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    miR-103a-3p對肝細(xì)胞癌細(xì)胞遷移能力的影響及其作用機制

    2021-03-18 07:20:52
    精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)雜志 2021年1期
    關(guān)鍵詞:報告基因熒光素酶細(xì)胞系

    (青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系,山東 青島 266071)

    肝細(xì)胞癌(HCC)是臨床最常見的致死性惡性腫瘤[1-2],首選治療方法仍然以手術(shù)切除為主,但由于HCC具有侵襲性強、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移等特點,其術(shù)后高復(fù)發(fā)率嚴(yán)重影響患者預(yù)后[3-5]。近年來,HCC分子靶向藥物治療取得顯著進展,但是靶向藥物治療帶來的不良反應(yīng)也不容忽視,嚴(yán)重影響了患者的依從性和療效[6-8]。

    MicroRNAs(miRNAs)是一類由18~25個核苷酸組成的微小的非編碼單鏈RNA分子,能夠通過堿基配對在轉(zhuǎn)錄后水平上通過降解mRNA或者阻止mRNA翻譯來沉默mRNA,發(fā)揮其基因調(diào)控作用[9-10]。miR-103作為miRNAs家族中的一員,包括miR-103-1和miR-103-2兩種類型,miR-103a-3p是miR-103-1中常見的一種亞型。近年來研究發(fā)現(xiàn),miR-103在多種組織中呈異常表達,其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11]。在結(jié)直腸癌中,miR-103通過靶向死亡相關(guān)蛋白激酶(DAPK)和Krüppel樣因子4(KLF4)促進結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移,miR-103還可靶向下調(diào)E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)促進結(jié)直腸癌的侵襲[12]。在胃癌中,miR-103a-3p通過靶向轉(zhuǎn)錄激活因子7(ATF7)促進人胃癌細(xì)胞增殖[13]。提示miR-103可以作為潛在的生物標(biāo)志物用于癌癥的診斷和治療。

    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白166(TMEM166)基因,又稱作FAM176A或者EVA1A,是2007年鑒定出來的一種參與細(xì)胞自噬與凋亡的基因[14]。研究發(fā)現(xiàn),TMEM166在HCC中能夠被miR-125b靶向下調(diào),從而可以增加HCC細(xì)胞對化療藥物奧沙利鉑的敏感性[15],提示TMEM166在HCC中低表達可能是受到了miRNAs的靶向調(diào)控。但是miR-103a-3p對TMEM166是否存在靶向調(diào)節(jié)以及是否通過TMEM166調(diào)控HCC細(xì)胞的遷移,目前尚不清楚。本研究擬探討miR-103a-3p對HCC細(xì)胞遷移的影響及其作用機制,為進一步尋找HCC的診斷和治療靶點奠定實驗基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    人正常肝細(xì)胞L02、人HCC細(xì)胞系Hccl-M3與293T細(xì)胞來自于青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室。

    1.2試劑

    DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基(美國HyClone公司),青鏈霉素混合液(美國sigma公司)、RIPA蛋白提取試劑盒(中國賽默飛世爾科技有限公司),Trizol RNA提取試劑(日本TaKaRa公司),miR-103a-3p mimics、miR-103a-3p inhibitor以及其陰性對照NC(上海漢恒生物科技有限公司),Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司),兔抗人TMEM166多克隆抗體(英國Abcam公司),RT-PCR試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊公司),TMEM166引物(北京擎科新業(yè)生物公司)。

    1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

    將人正常肝細(xì)胞L02、HCC細(xì)胞系Hccl-M3接種于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)0.01青鏈霉素溶液的高糖DMEM培養(yǎng)基中,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi),培養(yǎng)至合適密度后用于后續(xù)處理。

    1.4 研究方法

    1.4.1實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測正常肝細(xì)胞L02和HCC細(xì)胞系Hccl-M3中miR-103a-3p mRNA表達水平 采用Trizol法提取常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以此為模板進行RT-qPCR。根據(jù)試劑盒說明書配制反應(yīng)體系,以U6作為內(nèi)參照,每個樣品設(shè)3個復(fù)孔。實驗重復(fù)3次。采用2-△△CT計算樣本中miR-103a-3p mRNA的相對表達水平。引物序列見表1。

