• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miR-103a-3p對肝細(xì)胞癌細(xì)胞遷移能力的影響及其作用機制

    2021-03-18 07:20:52
    精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)雜志 2021年1期
    關(guān)鍵詞:報告基因熒光素酶細(xì)胞系

    (青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系,山東 青島 266071)

    肝細(xì)胞癌(HCC)是臨床最常見的致死性惡性腫瘤[1-2],首選治療方法仍然以手術(shù)切除為主,但由于HCC具有侵襲性強、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移等特點,其術(shù)后高復(fù)發(fā)率嚴(yán)重影響患者預(yù)后[3-5]。近年來,HCC分子靶向藥物治療取得顯著進展,但是靶向藥物治療帶來的不良反應(yīng)也不容忽視,嚴(yán)重影響了患者的依從性和療效[6-8]。

    MicroRNAs(miRNAs)是一類由18~25個核苷酸組成的微小的非編碼單鏈RNA分子,能夠通過堿基配對在轉(zhuǎn)錄后水平上通過降解mRNA或者阻止mRNA翻譯來沉默mRNA,發(fā)揮其基因調(diào)控作用[9-10]。miR-103作為miRNAs家族中的一員,包括miR-103-1和miR-103-2兩種類型,miR-103a-3p是miR-103-1中常見的一種亞型。近年來研究發(fā)現(xiàn),miR-103在多種組織中呈異常表達,其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11]。在結(jié)直腸癌中,miR-103通過靶向死亡相關(guān)蛋白激酶(DAPK)和Krüppel樣因子4(KLF4)促進結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移,miR-103還可靶向下調(diào)E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)促進結(jié)直腸癌的侵襲[12]。在胃癌中,miR-103a-3p通過靶向轉(zhuǎn)錄激活因子7(ATF7)促進人胃癌細(xì)胞增殖[13]。提示miR-103可以作為潛在的生物標(biāo)志物用于癌癥的診斷和治療。

    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白166(TMEM166)基因,又稱作FAM176A或者EVA1A,是2007年鑒定出來的一種參與細(xì)胞自噬與凋亡的基因[14]。研究發(fā)現(xiàn),TMEM166在HCC中能夠被miR-125b靶向下調(diào),從而可以增加HCC細(xì)胞對化療藥物奧沙利鉑的敏感性[15],提示TMEM166在HCC中低表達可能是受到了miRNAs的靶向調(diào)控。但是miR-103a-3p對TMEM166是否存在靶向調(diào)節(jié)以及是否通過TMEM166調(diào)控HCC細(xì)胞的遷移,目前尚不清楚。本研究擬探討miR-103a-3p對HCC細(xì)胞遷移的影響及其作用機制,為進一步尋找HCC的診斷和治療靶點奠定實驗基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    人正常肝細(xì)胞L02、人HCC細(xì)胞系Hccl-M3與293T細(xì)胞來自于青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室。

    1.2試劑

    DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基(美國HyClone公司),青鏈霉素混合液(美國sigma公司)、RIPA蛋白提取試劑盒(中國賽默飛世爾科技有限公司),Trizol RNA提取試劑(日本TaKaRa公司),miR-103a-3p mimics、miR-103a-3p inhibitor以及其陰性對照NC(上海漢恒生物科技有限公司),Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司),兔抗人TMEM166多克隆抗體(英國Abcam公司),RT-PCR試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊公司),TMEM166引物(北京擎科新業(yè)生物公司)。

    1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

    將人正常肝細(xì)胞L02、HCC細(xì)胞系Hccl-M3接種于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)0.01青鏈霉素溶液的高糖DMEM培養(yǎng)基中,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi),培養(yǎng)至合適密度后用于后續(xù)處理。

    1.4 研究方法

    1.4.1實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測正常肝細(xì)胞L02和HCC細(xì)胞系Hccl-M3中miR-103a-3p mRNA表達水平 采用Trizol法提取常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以此為模板進行RT-qPCR。根據(jù)試劑盒說明書配制反應(yīng)體系,以U6作為內(nèi)參照,每個樣品設(shè)3個復(fù)孔。實驗重復(fù)3次。采用2-△△CT計算樣本中miR-103a-3p mRNA的相對表達水平。引物序列見表1。

