MTHFR C677T基因多態(tài)性與浙江地區(qū)漢族人群大動脈粥樣硬化性腦梗死的相關(guān)性

邱玲玲 徐小輝 陳慧

[摘要] 目的 探討MTHFR C677T基因多態(tài)性與浙江地區(qū)漢族人群大動脈粥樣硬化性（LAA）腦梗死的相關(guān)性。 方法 選取2017年1月至2018年6月在我院住院患者及同期體檢人員共360例，分為LAA腦梗死組（病例組）180例和對照組180例，應(yīng)用PCR及TaqMan探針技術(shù)對MTHFR C677T進行基因分型檢測，分析該基因多態(tài)性與LAA腦梗死的相關(guān)性。 結(jié)果 病例組和對照組間的SBP、FBG、HbA1c、TC、TG、葉酸、Hcy比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;兩組間的年齡、DBP、LDL-C、HDL-C比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。兩組間的基因型和等位基因頻率分布比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。病例組TT型Hcy水平為[（14.10±3.96）μmol/L]高于CC型的[（9.81±3.04）μmol/L]及CT型的[（11.49±3.22）μmol/L]，對照組TT型Hcy水平為[（12.36±3.62）μmol/L]高于CC型的[（9.26±2.82）μmol/L]及CT型的[（10.15±3.04）μmol/L]。單因素線性回歸分析顯示，等位基因T與葉酸（r=0.261，β=-1.188，t=-4.847，P<0.001）、Hcy（r=0.317，β=2.404，t=6.327，P<0.001）、FBG（r=0.106，β=0.435，t=1.985，P=0.048）存在線性回歸關(guān)系。Logistic回歸分析示等位基因T、高血壓、糖尿病、Hcy是LAA腦梗死的獨立危險因素（P<0.05）。 結(jié)論 MTHFR C677T基因多態(tài)性影響Hcy、FBG，是浙江地區(qū)漢族人群LAA腦梗死的危險因素。

[關(guān)鍵詞] 大動脈粥樣硬化;基因多態(tài)性;同型半胱氨酸;亞甲基四氫葉酸還原酶

[Abstract] Objective To investigate the correlation between the gene polymorphism of methylenetetrahydrofolate reductase（MTHFR） C677T and large artery atherosclerosis（LAA） cerebral infarction in the population of Han ethnicity in Zhejiang Region. Methods From January 2017 to June 2018， a total of 360 inpatients and people receiving physical examination during the same period of time from Taizhou Municipal Hospital were selected. They were divided into 180 cases in LAA cerebral infarction group（case group） and 180 cases in control group. The PCR and TaqMan probe technology were applied for the genotyping of MTHFR C677T， and the correlation between this gene polymorphism and LAA cerebral infarction was analyzed. Results The differences in SBP， FBG， HbA1c， TC， TG， folic acid and Hcy between the case group and the control group were statistically significant（P<0.05）. There was no statistically significant difference in age， DBP， LDL-C and HDL-C between the two groups（P>0.05）. The difference in genotype and allele frequency distribution between the two groups was statistically significant（P<0.05）. The TT type Hcy level in the case group（[14.10±3.96] μmol/L） was higher than that of CC type（[9.81±3.04] μmol/L） and CT type（[11.49±3.22] μmol/L）. The TT type Hcy level（[12.36±3.62] μmol/L） in the control group was higher than that of CC type（[9.26±2.82] μmol/L） and CT type（[10.15±3.04] μmol/L）. Single factor linear regression analysis showed that allele T and folic acid（r=0.261， β= -1.188， t=-4.847， P<0.001）， Hcy（r=0.317， β=2.404， t=6.327， P<0.001）， and FBG（r=0.106， β=0.435， t=1.985， P=0.048） had a linear regression relationship. Logistic regression analysis showed that allele T， hypertension， diabetes and HHcy were independent risk factors for LAA cerebral infarction（P<0.05）. Conclusion MTHFR C677T gene polymorphism affects Hcy and FBG and is a risk factor for LAA cerebral infarction in the population of Han ethnicity in Zhejiang region.

