仿制和原研左氧氟沙星的體外抗菌活性比較

馬攀，陳勇川，胡顯飛，熊麗蓉，戴青，翁邦碧，馮偉（1.重慶醫(yī)科大學藥學院，重慶 400016；.陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院藥學部，重慶 400038）

左氧氟沙星屬于氟喹諾酮類抗菌藥物，抑制細菌DNA 復制、轉錄、修復和重組所需的拓撲異構酶Ⅳ和DNA 螺旋酶，對多種革蘭陰性和革蘭陽性菌均有抑制作用。因其對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌等多種臨床常見致病菌抗菌活性良好，在臨床上應用廣泛[1]。市售左氧氟沙星仿制藥品種繁多，與原研藥相比普遍具有價格優(yōu)勢，在降低醫(yī)療成本方面發(fā)揮著重要作用，但是否都具有與原研藥相同的臨床治療效果仍然存在爭議。有研究采用最低抑菌濃度（MIC）實驗和時間殺菌曲線法比較不同廠家頭孢哌酮/舒巴坦（CFP/SUL）對多藥耐藥菌（multidrug-resistant organisms，MDROs）的體外抗菌活性，結果表明不同廠家CFP/SUL 對MDROs的抗菌活性存在顯著差異[2]。亦有研究在使用萬古霉素仿制藥對肝移植合并耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）感染的腹膜炎患者進行治療時發(fā)現(xiàn)使用萬古霉素仿制藥比原研藥出現(xiàn)治療失敗的可能性顯著增加[3]。同時另一項研究證明即使通過生物等效驗證，萬古霉素仿制藥與原研藥在治療上仍不等效，在小鼠大腿感染模型中，使用仿制藥治療后明顯豐富了小鼠大腿感染的耐藥菌群[4]。

仿制藥與原研藥不等效的原因復雜，涉及到工藝、制劑、體內外溶出等方面的技術環(huán)節(jié)。對于抗菌藥物而言，其治療的基礎是對細菌的抗菌活性強弱，臨床使用不等效的仿制抗菌藥物不僅可能導致治療的失敗，更可能導致細菌耐藥的發(fā)生。因此，抗菌藥物等效性評價應首先針對藥物的抗菌活性進行評估，才能為進一步的臨床生物等效性評價提供保障。本研究將市售常見15 個廠牌的左氧氟沙星制劑按照2015年版《中國藥典》的方法進行含量測定，進而制備抗菌藥物稀釋液，再根據美國臨床與實驗室標準化協(xié)會M100S（CLSI，2016 版）推薦的瓊脂二倍稀釋法測定抗菌藥物對臨床重要病原菌的MIC，以評估市售各廠牌左氧氟沙星的體外抗菌活性，為臨床抗菌藥物生物等效性評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 試藥與菌株

本研究所有藥品均通過正規(guī)商業(yè)渠道購買，并在有效期內使用。左氧氟沙星15 個廠牌規(guī)格和批號如下，片劑（規(guī)格：0.5 g/片，批號：BW02661、20181023、181209；規(guī)格：0.1 g/片，批號：B181002031、181001、181201、00718009、180301、170409056）；膠囊劑（規(guī)格：0.1 g/粒，批號：17020541、1809020、365181213、181201、1901210、41805311）。將原研左氧氟沙星廠牌第一三共制藥標記為P1，其余廠牌將片劑隨機標記為P2 ～P9，將膠囊劑隨機標記為J1 ～J6。左氧氟沙星對照品（批號：130455-201607，含量以C18H20FN3O4計為97.3%，中國食品藥品檢定研究院）。研究所用臨床菌株來自本院臨床科室送檢標本（包括痰、分泌物、尿液、腹水、組織、血液等）中分離出的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）48 株，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）52 株，大腸埃希菌（Escherichia coli，EC）54 株。質控菌株金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）和大腸埃希菌（ATCC 25922）均由本院檢驗科提供。

1.2 儀器

Vitek2 Compact 全自動微生物分析儀、血培養(yǎng)瓶（法國生物梅里埃公司），M-H 瓊脂、哥倫比亞血平皿、0.5 號麥氏標準比濁管等（重慶龐通公司），MIT-P 型細菌多點接種儀（日本Sakuma 公司），電子天平BP211D（賽多利斯公司），液相色譜系統(tǒng)Waters2690 高效液相色譜儀，數據的采集和處理用Millennium32 系統(tǒng)，雙波長紫外檢測器Waters 2487（美國Waters 公司）。