    表1 RT-qPCR引物序列

    1.4.2Western blot方法檢測細(xì)胞中TMEM166蛋白的相對表達量 取對數(shù)生長期的Hccl-M3細(xì)胞,以每孔約5×105個細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中,待細(xì)胞融合度為40%左右,將細(xì)胞按照實驗要求分為A、B、C、D組,各組分別轉(zhuǎn)染mimics NC、miR-103a-3p mimics、inhibitor NC、miR-103a-3p inhibitor,轉(zhuǎn)染72 h后,棄掉培養(yǎng)基,用PBS洗滌2次,按照PMSF∶RIPA=1∶100的比例配置蛋白裂解液,提取總蛋白。用BCA蛋白試劑盒檢測蛋白濃度,加入5×蛋白上樣緩沖液后高溫加熱使蛋白變性。按照SDS-PAGE凝膠制備說明書配置150 g/L的分離膠及50 g/L的濃縮膠,電泳、轉(zhuǎn)膜,然后以50 g/L脫脂奶粉封閉2 h,一抗(1∶500)室溫孵育2.5 h,以β-actin作為內(nèi)參。TBST洗膜3次后,二抗室溫孵育1 h,重復(fù)上述洗膜步驟,顯影,使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,目的蛋白相對表達量以目的蛋白灰度值/內(nèi)參照蛋白灰度值計算,結(jié)果取3次重復(fù)實驗的均值。

    1.4.3雙熒光素酶報告基因活性的檢測與分析構(gòu)建TMEM166野生型3′-UTR(TMEM166-3UTR-wt)和突變型3′-UTR(TMEM166-3UTR-mu)熒光素酶報告基因質(zhì)粒,將293T細(xì)胞分為F、G、H以及I組,各組分別轉(zhuǎn)染mimics NC與TMEM166-3UTR-wt、miR-103a-3p mimics與TMEM166-3UTR-wt、mimics NC與TMEM166-3UTR-mu、miR-103a-3p mimics與TMEM166-3UTR-mu,轉(zhuǎn)染48 h后,棄掉培養(yǎng)基后,用PBS洗滌3次;向每個樣品孔中加入100 μL Passive Lysis Buffer,充分裂解細(xì)胞15 min,將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中,4 ℃下10 000 r/min離心15 min,取上清液;向96孔黑色酶標(biāo)板中每孔加入100 μL Luciferase Assay Reagent Ⅱ工作液,再向每孔加入20 μL細(xì)胞裂解液,吹打混勻后測定記錄Firefly luciferase值(內(nèi)參值);向每孔中加入100 μL 終止液,吹打混勻后檢測記錄Renilla luciferase值(報告基因發(fā)光值)。相對熒光素酶活性以報告基因發(fā)光值/內(nèi)參值表示。結(jié)果取3次重復(fù)實驗的均值。

    1.4.4細(xì)胞劃痕實驗檢測HCC細(xì)胞系Hccl-M3的遷移能力 取對數(shù)生長期的Hccl-M3細(xì)胞,以每孔約5×105個細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中,待細(xì)胞匯合度達到40%~60%時,將細(xì)胞按實驗要求分為A、B、C、D、E組,各組分別轉(zhuǎn)染mimics NC、miR-103a-3p mimics、inhibitor NC、miR-103a-3p inhibitor、miR-103a-3p mimics與TMEM166-Myc,轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照說明書操作。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度達到95%時進行劃痕,于劃痕后0、48 h在顯微鏡下觀察并拍照,應(yīng)用Image J軟件計算劃痕面積,結(jié)果取3次重復(fù)實驗的均值。

    1.4.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graphpad Prism 6.0進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組比較采用t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 正常肝細(xì)胞L02和HCC細(xì)胞系Hccl-M3中miR-103a-3p mRNA表達水平

    RT-qPCR檢測結(jié)果顯示,正常肝細(xì)胞L02和HCC細(xì)胞系Hccl-M3中miR-103a-3p mRNA平均相對表達量分別為1.08±0.12、5.07±0.27,兩者比較差異具有顯著性(t=13.49,P<0.05)。