[Key words] Large artery atherosclerosis; Gene polymorphism; Homocysteine; Methylenetetrahydrofolate reductase

大動脈粥樣硬化性（Large-artery atherosclerosis，LAA）腦梗死是腦梗死的重要類型，具有高致殘率、高病死率、高發(fā)病率等的特點。因此，加強對LAA腦梗死病因的研究有利于明確發(fā)病機制，減少發(fā)病率。有研究表明[1]，高同型半胱氨酸（Hyperhomocystinemia，HHcy）是LAA腦梗死的危險因素。同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）水平升高的原因主要包括環(huán)境及遺傳兩方面因素，其中遺傳因素是影響Hcy代謝的重要方面。亞甲基四氫葉酸還原酶（Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是Hcy代謝過程中的關(guān)鍵酶，其主要作用為將5，10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸，后者是一種甲基供體，參與體內(nèi)Hcy代謝過程而使Hcy濃度下降，當(dāng)MTHFR上677位點的等位基因C突變?yōu)門時，編碼的氨基酸發(fā)生變化使MTHFR活性及熱穩(wěn)定性下降最終導(dǎo)致Hcy水平升高[2]。MTHFR C677T突變后通過DNA甲基化影響Hcy水平[3]，促進動脈粥樣硬化，加劇腦動脈狹窄程度[4]。因此，MTHFR C677T有可能是LAA腦梗死的候選基因。本研究擬探討MTHFR C677T基因多態(tài)性與浙江地區(qū)漢族人群LAA腦梗死的相關(guān)性，為更好地指導(dǎo)LAA腦梗死的一級預(yù)防工作提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2018年6月在我院神經(jīng)內(nèi)科住院患者及同期體檢人員共360例。LAA腦梗死180例（病例組），年齡40～78歲，平均（64.32±8.67）歲;其中男110例，女70例，均符合《中國各類主要腦血管病診斷要點2019》的LAA腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。排除卒中史、顱內(nèi)占位性病變、混合型腦梗死（梗死后出血或出血后梗死）者;排除動脈炎、寄生蟲病、代謝障礙等其他原因所致的腦梗死者;排除患有嚴(yán)重心肝腎功能不全、血液病、呼吸衰竭、惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、心臟瓣膜病、心房顫動者;排除妊娠者等。對照組為我院同期體檢人員共180例，無急性缺血性腦卒中，經(jīng)頭顱MRI檢查證實正常，年齡45～78歲，平均（62.67±8.17）歲;其中男97例，女83例。所有受試者近3個月內(nèi)均未服用過葉酸、維生素B6、維生素B12。兩組間的性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（性別：χ2=1.921，P=0.201;年齡：t=1.864，P=0.063），具有可比性。本研究經(jīng)臺州市立醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 基本資料收集及相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)? 所有受試者于入院時記錄年齡、性別、收縮壓（Systolic blood pressure，SBP）、舒張壓（Diastolic blood pressure，DBP）、高血壓病史、糖尿病史、卒中史、冠心病史及家族史等，入院第2天空腹抽取靜脈血測定總膽固醇（Total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、三酰甘油（Triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、糖化血紅蛋白（Glycosylated he-moglobin，HbA1c）、尿酸（Uric acid，UA）、空腹血糖（Fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、Hcy、葉酸等指標(biāo)。HHcy診斷標(biāo)準(zhǔn)：Hcy水平≥10 μmol/L[6];2型糖尿病[7]、高血壓病[8]及血脂異常[9]診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)相關(guān)文獻。冠心病包括有客觀證據(jù)（如心電圖、冠狀動脈造影等）的心肌缺血、急性冠狀動脈綜合征（不穩(wěn)定性心絞痛和急性心肌梗死）、陳舊性心肌梗死、穩(wěn)定性心絞痛、冠狀動脈旁路移植術(shù)（Coronary artery bypass grafting，CABG）及冠狀動脈介入治療術(shù)（Percutaneous coronary intervention，PCI）后患者[10]。

1.2.2 標(biāo)本采集及DNA提取? 受試者禁食12～14 h，取肘靜脈血5 mL，加入EDTA抗凝試管中，嚴(yán)格按照MTHFR C677C/T基因檢測試劑盒（深圳奧薩醫(yī)藥有限公司）說明書提取基因組DNA，并置于-20℃冰箱保存。同期取肘靜脈血檢測表1各代謝指標(biāo)。