1.3 方法

按照2015年版《中國藥典》對15 個廠牌左氧氟沙星的含量進行測定[5]，進而制備抗菌藥物的稀釋液，藥品稀釋濃度范圍見表1。細菌的接種和鑒定均按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》（第4 版）[6]的要求進行。藥敏試驗參照CLSI[7]推薦的瓊脂二倍稀釋法測定各廠牌的MIC，每批實驗均設立質控菌株，以確保整個實驗的準確性。制備濃度相當于0.5 號麥氏標準比濁管的菌懸液，將菌懸液用多點接種儀接種至含藥平皿，每點接種量為1×104CFU，置35℃孵育16 ～20 h 后觀察結果，實驗操作過程均嚴格按照CLSI 文件M07-A10[8]的規(guī)定進行，藥敏折點標準依據CLSI 抗微生物藥物敏感性試驗的執(zhí)行標準進行判讀。最后計算各MIC值水平下的累積抑菌百分率，即在每個MIC值水平下被抑制住的細菌株數與細菌總株數的比值[9]。實驗數據結果用Excel 2010 版進行描述分析，并使用GraphPad_prism8.0 版進行繪圖比較。

2 結果

2.1 市售各廠牌左氧氟沙星含量結果

按照2015年版《中國藥典》規(guī)定，左氧氟沙星的含量以左氧氟沙星（按C18H20FN3O4計）計應為標示量的90.0%～110.0%，對15 個廠牌進行含量測定，發(fā)現(xiàn)P4 和P9 兩廠牌含量略低，分別是97.09%和97.28%；J1 和J4 兩廠牌含量略高，分別為102.82%和102.48%，各廠牌結果均符合藥典規(guī)定。具體結果見表2。

表1 左氧氟沙星各細菌MIC 質控范圍及藥品稀釋濃度范圍(μg·mL－1)Tab 1 MIC quality control range of levofloxacin and dilution concentration range of drugs (μg·mL－1)

表2 各廠牌左氧氟沙星的含量Tab 2 Content of levofloxacin by various brands

2.2 市售各廠牌左氧氟沙星體外抗菌活性結果

對各廠牌左氧氟沙星進行SA、EC 和PA 的體外抗菌活性比較，結果見表3，發(fā)現(xiàn)所有廠牌對質控菌株的MIC結果均落在各菌種MIC質控范圍內，MIC值相差不超過±1 個藥物稀釋梯度，對臨床菌株的體外抗菌活性差異較明顯。市售各廠牌左氧氟沙星對3 種臨床分離菌株的體外抗菌活性結果見表4。原研藥P1 在3 種臨床菌株中均體現(xiàn)出更優(yōu)的抗菌活性，P2、P4、P5、P6、P7、J1、J2、J3 與J6 的抗菌活性與原研藥相當，其余廠牌相對較低。MIC50、MIC90分別表示抑制住50%和90%的細菌所需的最低藥物濃度[6]。各廠牌對SA 的抗菌活性結果表明，P9 的MIC50為0.25 μg·mL－1，其余均 是0.125 μg·mL－1；P9 和J4 的MIC90為1μg·mL－1，其余均為0.5 μg·mL－1，MIC范圍0.125μg·mL－1到2 或8 μg·mL－1不 等。對EC 的抗菌活性結果顯示，盡管MIC90都是4 μg·mL－1，但P1、P6、J1、J2、J3MIC50低其余廠牌 一 半，MIC范圍0.0078 μg·mL－1到8 或16 μg·mL－1不等，差異較明顯。在對PA 的抗菌活性中發(fā)現(xiàn)，各廠牌的MIC50均是0.5 μg·mL－1，MIC90除P7 是1 μg·mL－1外，其余均為2 μg·mL－1。MIC范圍從0.25 μg·mL－1到2 或8 μg·mL－1不等，個別廠牌對某些臨床菌株的MIC值相差4 倍。依據CLSI 藥敏折點，發(fā)現(xiàn)本研究中左氧氟沙星對SA、PA 的敏感率較高，對EC 的敏感率相對較低。

表3 市售各廠牌左氧氟沙星及對照品對質控菌株的體外抗菌活性結果(μg·mL－1)Tab 3 In vitro antibacterial activity of levofloxacin from commercially available brands and reference product against quality control strains (μg·mL－1)

2.3 累積抑菌百分率及耐藥率情況分析

2.3.1 累積抑菌百分率 根據各廠牌對臨床分離菌株的體外抗菌活性MIC范圍，發(fā)現(xiàn)各廠牌左氧氟沙星在藥物低濃度時的累積抑菌百分率差異更大，故選擇SA、EC、PA 的MIC范圍最低值（0.125、0.0078、0.25 μg·mL－1）下的累積抑菌百分率進行比較。圖1A 顯示，當最低值為0.125 μg·mL－1時，P7 和J3 對SA 的累積抑菌百分率最高均為66.67%，P6、P1 等廠牌次之，最低是P9 為39.58%；當最低值 為0.0078 μg·mL－1時，P1 和J2 對EC的累積抑菌百分率最高均為18.52%，J3 次之，而P2、P3、P8、P9、J4、J5 廠牌累積抑菌百分率為0%；當最低值為0.25 μg·mL－1時，P1 對PA 的累積抑菌百分率最高是19.2%，而最低是P9 僅為1.9%。該結果顯示，在MIC最低值下各廠牌左氧氟沙星對3 種細菌的抑制情況存在差異，少數廠牌在此濃度下不足以抑制細菌生長，但某些廠牌如原研藥卻可以抑制住部分細菌的生長。