    2.2 miR-103a-3p對Hccl-M3細(xì)胞TMEM166蛋白表達的影響

    Western blot結(jié)果顯示,A~D組Hccl-M3細(xì)胞中TMEM166蛋白的相對表達量分別為0.56±0.01、0.22±0.00、0.51±0.01、0.73±0.00,組間比較差異有顯著性(F=276.20,P<0.05);與A組相比,B組細(xì)胞中的TMEM166蛋白相對表達量明顯降低(t=22.33,P<0.05);與C組相比較,D組細(xì)胞中TMEM166蛋白相對表達量明顯升高(t=9.72,P<0.05)。見圖1。

    2.3 miR-103a-3p與TMEM166的結(jié)合位點預(yù)測

    通過starBase軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn),miR-103a-3p與TMEM166存在結(jié)合位點(圖2)。

    A、B、C、D分別對應(yīng)A、B、C、D組

    圖2 starBase軟件預(yù)測 miR-103a-3p與TMEM166-3′UTR的結(jié)合位點

    2.4 雙熒光素酶活性分析結(jié)果

    熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示,F(xiàn)~I組熒光素酶的活性分別為0.99±0.02、0.56±0.02、0.98±0.02、0.96±0.02,組間比較差異具有顯著性(F=122.90,P<0.05);與F組相比,G組熒光素酶活性明顯降低(t=23.17,P<0.05),說明突變成功,結(jié)合位點預(yù)測正確,TMEM166是miR-103a-3p的下游靶基因。

    2.5 miR-103a-3p表達對Hccl-M3細(xì)胞遷移能力的影響

    劃痕實驗結(jié)果表明,A~E組細(xì)胞遷移率分別為0.38±0.01、0.46±0.00、0.39±0.01、0.34±0.00、0.41±0.01,組間比較差異有顯著性(F=16.83,P<0.05);與A組相比,B組細(xì)胞的遷移能力明顯升高(t=4.13,P<0.05);與C組相比,D組細(xì)胞的遷移能力降低(t=4.33,P<0.05);與B組相比,E組細(xì)胞的遷移能力降低(t=4.91,P<0.05)。見圖3。

    A、B、C、D、E分別對應(yīng)A、B、C、D、E組

    3 討 論

    HCC是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的第3大原因[1]。目前HCC的治療很大程度上依賴于靶向治療,它能夠特異地作用于腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用的靶分子及其調(diào)控的信號通路達到治療腫瘤的目的[16-17]。近年來隨著對HCC致病機制的深入研究發(fā)現(xiàn),microRNA在HCC組織中表達異常,廣泛參與HCC的發(fā)生發(fā)展過程,對HCC增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移有重要的調(diào)節(jié)作用,成為HCC診斷、治療以及患者預(yù)后的重要靶點[18-20]。目前,HCC的發(fā)生發(fā)展機制尚不完全清楚,因此,探索其發(fā)生發(fā)展的分子機制對于尋求HCC診斷、治療的新靶點極為重要。

    miR-103與人類多種惡性腫瘤密切相關(guān),其在多種組織中表達異常發(fā)揮抑癌或促癌作用。在非小細(xì)胞肺癌中,miR-103通過直接靶向程序性細(xì)胞死亡因子10(PDCD10)發(fā)揮抑癌作用[21];在神經(jīng)母細(xì)胞瘤、胃癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和膀胱癌中,miR-103通過靶向調(diào)控特定的基因發(fā)揮促癌作用[22-26]。在本研究中,首先鑒定了miR-103在HCC中的表達情況,再進一步研究其對HCC細(xì)胞遷移能力的影響。RT-qPCR結(jié)果顯示,HCC細(xì)胞系Hccl-M3中miR-103a-3p mRNA水平顯著高于正常肝細(xì)胞L02。細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示,上調(diào)miR-103a-3p表達后,Hccl-M3細(xì)胞遷移能力明顯提高,說明miR-103a-3p表達可促進人HCC細(xì)胞遷移。為了探討miR-103a-3p調(diào)控細(xì)胞遷移的分子機制,本研究采用軟件預(yù)測并通過雙熒光素酶實驗證實,TMEM166是miR-103a-3p的下游靶基因,進一步通過共表達miR-103a-3p和TMEM166,發(fā)現(xiàn)TMEM166的表達能夠顯著減弱miR-103a-3p對HCC細(xì)胞的促遷移作用,表明miR-103a-3p促進HCC細(xì)胞遷移可能是通過靶向下調(diào)TMEM166的表達實現(xiàn)的。