1.2.3 引物序列? 參照文獻[11]設(shè)計引物，上游引物為5′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3′，下游引物為5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′;由美國ABI公司合成。

1.2.4 基因多態(tài)性檢測? 采用PCR-TaqMan探針技術(shù)對MTHFR C677T基因（SNP ID：rs1801133）多態(tài)性進行檢測，步驟如下：由美國ABI公司設(shè)計的兩條MGB探針，一條以VIC 熒光標(biāo)記堿基G，對應(yīng)樣本基因突變位點C;一條以 FAM 熒光標(biāo)記堿基A，對應(yīng)樣本基因突變位點T。MTHFR C677T real-time PCR采用20 μL反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2 μL，25 mM MgCl2 1.12 L，rTaq 0.8 μL，100 mM dNTP 0.16 μL，引物探針 0.25 μL，DNA模板4 μL，dd H2O 11.67 μL。PCR擴增檢測在 ABI 7500 實時熒光 PCR儀上進行。反應(yīng)條件為：50℃2 min，95℃預(yù)變性 2 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共45個循環(huán)。產(chǎn)物擴增后同步進行數(shù)據(jù)分析，并使用Genotyping軟件分析基因分型數(shù)據(jù)，各基因型結(jié)果見圖1～3。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量資料符合正態(tài)分布、方差齊性時以（x±s）表示，采用t檢驗;計數(shù)資料以[n（%）]表示;采用χ2檢驗分析基因型及等位基因頻率的分布差異;采用單因素方差分析比較各組內(nèi)不同基因型間Hcy水平差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗;采用單因素線性回歸分析數(shù)量性狀位點;采用Logistic回歸分析影響LAA腦梗死的危險因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般臨床資料比較

兩組間的SBP、FBG、HbA1c、TC、TG、葉酸、Hcy比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），兩組間的年齡、DBP、LDL-C、HDL-C比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2 基因型和等位基因頻率分布比較

兩組人群基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，具有人群代表性。兩組間的基因型和等位基因頻率分布比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 兩組內(nèi)不同基因型間的Hcy水平比較

病例組和對照組內(nèi)TT型Hcy水平分別高于本組CC型及CT型的Hcy水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.4 MTHFR C677T基因多態(tài)性與代謝指標(biāo)的數(shù)量性狀分析

以該基因位點作為自變量，將表1各指標(biāo)（SBP、DBP、FBG、LDL-C、HDL-C、TC、TG、葉酸、Hcy）依次作為因變量，分別分析各指標(biāo)與該基因多態(tài)性是否存在線性回歸。等位基因T（TT型+CT型）與葉酸（r=0.261，β=-1.188，t=-4.847，P<0.001）、Hcy（r=0.317，β=2.404，t=6.327，P<0.001）、FBG（r=0.106，β=0.435，t=1.985，P=0.048）存在線性回歸關(guān)系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與其他代謝指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具體如下：等位基因T（TT型+CT型）與DBP（r=0.062，β=1.755，t=1.108，P=0.269）、SBP（r=0.012，β=0.558，t=0.224，P=0.823）、HDL-C（r=0.027，β=0.025，t=0.513，P=0.608）、LDL-C（r=0.063，β=0.025，t=1.193，P=0.234）、TG（r=0.003，β=-0.002，t=-0.049，P=0.961）、TC（r=0.007，β=0.003，t=0.132，P=0.895）。

2.5 多因素Logistic回歸分析

以LAA腦梗死為因變量，以MTHFR C677T等位基因T及高血壓、糖尿病、高三酰甘油血癥、高膽固醇血癥、Hcy作為自變量進行Logistic回歸分析。MTHFR C677T等位基因T、高血壓、糖尿病、Hcy為LAA腦梗死的獨立危險因素，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

LAA腦梗死是多微效基因與多環(huán)境因素共同作用的復(fù)雜疾病。越來越多研究表明，危險因素與候選基因多態(tài)性的交互作用對復(fù)雜疾病的發(fā)生具有協(xié)同效應(yīng)。因此，研究可能的候選基因（如MTHFR C677T），控制可控危險因素如Hcy，有利于早期識別LAA腦梗死的高危人群，明確危險分層，減少該疾病的發(fā)病率。