表4 各市售廠牌左氧氟沙星對臨床分離菌株的體外抗菌活性結果(μg·mL－1)Tab 4 In vitro antibacterial activity of levofloxacin from various commercial brands against clinically isolated strains (μg·mL－1)

2.3.2 耐藥率 依據CLSI 藥敏折點標準，藥物濃度≥4 μg·mL－1時表示SA 對其耐藥，當藥物濃度≥8 μg·mL－1時表示EC、PA 對其耐藥，圖1B 顯示，SA 臨床菌株對P9 的耐藥率最高為8.33%，但對P1 和P7 沒有出現(xiàn)耐藥菌株。每個廠牌均出現(xiàn)EC 耐藥菌株，其中耐藥率仍是P9 最高為11.11%。PA 出現(xiàn)耐藥的只有P9 和J5 兩個廠牌。

2.4 P1、P9、J5 的臨床菌株累積抑菌百分率對比分析

研究發(fā)現(xiàn)P9 的累積抑菌百分率較其他廠牌低，且PA 的臨床菌株僅對P9 和J5 兩個廠牌出現(xiàn)耐藥。故選取仿制藥P9 和J5 與原研藥P1 進行對比。如圖2所示，對SA 臨床菌株，在MIC值0.125 μg·mL－1下，P1 的累積抑菌百分率為60.4%，而J5 為54.2%，P9 累積抑菌百分率最低為39.6%。對EC 臨床菌株，仿制藥P9 和J5 的累積抑菌百分率明顯低于原研藥P1，在MIC值0.0078 μg·mL－1下，P1 為18.5%，而P9 和J5 均為0%；在MIC值0.0156 μg·mL－1下，P1 為27.8%，而P9 和J5 均為16.7%；直到MIC值為0.25 μg·mL－1，P1、P9 為64.8%，J5 為63.0%，三者的累積抑菌百分率才幾乎達到一致。對PA 臨床菌株，在MIC值0.25 μg·mL－1下，P1 的累積抑菌百分率為19.2%，而J5 為7.7%，P9 只有1.9%。從以上數據得出，無論是SA、EC 還是PA，P1 對臨床菌株的累積抑菌百分率始終高于P9 和J5，尤其是在較低藥物濃度時差異更加明顯。

圖1 各廠牌在MIC 范圍最低值下的累積抑菌百分率（A）和耐藥折點下的耐藥率（B）情況Fig 1 Accumulative inhibition percentage and drug resistance rate of each brand under the minimum value of MIC（A）and drug resistance breakpoint（B）

圖2 P1、P9、J5 的臨床菌株累積抑菌百分率對比情況Fig 2 Accumulative inhibition percentage of clinical strain of P1，P9 and J5

3 討論

本研究結果顯示，市售各廠牌左氧氟沙星對質控菌株的體外抗菌活性相似，對于臨床菌株，有9 個廠牌與原研藥的抗菌活性相當，敏感率接近，但有幾個廠牌的抗菌活性與原研藥存在明顯差異，個別廠牌存在MIC值相差4 倍的情況。依據CLSI 藥敏折點標準對各廠牌的耐藥率進行分析發(fā)現(xiàn)，P9 的耐藥率始終比其他廠牌高。左氧氟沙星因其抗菌譜廣抗菌活性強已成為臨床中最常用的抗感染藥物之一，常用于肺炎、鼻竇炎、支氣管炎、尿路感染以及腎盂腎炎的臨床治療用藥或經驗用藥[10]?？垢腥局委煶晒Φ年P鍵是抗菌藥物的濃度要達到治愈感染所需的MIC[11]，本研究結果顯示，左氧氟沙星原研藥對臨床菌株的抗菌活性優(yōu)于某些仿制藥，尤其是在較低藥物濃度時差異更加明顯，這種差異很可能在臨床治療時導致治療效果的不同。當體內藥物濃度較低時，感染細菌會在“亞抑菌濃度”下存活，為耐藥突變體創(chuàng)造有利的環(huán)境，增加產生耐藥的風險[12]。

