代謝組學在結(jié)直腸癌中的研究進展

裴 斌，樊志敏

(1. 南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210029；2. 南京中醫(yī)藥大學附屬南京中醫(yī)院，江蘇 南京 210001)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是發(fā)生于下消化道的一種惡性腫瘤，據(jù)WHO統(tǒng)計報道，全球每年有超百萬人被診斷為結(jié)直腸癌，其中死亡人數(shù)更是超過50萬，其發(fā)病率在全球癌癥中僅次于肺癌和乳腺癌位于第三位，病死率排在第四位[1]，在國內(nèi)發(fā)病率和病死率則分列第三位和第五位[2-3]。CRC因腸鏡、腫瘤標志物等篩查手段的普及在以美國為代表的發(fā)達國家中發(fā)病率呈下降趨勢，而在我國隨著生活水平的提高，人們喜食高油鹽、高脂食物，加之運動不足等，目前發(fā)病率一直處于上升狀態(tài)[4]，且呈現(xiàn)年輕化趨勢，給社會發(fā)展及人民健康造成嚴重威脅。結(jié)直腸癌早期缺乏典型臨床表現(xiàn)和體征，診斷困難，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已屬中晚期。CRC患者的生存時間與腫瘤的分期息息相關(guān)：Ⅰ期患者根治術(shù)后治愈率常超過90%、Ⅱ期患者手術(shù)配合輔助治療其5年生存率亦能達到85%左右；而中、晚期患者的生存率往往下降迅速，Ⅳ期腸癌患者只有不到12%的五年生存率，且手術(shù)治療后仍有超過30%的患者會出現(xiàn)復發(fā)[5]。目前治療CRC的主要方法是手術(shù)結(jié)合放化療，但對于有轉(zhuǎn)移者預后仍較差。

目前CRC診斷方法主要有：早期癥狀觀察(如有排便性狀改變、便血、腹痛、腹瀉等常見癥狀建議進一步的檢查)，大便隱血試驗(一種檢查消化系統(tǒng)疾病的簡便方法，陽性者建議做胃腸鏡、明確出血病因)，肛門指檢(可檢查肛管直腸下段有無腫物、出血、疼痛等)，結(jié)腸鏡檢查(是結(jié)直腸癌診斷的金標準，在進行檢查時，能同時進行預防性切除及取活檢，但因結(jié)腸鏡檢查具有傾入性，患者耐受性差，并發(fā)穿孔、出血等風險，檢查費用高，其在我國未得到大規(guī)模推廣應用)。上述常規(guī)篩查方法因敏感性、特異性較低，檢查費用高，患者配合度差等原因難以廣泛應用于臨床[6]，而目前臨床常用的腫瘤標志物CEA、CA19 -9 等蛋白組學指標的檢測，p53 、APC等基因檢測也存在自身靈敏度和特異性不高等局限性，因而臨床深入研究CRC，尋求特異性強、靈敏性高的早期診斷方法迫在眉睫，代謝組學的興起為其提供了新的方法手段。本文主要介紹了代謝組學的概況及其在結(jié)直腸癌中的研究進展。

1 代謝組學概況

作為系統(tǒng)生物學新的分支學科，代謝組學效仿基因組學和蛋白質(zhì)組學的研究思想，利用高通量技術(shù)手段動態(tài)監(jiān)測分析生物體受生理、病理刺激或基因修飾時發(fā)生的代謝產(chǎn)物的變化[6-7]，判斷某一時刻生物體所處的整體狀態(tài)。代謝組是指生物體內(nèi)源性代謝物質(zhì)的動態(tài)整體，是參與生物體新陳代謝、維持生物體正常生長功能的分子化合物的集合，其研究目標常是相對分子量≤1 000的小分子代謝物，這些小分子代謝物包括脂質(zhì)、氨基酸、糖類、脂肪酸等。

代謝組學研究流程一般由樣品收集預處理、數(shù)據(jù)采集-代謝物分析、數(shù)據(jù)分析、生命現(xiàn)象闡釋幾部分構(gòu)成，目前代謝組學研究使用的生物體樣本范圍廣泛，常包括組織、體液、排泄物、細胞等[8]。血液和尿液等生物體液常被應用于惡性腫瘤方面研究，但亦有相關(guān)學者認為腫瘤組織比血液和尿液等體液穩(wěn)定，能更好地體現(xiàn)腫瘤本身的代謝特點，主要技術(shù)手段包括核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)以及質(zhì)譜(mass spectrum，MS)等聯(lián)用技術(shù)[9]。結(jié)直腸癌是遺傳、飲食、腸道炎性病變等因素綜合作用的結(jié)果，代謝組學通過探索腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的各項生化反應，能夠篩選鑒定出新的腫瘤標志物，從而為腫瘤早期診斷、分期、評估療效和預測預后等提供幫助。