    表1 RT-qPCR引物序列

    1.4.2Western blot方法檢測細(xì)胞中TMEM166蛋白的相對表達量 取對數(shù)生長期的Hccl-M3細(xì)胞,以每孔約5×105個細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中,待細(xì)胞融合度為40%左右,將細(xì)胞按照實驗要求分為A、B、C、D組,各組分別轉(zhuǎn)染mimics NC、miR-103a-3p mimics、inhibitor NC、miR-103a-3p inhibitor,轉(zhuǎn)染72 h后,棄掉培養(yǎng)基,用PBS洗滌2次,按照PMSF∶RIPA=1∶100的比例配置蛋白裂解液,提取總蛋白。用BCA蛋白試劑盒檢測蛋白濃度,加入5×蛋白上樣緩沖液后高溫加熱使蛋白變性。按照SDS-PAGE凝膠制備說明書配置150 g/L的分離膠及50 g/L的濃縮膠,電泳、轉(zhuǎn)膜,然后以50 g/L脫脂奶粉封閉2 h,一抗(1∶500)室溫孵育2.5 h,以β-actin作為內(nèi)參。TBST洗膜3次后,二抗室溫孵育1 h,重復(fù)上述洗膜步驟,顯影,使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,目的蛋白相對表達量以目的蛋白灰度值/內(nèi)參照蛋白灰度值計算,結(jié)果取3次重復(fù)實驗的均值。

    1.4.3雙熒光素酶報告基因活性的檢測與分析構(gòu)建TMEM166野生型3′-UTR(TMEM166-3UTR-wt)和突變型3′-UTR(TMEM166-3UTR-mu)熒光素酶報告基因質(zhì)粒,將293T細(xì)胞分為F、G、H以及I組,各組分別轉(zhuǎn)染mimics NC與TMEM166-3UTR-wt、miR-103a-3p mimics與TMEM166-3UTR-wt、mimics NC與TMEM166-3UTR-mu、miR-103a-3p mimics與TMEM166-3UTR-mu,轉(zhuǎn)染48 h后,棄掉培養(yǎng)基后,用PBS洗滌3次;向每個樣品孔中加入100 μL Passive Lysis Buffer,充分裂解細(xì)胞15 min,將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中,4 ℃下10 000 r/min離心15 min,取上清液;向96孔黑色酶標(biāo)板中每孔加入100 μL Luciferase Assay Reagent Ⅱ工作液,再向每孔加入20 μL細(xì)胞裂解液,吹打混勻后測定記錄Firefly luciferase值(內(nèi)參值);向每孔中加入100 μL 終止液,吹打混勻后檢測記錄Renilla luciferase值(報告基因發(fā)光值)。相對熒光素酶活性以報告基因發(fā)光值/內(nèi)參值表示。結(jié)果取3次重復(fù)實驗的均值。

    1.4.4細(xì)胞劃痕實驗檢測HCC細(xì)胞系Hccl-M3的遷移能力 取對數(shù)生長期的Hccl-M3細(xì)胞,以每孔約5×105個細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中,待細(xì)胞匯合度達到40%~60%時,將細(xì)胞按實驗要求分為A、B、C、D、E組,各組分別轉(zhuǎn)染mimics NC、miR-103a-3p mimics、inhibitor NC、miR-103a-3p inhibitor、miR-103a-3p mimics與TMEM166-Myc,轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照說明書操作。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度達到95%時進行劃痕,于劃痕后0、48 h在顯微鏡下觀察并拍照,應(yīng)用Image J軟件計算劃痕面積,結(jié)果取3次重復(fù)實驗的均值。

    1.4.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graphpad Prism 6.0進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組比較采用t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 正常肝細(xì)胞L02和HCC細(xì)胞系Hccl-M3中miR-103a-3p mRNA表達水平