    TMEM166是位于人2號染色體短臂12區(qū)的一種新型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體相關(guān)蛋白。研究發(fā)現(xiàn),與正常組織相比,TMEM16在肝癌、胰腺腫瘤、食管鱗狀細(xì)胞癌等人類腫瘤組織中顯著下調(diào)[27-29],提示其可能參與了這些腫瘤的發(fā)生或發(fā)展。研究表明,過表達TMEM166能夠通過誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤SHG44等的凋亡來抑制腫瘤細(xì)胞增殖[30-31]。最新一項研究表明,TMEM166能夠通過上調(diào)TP53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制肝癌細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖[27]。另有研究發(fā)現(xiàn),TMEM166能夠被miR-125b靶向下調(diào)從而可以增加HCC細(xì)胞的化療敏感性[15],提示在肝癌中,TMEM166的下調(diào)可能受某些miRNAs調(diào)控。本研究通過雙熒光素酶報告基因方法證明了miR-103a-3p對于TMEM166存在靶向調(diào)控作用。并采用Western blot方法檢測miR-103a-3p對于TMEM166表達的影響,結(jié)果表明,過表達miR-103a-3p能夠下調(diào)TMEM166蛋白的表達,驗證了miR-103a-3p對TMEM166的靶向調(diào)控作用。目前關(guān)于miR-103a-3p以及TMEM166在HCC中的研究較少,本研究通過雙熒光素酶報告基因的方法,首次驗證了miR-103a-3p與TMEM166的靶向調(diào)控關(guān)系,并且初步證實miR-103a-3p可以通過抑制TMEM166基因的表達促進HCC細(xì)胞遷移。

    上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)對腫瘤進展過程中細(xì)胞遷移至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn),在口腔鱗狀細(xì)胞癌中,miR-103通過靶向調(diào)控婆羅雙樹樣基因4(SALL4)的表達調(diào)控EMT[32]。在HCC中,miR-103是否通過靶向TMEM166參與EMT的調(diào)控還有待進一步研究證實。XIA等[33]研究顯示,miR-103能夠通過靶向A型激酶錨定蛋白12(AKAP12)促進HCC細(xì)胞的生長,但具體的作用機制以及該靶向調(diào)控是否與促進HCC細(xì)胞遷移有關(guān)尚不清楚。以上分析表明,除TMEM166以外,miR-103還可能通過其他靶標(biāo)促進HCC細(xì)胞的遷移,因此,miR-103對HCC進展的確切機制還需要進一步研究。此外目前還有研究發(fā)現(xiàn),在三陰性乳腺癌中,長鏈非編碼RNA MIR503HG通過調(diào)控miR-103/OLFM4的表達調(diào)控細(xì)胞遷移和侵襲[34],HCC中是否也存在長鏈非編碼RNA對miR-103調(diào)控,也有待于進一步研究。

    綜上所述,本研究首次證實了miR-103a-3p通過對TMEM166基因的靶向調(diào)控作用來促進HCC細(xì)胞遷移。但miR-103a-3p靶向調(diào)控TMEM166基因發(fā)揮促癌作用的具體機制還需要進一步研究,以進一步揭示HCC可能的發(fā)生發(fā)展機制,為HCC診斷以及治療新靶點的選擇提供理論支持。