薈萃分析發(fā)現(xiàn)[12]，在歐亞人群的各種遺傳模型中，該基因位點多態(tài)性均與LAA腦梗死有關(guān)，而上述相關(guān)性在非洲人群中差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Cotlarciuc等[13]發(fā)現(xiàn)，在歐洲人群中MTHFR C677T基因多態(tài)性與LAA腦梗死有關(guān)。因此，目前有關(guān)MTHFR C677T基因多態(tài)性與LAA腦梗死的相關(guān)性尚無定論，可能與MTHFR C677T的突變率存在地域、種族差異有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，病例組突變率為51.67%，對照組為38.33%，符合文獻報道中國人群的突變率范圍[14-15]。兩組間基因型和等位基因頻率分布比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），病例組TT基因型頻率高于對照組（P<0.05），病例組T等位基因頻率高于對照組（P<0.05）;Logistic回歸分析顯示，MTHFR C677T等位基因T是LAA腦梗死的獨立危險因素[OR（95%CI）=1.676（1.033， 2.718），P=0.036]，提示攜帶T等位基因者患LAA腦梗死是非T等位基因者的1.676倍。以上說明MTHFR C677T基因多態(tài)性是浙江地區(qū)漢族人群LAA腦梗死的重要遺傳危險因素。

本研究結(jié)果顯示，病例組和對照組內(nèi)TT型Hcy水平分別高于本組CC型及CT型的Hcy水平（P<0.05），且等位基因T與Hcy存在線性回歸關(guān)系，MTHFR C677T等位基因T與Hcy呈正相關(guān)，與文獻報道一致[14]。Logistic回歸分析顯示，HHcy是LAA腦梗死的獨立危險因素（P<0.05），與Mao等[16]的結(jié)論一致。由以上可知，MTHFR C677T基因多態(tài)性可能通過影響Hcy代謝從而間接地影響LAA腦梗死的發(fā)生。另外，本研究結(jié)果顯示，T等位基因與FBG存在線性回歸關(guān)系，與FBG呈正相關(guān)，Logistic回歸分析顯示，糖尿病是LAA腦梗死的獨立危險因素，提示MTHFR C677T多態(tài)性可能通過影響血糖間接影響LAA腦梗死發(fā)病。薈萃分析發(fā)現(xiàn)[2，17]，MTHFR C677T多態(tài)性與2型糖尿病有關(guān)，增加了2型糖尿病的遺傳易感性，2型糖尿病是LAA腦梗死的重要危險因素[18]，上述文獻與本研究結(jié)論一致。但該基因多態(tài)性影響血糖水平的確切機制未明，推測可能為：①2型糖尿病早期以胰島素抵抗為主，后期以胰島素分泌不足為主，MTHFR C677T與HHcy有關(guān)，Hcy影響胰島β細胞的細胞活力，降低其胰島素分泌功能，誘發(fā)胰島素抵抗[2，19-20];②MTHFR C677T能影響DNA甲基化，而DNA低甲基化與高血糖有關(guān)[14]。結(jié)合以上可推知，MTHFR C677T基因多態(tài)性可能通過影響Hcy、血糖等LAA腦梗死的中間表型，導(dǎo)致代謝紊亂綜合征，從而間接影響LAA腦梗死的發(fā)生。

綜上所述，MTHFR C677T基因多態(tài)性與浙江地區(qū)漢族人群LAA腦梗死發(fā)病有關(guān)，從遺傳學(xué)角度認為，等位基因T存在LAA腦梗死的遺傳易感性，但因LAA腦梗死是多環(huán)境因素與多遺傳因素共同作用的復(fù)雜疾病，MTHFR C677T等位基因T也可能通過與腦梗死的傳統(tǒng)危險因素（如Hcy、糖尿?。┑慕换プ饔糜绊懺摷膊〉陌l(fā)病風(fēng)險，可能成為LAA腦梗死發(fā)病的預(yù)測因素。在今后的研究中，應(yīng)在擴大樣本量的基礎(chǔ)上使用更精確的實驗方法和統(tǒng)計方法進行多中心的病例對照研究，分析MTHFR C677T多態(tài)性與環(huán)境因素聯(lián)合作用對LAA腦梗死發(fā)病的影響，以期有所突破，從遺傳流行病學(xué)的角度為LAA腦梗死提供遺傳學(xué)病因。

[參考文獻]

[1] Gungor L，Polat M，Ozberk MB，et al.Which ischemic stroke subtype is associated with hyperhomocysteinemia？[J].Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases：The official journal of National Stroke Association，2018，27（7）：1921-1929.

