(tài)學(xué)觀察 在實(shí)驗(yàn)過程中，由于建模不當(dāng)和麻醉劑過量，COPD組有3只大鼠死亡、對照組有2只大鼠死亡。通過HE染色，對照組老年大鼠肺腔通暢、肺泡結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)正常、纖毛形態(tài)正常、支氣管平滑肌未見明顯增厚。COPD組的肺支氣管壁明顯增厚、管腔變窄、肺泡壁破裂并變薄、肺泡融合形成水泡、支氣管內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤、纖毛脫落并虛脫、大量上皮細(xì)胞脫落。見圖1。

2.2 兩組老年大鼠平均逃避潛伏期比較 干預(yù)前，兩組平均逃避潛伏期比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在COPD模型建立后的第1、7、14、30天，COPD組老年大鼠的平均逃避潛伏期均明顯長于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;重復(fù)測量設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，COPD組內(nèi)老年大鼠的平均逃避潛伏期逐漸增加（P<0.05），見表1和圖2。

3 討論

COPD是一種以不完全可逆的氣流受限為特征的慢性炎癥性疾病，且在55歲之后發(fā)病率明顯增加[10]。一項(xiàng)基于中國縱向健康長壽調(diào)查的隊(duì)列研究顯示，COPD與中國老年人認(rèn)知障礙和癡呆發(fā)病率增加獨(dú)立相關(guān)[11]。核磁共振分析發(fā)現(xiàn)，COPD患者進(jìn)行性腦結(jié)構(gòu)損傷、腦局部自發(fā)活動同步性異常、內(nèi)在的功能樞紐和連接性改變與COPD相關(guān)認(rèn)知障礙有關(guān)[12-13]，因此，早期識別COPD患者認(rèn)知功能的變化對改善其預(yù)后尤為重要。Morris水迷宮模型是檢驗(yàn)嚙齒動物模型學(xué)習(xí)記憶功能的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，能夠客觀反映動物模型的認(rèn)知水平。平均逃避潛伏期越長，動物獲取空間信息的能力越差[14]。本研究采用最經(jīng)典的Morris水迷宮系統(tǒng)檢測老年COPD大鼠的認(rèn)知功能，結(jié)果表明，老年COPD大鼠的平均逃避潛伏期明顯高于對照組，且Morris等[2]報(bào)道，嚴(yán)重COPD的動物模型表現(xiàn)出顯著的記憶障礙、焦慮、運(yùn)動和自主神經(jīng)障礙，提示COPD模型的建立可導(dǎo)致老年大鼠認(rèn)知功能障礙。

盡管大量研究證實(shí)COPD和認(rèn)知障礙存在相關(guān)性，但目前有關(guān)肺功能、低氧血癥、疾病嚴(yán)重程度、病程等因素和認(rèn)知障礙的風(fēng)險(xiǎn)仍不確定[11-12，15]，可能與不同研究方法相關(guān)，如評估量表、年齡、樣本量、缺乏適當(dāng)?shù)膮⒄铡Ｒ豁?xiàng)基于COPD患者的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，基線COPD病史>5年患者認(rèn)知障礙風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，但在校正吸煙、糖尿病、高血壓、冠狀動脈疾病等因素后COPD與認(rèn)知障礙風(fēng)險(xiǎn)增加無顯著相關(guān)性，經(jīng)過認(rèn)知障礙亞型分析，COPD患者非遺忘性認(rèn)知障礙風(fēng)險(xiǎn)升高2倍[16]。而且一項(xiàng)對2 000名隨訪25年結(jié)果顯示，中年（39～64歲）診斷COPD在晚年（65～80歲）發(fā)生認(rèn)知障礙的風(fēng)險(xiǎn)增加近2倍，反而晚年診斷COPD似乎與認(rèn)知障礙呈負(fù)相關(guān)[17]，由此推測，COPD患者的認(rèn)知障礙可能與COPD的持續(xù)時(shí)間呈“劑量依賴性”，認(rèn)知障礙可能開始于慢性氣道損傷的早期階段[18]，但上述研究中COPD診斷來源于患者自我報(bào)告或醫(yī)療記錄，缺乏肺功能、病理學(xué)等依據(jù)，且基線和隨訪之間的較長時(shí)間間隔可能導(dǎo)致偏倚。因此，本研究通過設(shè)立4個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)客觀評估老年大鼠認(rèn)知功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的增加老年大鼠的平均逃避潛伏期也逐漸增加（認(rèn)知功能越來越差），表明COPD作為認(rèn)知障礙的危險(xiǎn)因素，早期積極治療COPD，對預(yù)防或延遲認(rèn)知障礙的發(fā)生和發(fā)展有重要作用。

COPD患者的認(rèn)知障礙獨(dú)立于肺部疾病相關(guān)危險(xiǎn)因素（如年齡和吸煙等），但也受到相關(guān)危險(xiǎn)因素和/或呼吸限制（如低氧血癥）的影響[7，19]。因此還需進(jìn)一步研究證實(shí)COPD和認(rèn)知障礙的關(guān)系及相關(guān)機(jī)制，以更好地理解COPD患者認(rèn)知功能下降的發(fā)生發(fā)展。目前關(guān)于COPD患者認(rèn)知障礙的潛在病理生理機(jī)制包括大腦缺氧、腦結(jié)構(gòu)改變和與炎癥介質(zhì)相關(guān)的神經(jīng)元損傷[12-13]。研究顯示，COPD低氧血癥和認(rèn)知障礙存在關(guān)系，氧氣療法和肺康復(fù)可降低認(rèn)知障礙的風(fēng)險(xiǎn)[7]。但是COPD患者認(rèn)知障礙的病理機(jī)制復(fù)雜多樣，低氧血癥本身并不能解釋COPD中發(fā)生的認(rèn)知變化，也缺乏在大量人群中進(jìn)行的前瞻性縱向研究。YIN等[13]研究發(fā)現(xiàn)，隨著COPD患者的癥狀從輕度到重度，患者腦的白質(zhì)和灰質(zhì)也表現(xiàn)出不同程度的損害。海洋生物活性化合物可以通過抗氧化、保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞等機(jī)制延緩COPD患者認(rèn)知功能下降[20]。另外，中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值與COPD的嚴(yán)重程度有關(guān)[13]，因此炎癥因子“溢出”可能導(dǎo)致COPD患者的認(rèn)知障礙，未來的炎癥因子或二氧化碳潴留可能是COPD患者認(rèn)知障礙的潛在機(jī)制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)老年COPD大鼠的平均逃避潛伏期較對照組增加，認(rèn)知功能下降，且隨著時(shí)間的推移，老年COPD大鼠的平均逃避潛伏期逐漸增加，老年COPD大鼠認(rèn)知功能越來越差。因此，在臨床實(shí)踐中應(yīng)注意評估COPD患者認(rèn)知功能，并盡早進(jìn)行臨床干預(yù)，對于提高COPD患者生活質(zhì)量和降低死亡率非常重要。

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（收稿日期：2021-08-25） （本文編輯：占匯娟）