    猜你喜歡
    報告基因熒光素酶細(xì)胞系
    日本落葉松內(nèi)源GUS基因鑒定及其酶活性分析
    NNMT基因啟動子雙熒光素酶報告系統(tǒng)的構(gòu)建及其與SND1靶向關(guān)系的驗證
    不同雙熒光素酶方法對檢測胃癌相關(guān)miRNAs靶向基因TIAM1的影響
    重組雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron構(gòu)建轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染細(xì)胞螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶表達
    STAT3對人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系增殖與凋亡的影響
    啟動子陷阱技術(shù)在植物啟動子克隆研究中的應(yīng)用
    抑制miR-31表達對胰腺癌Panc-1細(xì)胞系遷移和侵襲的影響及可能機制
    報告基因標(biāo)記在干細(xì)胞治療急性心肌梗死中的應(yīng)用進展
    人多巴胺D2基因啟動子區(qū)—350A/G多態(tài)位點熒光素酶表達載體的構(gòu)建與鑒定及活性檢測
    E3泛素連接酶對卵巢癌細(xì)胞系SKOV3/DDP順鉑耐藥性的影響
    麻豆一二三区av精品| 亚洲成人精品中文字幕电影| 熟女电影av网| 亚洲国产精品合色在线| 国产精品电影一区二区三区| 欧美极品一区二区三区四区| 婷婷丁香在线五月| 国产美女午夜福利| 欧美成狂野欧美在线观看| 中国美女看黄片| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 露出奶头的视频| 国产一区在线观看成人免费| 国产99白浆流出| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 激情在线观看视频在线高清| 白带黄色成豆腐渣| 网址你懂的国产日韩在线| 日韩国内少妇激情av| 欧美乱码精品一区二区三区| 日本与韩国留学比较| 精品国产亚洲在线| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产99白浆流出| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国内精品美女久久久久久| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲av五月六月丁香网| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产精品一区二区精品视频观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 怎么达到女性高潮| 九色国产91popny在线| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲成人久久爱视频| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲欧美日韩高清专用| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 成人性生交大片免费视频hd| 国产成人av教育| 亚洲一区高清亚洲精品| 女人被狂操c到高潮| 日本黄色片子视频| 99久久综合精品五月天人人| 国产成人欧美在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 女人被狂操c到高潮| 精品久久蜜臀av无| 国产精品亚洲av一区麻豆| 欧美一级毛片孕妇| 午夜激情福利司机影院| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲国产色片| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲欧美激情综合另类| 精品一区二区三区四区五区乱码| xxxwww97欧美| 两人在一起打扑克的视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 欧美黄色淫秽网站| 久久草成人影院| 亚洲男人的天堂狠狠| 夜夜夜夜夜久久久久| bbb黄色大片| e午夜精品久久久久久久| 性欧美人与动物交配| 99热这里只有精品一区 | 校园春色视频在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 制服人妻中文乱码| www.熟女人妻精品国产| 最新美女视频免费是黄的| 成人欧美大片| 少妇熟女aⅴ在线视频| 黄色日韩在线| 日韩中文字幕欧美一区二区| av在线蜜桃| 久久久久亚洲av毛片大全| 亚洲国产精品999在线| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲成人中文字幕在线播放| 精品国产三级普通话版| 香蕉av资源在线| 久久香蕉国产精品| 午夜亚洲福利在线播放| 99riav亚洲国产免费| 舔av片在线| 国产高清视频在线观看网站| 久久久久久大精品| 国产精品久久久人人做人人爽| 波多野结衣高清无吗| 悠悠久久av| 男人舔奶头视频| 一区福利在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 99国产综合亚洲精品| 毛片女人毛片| 久久久久国产一级毛片高清牌| 久久人妻av系列| 99国产精品一区二区三区| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲专区中文字幕在线| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 免费av毛片视频| 国产一区二区激情短视频| 欧美激情在线99| 成人无遮挡网站| 久99久视频精品免费| 成年免费大片在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产午夜精品论理片| 国产一区二区三区视频了| www日本黄色视频网| 男女床上黄色一级片免费看| 黄色视频,在线免费观看| 午夜福利在线观看吧| 午夜激情福利司机影院| 亚洲欧美精品综合久久99| 99精品在免费线老司机午夜| 国产毛片a区久久久久| 亚洲国产欧美网| 99久久精品一区二区三区| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产高潮美女av| 