抗菌藥物在我國的生產廠牌多，使用量大且?guī)缀醵际欠轮扑?，若質量欠佳不僅可能導致臨床治療失敗還會引起細菌耐藥，開展抗菌藥物一致性評價工作更應嚴格把關。生物等效性試驗是確?！百|量和療效一致性”至關重要的一步，以藥動學參數為終點評價指標的生物等效性通常采用Cmax和AUC進行評價[13]，但抗菌藥物作用特殊，它并不直接作用于人體，而是作用于體內的細菌，它既可能殺滅或抑制細菌生長，也可能誘導細菌耐藥。基于藥代動力學/藥效學（pharmacokinetic/pharmacodynamic，PK/PD）特性制訂的抗菌治療方案，可使抗菌藥物在人體內達到最大殺菌活性，保證臨床療效和安全性，并減少細菌耐藥性的發(fā)生和發(fā)展?！犊咕幬锼幋鷦恿W/藥效學理論臨床應用專家共識》指出，衡量氟喹諾酮類最佳PK/PD 指數及臨床療效靶值是AUC0～24/MIC[14]。面對臨床復雜的細菌耐藥情況，有廠牌出現(xiàn)MIC值相差4 倍的情況，AUC/MIC的差距可想而知。有文獻報道，用常規(guī)生物等效性指標評價兩種抗菌藥物等效，但在臨床治療上卻有顯著性差異[15]。因此，對抗菌藥物仿制藥的體外抗菌活性評估也應該進行相應的技術細化，如本研究中所采用的各MIC值水平下的累積抑菌百分率指標，是否可以成為考察抗菌藥物生物等效和臨床等效間相關性的重要前提“參數”，值得進一步研究。這樣在評價抗菌藥物的等效性試驗時，就需要根據抗菌藥物的作用特點，在常用生物等效性指標Cmax、Tmax和AUC的基礎上，引入MIC以上有效的AUC和MIC以上濃度的持續(xù)時間等指標進行評價。

抗感染治療的失敗是主要的醫(yī)療問題之一，特別是在發(fā)展中國家[16]，盡管仿制藥的使用減少了醫(yī)保以及患者的經濟負擔，但這不應以治療效果欠佳以及耐藥風險增加作為代價，尋求社會醫(yī)療成本的節(jié)省不能成為藥物進入市場的唯一標準。本研究中各廠牌左氧氟沙星的含量相近，對質控菌株的MIC結果差異不大，因為質控菌株是一類特征明確的標準菌種，遺傳學特性得到確認和保證并可追溯，且對抗菌藥物具有高敏感性。而臨床菌株來自于各個科室的各類標本，更易出現(xiàn)變異而導致耐藥，所以各廠牌左氧氟沙星對臨床菌株的體外抗菌活性存在一定差異。導致這種差異可能的原因很多，如制劑所使用原料藥的純度、晶型或者有關物質等與原研藥存在差異，這會直接影響到制劑質量[17]。仿制藥中不同的賦形劑或添加劑等輔料也會對藥品質量產生影響[18]，患者還可能會對特定產品中的輔料產生不良反應，使用仿制藥可能會增加不良反應的發(fā)生率[19]。另外，仿制藥即使與原研藥原料一致，若制備工藝未達到最優(yōu)化，質量上也會產生差異[20]。有研究表明，左氧氟沙星仿制藥制劑質量差可能是導致其耐藥的重要原因[21]。臨床選擇治療藥物時既要考慮到仿制藥降低醫(yī)療成本的優(yōu)勢，也應注意可能存在的療效不一致問題。

本研究存在一些局限性。首先，本研究并未對所有市售左氧氟沙星廠牌進行測試，但鑒于本研究選擇的15 個廠牌的產品均為市場上常見的品規(guī)，故選擇該15 個廠牌進行實驗是具有代表性的。其次，本研究僅通過含量測定和體外抗菌活性來評價左氧氟沙星仿制藥和原研藥之間的差異，而沒有做進一步的體內研究如動物模型或健康志愿者上市后的臨床研究。最后，本研究沒有考察仿制藥和原研藥中添加劑及賦形劑等輔料的影響，這可能是體外抗菌活性不同的原因之一，之后將針對上述幾個方面做更深一步的研究。

4 結論

本研究結果顯示市售各廠牌左氧氟沙星仿制藥對臨床重要致病菌的體外抗菌活性較原研藥存在差異，建議在對抗菌藥物進行仿制藥一致性評價時應結合其PK/PD 特性，引入基于各MIC值水平下的累積抑菌百分率進行對比，確保仿制藥在真實的臨床細菌耐藥情況下與原研藥具有相同的抗菌活性。無論是濃度依賴性抗菌藥物的Cmax/MIC、AUC/MIC還是時間依賴性的%T＞MIC，臨床感染細菌MIC的變化（差異）會對抗菌藥物的臨床治療效果產生重要影響[22]。建議定期對市售不同廠牌抗菌藥物進行體外抗菌活性測定。

致謝：特別感謝重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院藥學部/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學研究中心賈運濤教授對本文的指導與幫助。