1.1代謝組學技術(shù)分析平臺 目前代謝組學研究的兩大主要分析技術(shù)即核磁共振波譜和質(zhì)譜，兩種方法各有其優(yōu)劣。NMR通過核自旋、能級裂分、共振吸收特定頻率的射頻輻射來檢測不同的代謝物。NMR的優(yōu)勢在于樣品前處理較為簡單，高通量，能對生物樣本進行無創(chuàng)、無偏倚性檢測，被認為是描述代謝物結(jié)構(gòu)的金標準，而NMR技術(shù)也存在敏感性低、樣本需求量大等缺點[10-11]。其中，研究最常用的檢測方法是核磁共振氫譜(Proton Nuclear Magnetic Resonance1H-NMR)。質(zhì)譜(MS)因其廣泛的動態(tài)范圍，目前被廣泛用于代謝組學的研究。由于檢測樣本種類復雜，為了盡可能多地檢測代謝物，在質(zhì)譜分析之前往往需要進行分離，常有GC-MS、LC-MS、CE-MS等聯(lián)用方式。 GC-MS是分析揮發(fā)性化學物質(zhì)的有效組合，樣本一般需要進行衍生化處理，而需檢測的代謝物往往在衍生化過程中有所損失。因此，GC-MS主要適用于有針對性的代謝組學分析[12],氣相色譜-四級-質(zhì)譜、氣相色譜-飛行時間-質(zhì)譜是GC-MS常用的方法。LC-MS可以分離熱不穩(wěn)定的、無揮發(fā)性、未衍生化的代謝物，因此，LC-MS檢測的化合物種類范圍比GC-MS更廣，適合作為未知代謝物研究中的探索辦法，但缺少代謝物數(shù)據(jù)庫是LC-MS技術(shù)的缺點，超高效液相色譜(ultraperformance liquid chromatography,UPLC)、電噴霧(electrospray ionization，ESI)是常用的兩種電離技術(shù)。CE對分析物的分離范圍較寬，包括小的無機離子和大分子蛋白質(zhì)[13]。毛細管電泳近年來發(fā)展較快，以其分離效率高、樣本需要量少、運行成本低等優(yōu)點得到廣泛應用，當CE聯(lián)合高靈敏度的質(zhì)譜檢測器，代謝物最小檢測限會降低。但是毛細管電泳因進樣量少，因此限制了檢測的靈敏度。由上可知，想對臨床種類、性質(zhì)各異的樣品進行全面、無偏向性代謝組學分析，分析檢測技術(shù)需要具有高通量、高特異性、高敏感度等特點。目前還沒有任何一個分析平臺能夠滿足上述所有要求，因此為了自身研究需要，多平臺聯(lián)合檢測的方法日趨流行。

1.2代謝組學數(shù)據(jù)分析平臺 技術(shù)分析平臺采集的原始數(shù)據(jù)不能直接用于分析，因而在統(tǒng)計分析前運用模式識別技術(shù)對這些數(shù)據(jù)進行預處理可以從中獲得正確有效的信息，將其變成可識別的數(shù)據(jù)模式，才能運用于下一步的分析。根據(jù)技術(shù)平臺的變化，數(shù)據(jù)預處理主要有過濾噪聲、峰識別、譜圖去卷積、標準化和歸一化等步驟，在操作中根據(jù)實際情況選擇相應的步驟進行即可。常用的化學計量方法主要分為兩類，包括非監(jiān)督性和有監(jiān)督性的學習方法。前者包括非線性映(nonlinear mapping，NLM)、主成分分析(principal components analysis，PCA)、自組織映射圖(self-organizing maps，SOM)等，后者常用的有神經(jīng)網(wǎng)絡的改進、偏最小二乘法一判別分析(partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA)、正交偏最小二乘法一判別分析(OPLS-DA)等[14-15]，PCA和PLS-DA在研究中較為常用，通過各類數(shù)據(jù)分析技術(shù)，將多維、分散的數(shù)據(jù)進行分類、歸納和總結(jié)，對組間差異代謝物可進行初步的篩選，之后結(jié)合差異性代謝產(chǎn)物，挖掘相關(guān)的代謝調(diào)控途徑，可以為腫瘤早期診斷、分期、評估療效和預測預后等方面奠定良好基礎(chǔ)。