免费在线观看影片大全网站| 午夜福利在线在线| 精品国产三级普通话版| 亚洲av免费在线观看| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 成人午夜高清在线视频| 午夜免费激情av| 精品久久蜜臀av无| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 亚洲成av人片免费观看| 精品日产1卡2卡| 国产精品一区二区免费欧美| 香蕉久久夜色| 老汉色∧v一级毛片| 最新中文字幕久久久久 | 最近在线观看免费完整版| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲人成网站高清观看| 超碰成人久久| 亚洲成人久久性| 成人三级黄色视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 最近视频中文字幕2019在线8| 一本久久中文字幕| 午夜激情福利司机影院| 亚洲第一电影网av| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 成人国产综合亚洲| 欧美又色又爽又黄视频| 天堂动漫精品| 亚洲七黄色美女视频| 1024手机看黄色片| 欧美另类亚洲清纯唯美| 韩国av一区二区三区四区| 九九在线视频观看精品| 香蕉av资源在线| 精品久久久久久久末码| 夜夜夜夜夜久久久久| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 757午夜福利合集在线观看| 我的老师免费观看完整版| 美女免费视频网站| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 99riav亚洲国产免费| 国产麻豆成人av免费视频| av黄色大香蕉| netflix在线观看网站| 免费av不卡在线播放| 国产高潮美女av| 一区福利在线观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲国产精品成人综合色| 免费观看的影片在线观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 一级毛片女人18水好多| 色老头精品视频在线观看| 日韩免费av在线播放| 免费av毛片视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 久久久久性生活片| 精品一区二区三区av网在线观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 身体一侧抽搐| 香蕉av资源在线| 欧美成人性av电影在线观看| 成人av在线播放网站| 亚洲天堂国产精品一区在线| 免费看光身美女| 91字幕亚洲| www.999成人在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 女人被狂操c到高潮| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 精品不卡国产一区二区三区| 精华霜和精华液先用哪个| av在线天堂中文字幕| 热99re8久久精品国产| 国产成人av激情在线播放| 在线a可以看的网站| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | e午夜精品久久久久久久| 成人欧美大片| 午夜视频精品福利| 床上黄色一级片| 国产亚洲av嫩草精品影院| www.熟女人妻精品国产| 曰老女人黄片| 国产三级在线视频| 国产黄色小视频在线观看| aaaaa片日本免费| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲av电影在线进入| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 日本在线视频免费播放| 日韩国内少妇激情av| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产三级黄色录像| 99精品久久久久人妻精品| 一本精品99久久精品77| 小说图片视频综合网站| 国产精品av视频在线免费观看| 成人午夜高清在线视频| 国产精品永久免费网站| 一二三四在线观看免费中文在| 岛国视频午夜一区免费看| a在线观看视频网站| 午夜成年电影在线免费观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 日韩人妻高清精品专区| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲第一电影网av| 黄色成人免费大全| 日本 av在线| 母亲3免费完整高清在线观看| 婷婷丁香在线五月| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产av在哪里看| 久久中文字幕人妻熟女| x7x7x7水蜜桃| 亚洲成av人片在线播放无| 国产男靠女视频免费网站| 久久久久久大精品| 国模一区二区三区四区视频 | 日本五十路高清| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 最近在线观看免费完整版| 最新美女视频免费是黄的| 麻豆成人av在线观看| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲精品久久国产高清桃花| www.精华液| 日韩精品中文字幕看吧| 少妇丰满av| cao死你这个sao货| www国产在线视频色| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 午夜影院日韩av| 制服丝袜大香蕉在线| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲一区二区三区不卡视频| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久中文字幕人妻熟女| 国产69精品久久久久777片 | 99国产综合亚洲精品| 国产单亲对白刺激| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 色噜噜av男人的天堂激情| 中亚洲国语对白在线视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产视频一区二区在线看| 在线免费观看的www视频| 岛国视频午夜一区免费看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 男人的好看免费观看在线视频| 国产高清三级在线| 欧美日韩黄片免| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 欧美色欧美亚洲另类二区| 日本熟妇午夜| 国产不卡一卡二| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产精品永久免费网站| 99视频精品全部免费 在线 | 国产成人av教育| 搡老熟女国产l中国老女人| 美女大奶头视频| 免费搜索国产男女视频| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲中文字幕日韩| 国产欧美日韩精品亚洲av| 三级毛片av免费| 亚洲专区字幕在线| 少妇丰满av| 桃红色精品国产亚洲av| 日韩大尺度精品在线看网址| www.