    RT-qPCR檢測結(jié)果顯示,正常肝細(xì)胞L02和HCC細(xì)胞系Hccl-M3中miR-103a-3p mRNA平均相對表達量分別為1.08±0.12、5.07±0.27,兩者比較差異具有顯著性(t=13.49,P<0.05)。

    2.2 miR-103a-3p對Hccl-M3細(xì)胞TMEM166蛋白表達的影響

    Western blot結(jié)果顯示,A~D組Hccl-M3細(xì)胞中TMEM166蛋白的相對表達量分別為0.56±0.01、0.22±0.00、0.51±0.01、0.73±0.00,組間比較差異有顯著性(F=276.20,P<0.05);與A組相比,B組細(xì)胞中的TMEM166蛋白相對表達量明顯降低(t=22.33,P<0.05);與C組相比較,D組細(xì)胞中TMEM166蛋白相對表達量明顯升高(t=9.72,P<0.05)。見圖1。

    2.3 miR-103a-3p與TMEM166的結(jié)合位點預(yù)測

    通過starBase軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn),miR-103a-3p與TMEM166存在結(jié)合位點(圖2)。

    A、B、C、D分別對應(yīng)A、B、C、D組

    圖2 starBase軟件預(yù)測 miR-103a-3p與TMEM166-3′UTR的結(jié)合位點

    2.4 雙熒光素酶活性分析結(jié)果

    熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示,F(xiàn)~I組熒光素酶的活性分別為0.99±0.02、0.56±0.02、0.98±0.02、0.96±0.02,組間比較差異具有顯著性(F=122.90,P<0.05);與F組相比,G組熒光素酶活性明顯降低(t=23.17,P<0.05),說明突變成功,結(jié)合位點預(yù)測正確,TMEM166是miR-103a-3p的下游靶基因。

    2.5 miR-103a-3p表達對Hccl-M3細(xì)胞遷移能力的影響

    劃痕實驗結(jié)果表明,A~E組細(xì)胞遷移率分別為0.38±0.01、0.46±0.00、0.39±0.01、0.34±0.00、0.41±0.01,組間比較差異有顯著性(F=16.83,P<0.05);與A組相比,B組細(xì)胞的遷移能力明顯升高(t=4.13,P<0.05);與C組相比,D組細(xì)胞的遷移能力降低(t=4.33,P<0.05);與B組相比,E組細(xì)胞的遷移能力降低(t=4.91,P<0.05)。見圖3。

    A、B、C、D、E分別對應(yīng)A、B、C、D、E組

    3 討 論

    HCC是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的第3大原因[1]。目前HCC的治療很大程度上依賴于靶向治療,它能夠特異地作用于腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用的靶分子及其調(diào)控的信號通路達到治療腫瘤的目的[16-17]。近年來隨著對HCC致病機制的深入研究發(fā)現(xiàn),microRNA在HCC組織中表達異常,廣泛參與HCC的發(fā)生發(fā)展過程,對HCC增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移有重要的調(diào)節(jié)作用,成為HCC診斷、治療以及患者預(yù)后的重要靶點[18-20]。目前,HCC的發(fā)生發(fā)展機制尚不完全清楚,因此,探索其發(fā)生發(fā)展的分子機制對于尋求HCC診斷、治療的新靶點極為重要。

    miR-103與人類多種惡性腫瘤密切相關(guān),其在多種組織中表達異常發(fā)揮抑癌或促癌作用。在非小細(xì)胞肺癌中,miR-103通過直接靶向程序性細(xì)胞死亡因子10(PDCD10)發(fā)揮抑癌作用[21];在神經(jīng)母細(xì)胞瘤、胃癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和膀胱癌中,miR-103通過靶向調(diào)控特定的基因發(fā)揮促癌作用[22-26]。在本研究中,首先鑒定了miR-103在HCC中的表達情況,再進一步研究其對HCC細(xì)胞遷移能力的影響。RT-qPCR結(jié)果顯示,HCC細(xì)胞系Hccl-M3中miR-103a-3p mRNA水平顯著高于正常肝細(xì)胞L02。細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示,上調(diào)miR-103a-3p表達后,Hccl-M3細(xì)胞遷移能力明顯提高,說明miR-103a-3p表達可促進人HCC細(xì)胞遷移。為了探討miR-103a-3p調(diào)控細(xì)胞遷移的分子機制,本研究采用軟件預(yù)測并通過雙熒光素酶實驗證實,TMEM166是miR-103a-3p的下游靶基因,進一步通過共表達miR-103a-3p和TMEM166,發(fā)現(xiàn)TMEM166的表達能夠顯著減弱miR-103a-3p對HCC細(xì)胞的促遷移作用,表明miR-103a-3p促進HCC細(xì)胞遷移可能是通過靶向下調(diào)TMEM166的表達實現(xiàn)的。