[2] Zhu B，Wu X，Zhi X，et al.Methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism and type 2 diabetes mellitus in Chinese population：A meta-analysis of 29 case-control studies[J].PLoS One，2014，9（7）：e102 443.

[3] Nash AJ，Mandaviya PR，Dib MJ，et al.Interaction between plasma homocysteine and the MTHFR c.677C>T polymorphism is associated with site-specific changes in DNA methylation in humans[J].FASEB journal：Official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology，2019，33（1）：833-843.

[4] 鄧麗，李平靜，張?zhí)K明，等.老年高血壓同型半胱氨酸、MTHFR基因多態(tài)性與腦動脈狹窄程度及認知功能的相關(guān)性研究[J].徐州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2019，39（6）：397-402.

[5] 中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會.中國各類主要腦血管病診斷要點2019[J].中華神經(jīng)科雜志，2019，52（9）：710-715.

[6] 李建平，盧新政，霍勇，等.H型高血壓診斷與治療專家共識[J].中國醫(yī)學(xué)前沿雜志（電子版），2016，8（5）：23-28.

[7] 中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會.中國2型糖尿病防治指南（2017年版）[J].中華糖尿病雜志， 2018，10（1）：4-67.

[8] 中國高血壓防治指南修訂委員會.中國高血壓防治指南（2018年修訂版）[J].中國心血管雜志，2019，24（1）：24-56.

[9] 中國成人血脂異常防治指南修訂聯(lián)合委員會.中國成人血脂異常防治指南（2016年修訂版）[J].中華全科醫(yī)師雜志，2017，16（1）：15-35.

[10] 中國成人血脂異常防治指南制訂聯(lián)合委員會.中國成人血脂異常防治指南[J].中華心血管病雜志，2007，35（5）：390-419.

[11] Frosst P，Blom HJ，Milos R，et al.A candidate genetic risk factor for vascular disease：A common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase[J].Nat Genet，1995，10（1）：111-113.

[12] Cui T.MTHFR C677T mutation increased the risk of ischemic stroke，especially in large-artery atherosclerosis in adults：An updated meta-analysis from 38 researches[J].Int J Neurosci，2016，126（1）：10-19.

[13] Cotlarciuc I，Malik R，Holliday EG，et al.Effect of genetic variants associated with plasma homocysteine levels on stroke risk[J].Stroke，2014，45（7）：1920-1924.

[14] Wang J，Xu L，Xia H，et al.Association of MTHFR C677T gene polymorphism with metabolic syndrome in a Chinese population：A case-control study[J].J Int Med Res，2018，46（7）：2658-2669.

[15] Xie C，Ping P，Ma Y，et al.Correlation between methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphism and oligoasthenospermia and the effects of folic acid supplementation on semen quality[J].Translational Andrology and Urology，2019，8（6）：678-685.

[16] Mao X，Han L. The relationship of methylenetetrahydrofolate reductase gene C677T polymorphism and ischemic stroke in Chinese Han Population[J]. Annals of Clinical and Laboratory Science，2018，48（2）：242-247.

[17] Meng Y，Liu X，Ma K，et al.Association of MTHFR C677T polymorphism and type 2 diabetes mellitus （T2DM） susceptibility[J].Molecular Genetics & Genomic Medicine，2019，7（12）：e1020.

[18] Harris S，Sungkar S，Rasyid A，et al.TOAST subtypes of ischemic stroke and its risk factors：A hospital-based study at cipto mangunkusumo hospital，indonesia[J].Stroke Research and Treatment，2018，2018：9589 831.

[19] Hemati T，Moghadami-Tabrizi N，Davari-Tanha F，et al.High plasma homocysteine and insulin resistance in patients with polycystic ovarian syndrome[J].Iran J Reprod Med，2011，9（3）：223-228.

[20] 張盼婷，張永莉.Hcy表達水平及MTHFR基因多態(tài)性與2型糖尿病腎病的相關(guān)性研究進展[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2019，57（15）：165-168.

（收稿日期：2019-03-20）