自偷自拍.com| 综合色av麻豆| 国产成人欧美在线观看| 国产毛片a区久久久久| 久久精品国产清高在天天线| 男插女下体视频免费在线播放| 怎么达到女性高潮| 日韩人妻高清精品专区| av在线天堂中文字幕| 亚洲国产中文字幕在线视频| 午夜两性在线视频| 99精品欧美一区二区三区四区| bbb黄色大片| 天天一区二区日本电影三级| 午夜免费观看网址| 最近在线观看免费完整版| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久久国产欧美日韩av| 免费搜索国产男女视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 两个人的视频大全免费| 九九热线精品视视频播放| 少妇的丰满在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 九色成人免费人妻av| 老司机午夜十八禁免费视频| 日本熟妇午夜| 久久久成人免费电影| 美女cb高潮喷水在线观看 | 99久久精品热视频| 欧美日韩一级在线毛片| 中文字幕高清在线视频| 日韩欧美精品v在线| 嫩草影院入口| 免费在线观看日本一区| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久久久久大精品| 狂野欧美激情性xxxx| av福利片在线观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产日本99.免费观看| 成人国产综合亚洲| 欧美黄色片欧美黄色片| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久精品国产综合久久久| avwww免费| 久久午夜亚洲精品久久| 99久久99久久久精品蜜桃| 日本 av在线| 欧美乱妇无乱码| 久久久精品大字幕| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲av熟女| 高潮久久久久久久久久久不卡| 此物有八面人人有两片| 一夜夜www| 国产高清三级在线| 婷婷精品国产亚洲av在线| 母亲3免费完整高清在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 男女午夜视频在线观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产伦精品一区二区三区四那| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 最近在线观看免费完整版| 一本综合久久免费| 欧美在线黄色| 久久午夜亚洲精品久久| 特级一级黄色大片| 十八禁网站免费在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 99视频精品全部免费 在线 | 精品国产乱子伦一区二区三区| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产淫片久久久久久久久 | 久久久水蜜桃国产精品网| 欧美黄色淫秽网站| 身体一侧抽搐| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 免费在线观看日本一区| 国产精品久久久av美女十八| 午夜福利在线观看吧| 看黄色毛片网站| 精品国产三级普通话版| 久9热在线精品视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 波多野结衣高清作品| 特大巨黑吊av在线直播| 不卡一级毛片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 99国产精品99久久久久| 国产免费av片在线观看野外av| 热99re8久久精品国产| 国产精品98久久久久久宅男小说| 日韩三级视频一区二区三区| 特大巨黑吊av在线直播| 午夜福利高清视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 日韩有码中文字幕| 免费无遮挡裸体视频| 色综合站精品国产| 欧美大码av| 色在线成人网| 久久久久九九精品影院| 国产伦在线观看视频一区| 欧美黄色片欧美黄色片| 免费看日本二区| 国产高清视频在线播放一区| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲av片天天在线观看| 国产成年人精品一区二区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 97碰自拍视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲av免费在线观看| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲 国产 在线| 又大又爽又粗| 99国产精品一区二区三区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久久久精品国产欧美久久久| 免费看a级黄色片| 午夜精品在线福利| 小说图片视频综合网站| 国产黄色小视频在线观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 在线看三级毛片| 亚洲国产高清在线一区二区三| 免费观看人在逋| 美女被艹到高潮喷水动态| 少妇丰满av| 精品一区二区三区四区五区乱码| 熟女电影av网| 亚洲av第一区精品v没综合| 成人精品一区二区免费| 国产精品,欧美在线| 亚洲av电影不卡..