    TMEM166是位于人2號染色體短臂12區(qū)的一種新型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體相關(guān)蛋白。研究發(fā)現(xiàn),與正常組織相比,TMEM16在肝癌、胰腺腫瘤、食管鱗狀細(xì)胞癌等人類腫瘤組織中顯著下調(diào)[27-29],提示其可能參與了這些腫瘤的發(fā)生或發(fā)展。研究表明,過表達TMEM166能夠通過誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤SHG44等的凋亡來抑制腫瘤細(xì)胞增殖[30-31]。最新一項研究表明,TMEM166能夠通過上調(diào)TP53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制肝癌細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖[27]。另有研究發(fā)現(xiàn),TMEM166能夠被miR-125b靶向下調(diào)從而可以增加HCC細(xì)胞的化療敏感性[15],提示在肝癌中,TMEM166的下調(diào)可能受某些miRNAs調(diào)控。本研究通過雙熒光素酶報告基因方法證明了miR-103a-3p對于TMEM166存在靶向調(diào)控作用。并采用Western blot方法檢測miR-103a-3p對于TMEM166表達的影響,結(jié)果表明,過表達miR-103a-3p能夠下調(diào)TMEM166蛋白的表達,驗證了miR-103a-3p對TMEM166的靶向調(diào)控作用。目前關(guān)于miR-103a-3p以及TMEM166在HCC中的研究較少,本研究通過雙熒光素酶報告基因的方法,首次驗證了miR-103a-3p與TMEM166的靶向調(diào)控關(guān)系,并且初步證實miR-103a-3p可以通過抑制TMEM166基因的表達促進HCC細(xì)胞遷移。

    上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)對腫瘤進展過程中細(xì)胞遷移至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn),在口腔鱗狀細(xì)胞癌中,miR-103通過靶向調(diào)控婆羅雙樹樣基因4(SALL4)的表達調(diào)控EMT[32]。在HCC中,miR-103是否通過靶向TMEM166參與EMT的調(diào)控還有待進一步研究證實。XIA等[33]研究顯示,miR-103能夠通過靶向A型激酶錨定蛋白12(AKAP12)促進HCC細(xì)胞的生長,但具體的作用機制以及該靶向調(diào)控是否與促進HCC細(xì)胞遷移有關(guān)尚不清楚。以上分析表明,除TMEM166以外,miR-103還可能通過其他靶標(biāo)促進HCC細(xì)胞的遷移,因此,miR-103對HCC進展的確切機制還需要進一步研究。此外目前還有研究發(fā)現(xiàn),在三陰性乳腺癌中,長鏈非編碼RNA MIR503HG通過調(diào)控miR-103/OLFM4的表達調(diào)控細(xì)胞遷移和侵襲[34],HCC中是否也存在長鏈非編碼RNA對miR-103調(diào)控,也有待于進一步研究。

    綜上所述,本研究首次證實了miR-103a-3p通過對TMEM166基因的靶向調(diào)控作用來促進HCC細(xì)胞遷移。但miR-103a-3p靶向調(diào)控TMEM166基因發(fā)揮促癌作用的具體機制還需要進一步研究,以進一步揭示HCC可能的發(fā)生發(fā)展機制,為HCC診斷以及治療新靶點的選擇提供理論支持。

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