在线观看| 日韩人妻高清精品专区| 男插女下体视频免费在线播放| 日韩国内少妇激情av| 舔av片在线| 黑人欧美特级aaaaaa片| 成人三级黄色视频| 亚洲精华国产精华精| 怎么达到女性高潮| 国产一区在线观看成人免费| 免费一级毛片在线播放高清视频| 日日夜夜操网爽| 欧美午夜高清在线| 免费看日本二区| 神马国产精品三级电影在线观看| 日韩高清综合在线| 老司机在亚洲福利影院| 日本免费a在线| 久久久久久久久中文| 欧美黄色片欧美黄色片| 在线观看午夜福利视频| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| or卡值多少钱| 99热精品在线国产| 岛国视频午夜一区免费看| 91麻豆av在线| 村上凉子中文字幕在线| 操出白浆在线播放| 久久精品91蜜桃| 亚洲五月天丁香| 欧美精品啪啪一区二区三区| 精品久久久久久久毛片微露脸| 最新美女视频免费是黄的| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 12—13女人毛片做爰片一| a在线观看视频网站| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲中文日韩欧美视频| 免费高清视频大片| 99热这里只有是精品50| 国产欧美日韩一区二区三| www国产在线视频色| 97碰自拍视频| 操出白浆在线播放| 我的老师免费观看完整版| 十八禁人妻一区二区| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲av熟女| 免费看光身美女| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 日本免费一区二区三区高清不卡| 两性夫妻黄色片| 精品国产亚洲在线| 日本 欧美在线| 欧美激情久久久久久爽电影| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 淫妇啪啪啪对白视频| www日本黄色视频网| 久久性视频一级片| 亚洲国产欧美网| 2021天堂中文幕一二区在线观| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 男女下面进入的视频免费午夜| 老司机午夜十八禁免费视频| 少妇的逼水好多| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 美女高潮的动态| 好男人电影高清在线观看| 国产成人av教育| 精品电影一区二区在线| 麻豆成人午夜福利视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产高清视频在线播放一区| 女警被强在线播放| 成人国产一区最新在线观看| 无人区码免费观看不卡| www.自偷自拍.com| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲精品一区av在线观看| 免费看日本二区| 精品国产三级普通话版| svipshipincom国产片| 岛国视频午夜一区免费看| xxx96com| 国产成年人精品一区二区| 男女那种视频在线观看| 欧美午夜高清在线| 国产精品永久免费网站| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产成人欧美在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 桃色一区二区三区在线观看| 免费看a级黄色片| 狂野欧美激情性xxxx| 日韩欧美精品v在线| www国产在线视频色| 搡老岳熟女国产| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产主播在线观看一区二区| 99久久成人亚洲精品观看| 香蕉av资源在线| 亚洲人成网站高清观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 日日夜夜操网爽| 九九热线精品视视频播放| 脱女人内裤的视频| 亚洲国产欧美人成| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 九九热线精品视视频播放| 美女被艹到高潮喷水动态| 欧美一区二区国产精品久久精品| 亚洲av片天天在线观看| 国产精品av久久久久免费| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 一夜夜www| 国内精品一区二区在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 亚洲av五月六月丁香网| 国产精品久久视频播放| 国产精品亚洲一级av第二区| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 免费在线观看亚洲国产| 国产男靠女视频免费网站| 国产单亲对白刺激| 一级a爱片免费观看的视频| 成年女人毛片免费观看观看9| www日本黄色视频网| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 欧美在线黄色| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲激情在线av| xxx96com| 国产一区二区激情短视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 日本免费a在线| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 母亲3免费完整高清在线观看| 99视频精品全部免费 在线 | 亚洲专区国产一区二区| 99riav亚洲国产免费| 1000部很黄的大片| 亚洲欧美激情综合另类| 成人三级黄色视频| 久久伊人香网站| 他把我摸到了高潮在线观看| 男女那种视频在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 国产午夜精品论理片| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲成人免费电影在线观看| 久99久视频精品免费| 最好的美女福利视频网| 久久久国产成人精品二区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 中文在线观看免费www的网站| 免费电影在线观看免费观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲性夜色夜夜综合| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲av熟女| 动漫黄色视频在线观看|