2 代謝組學在CRC中的研究進展

腫瘤細胞與正常組織相比常發(fā)生代謝紊亂，其代謝旺盛，具有超強的增殖能力與逆境生存能力。體內(nèi)腫瘤細胞的任何改變都會引起其生化反應過程中代謝產(chǎn)物發(fā)生變化，而代謝物作為腫瘤細胞生存發(fā)展過程的產(chǎn)物，能夠?qū)δ[瘤的整體狀態(tài)進行準確的判斷反映[16-17]。代謝組學因研究思想獨特和技術(shù)手段發(fā)展迅速的優(yōu)勢被廣泛地用于研究腫瘤領(lǐng)域，目前，國內(nèi)外已有多個專家學組對結(jié)直腸癌進行代謝組學研究。

2.1組織中的代謝組學研究 Phua等[18]應用GC-TOF-MS技術(shù)對11例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織和10例健康人黏膜樣本進行分析，顯示3-磷酸甘油酸鹽(3-phosphoglycerate)、葡萄糖、檸檬酸及半乳糖在CRC患者組織樣本中的含量明顯低于健康對照組，而尿苷、肌苷(inosine)、脯氨酸等代謝物的含量升高。Williams等[19]基于分期因素對收集的結(jié)直腸癌組織與癌旁組織進行代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)篩選鑒定出的代謝物標志對CRC的早期診斷及評估預后有警示作用。Tian等[20]用高分辨率魔角旋轉(zhuǎn)和氣相-色譜-質(zhì)譜技術(shù)分別對50例CRC患者(分Ⅰ～Ⅱ、Ⅲ ～ Ⅳ期)癌組織及相鄰的正常組織進行代謝組學分析，結(jié)果顯示：相較于正常組織，膽堿、磷酸膽堿(PC)、甘油磷酸膽堿(GPC)、鯊肌醇、磷酸乙醇胺 (PE)在癌組織中含量較高，且與早期腫瘤組織相比，Ⅲ ～ Ⅳ期CRC患者癌組織中的脂質(zhì)含量高、而膽堿含量低。聯(lián)合應用 PCA、OPLS - DA分析法，發(fā)現(xiàn)Ⅰ期癌組織與正常組織間的脂質(zhì)組學差異最大。早晚期、正常組織間脂質(zhì)含量及類型的不同，可幫助指導臨床CRC診斷并判別分期。楊靜[21]研究發(fā)現(xiàn)miR-135b在結(jié)直腸癌患者組織中的表達高于癌旁組織，且水平隨TNM分期增加而增加，認為腫瘤細胞可能與調(diào)節(jié)miR-135b表達密切相關(guān)，并且通過調(diào)節(jié)miR-135b的表達來影響CRC患者的預后。2018年有研究者對51例結(jié)直腸癌組織標本進行分析，其中25例轉(zhuǎn)移型結(jié)直腸癌顯示了明顯更低百分比的二十碳五烯酸(EPA)和更高水平的γ-亞麻酸(GLA)，由此可見，脂肪酸分析對于轉(zhuǎn)移型結(jié)直腸癌有良好的診斷價值[22]。

2.2血液中的代謝組學研究 Ritchie等[23]基于脂肪酸代謝途徑對不同區(qū)域CRC患者血清樣本進行分析，結(jié)果顯示：CRC患者擁有較低水平的28 ～ 36含碳量的羥基化多不飽和超長鏈脂肪酸。Montrose等[24]研究結(jié)直腸癌血漿標本代謝物發(fā)現(xiàn)，肌氨酸、甘氨酸、絲氨酸和二甲基甘氨酸明顯升高，且血漿中氨基酸代謝改變發(fā)生在早癌階段。這表明氨基酸代謝通路對腫瘤細胞早期增殖分化和生存有著重要作用，因此氨基酸代謝指標的變化可作為結(jié)直腸癌早期診斷的潛在標志物。Zhu等[25]在對20例CRC患者連續(xù)的49份血清樣本進行LC-MS技術(shù)分析時，共發(fā)現(xiàn)162個代謝物，其中N2、N2-二甲基鳥苷、1-甲基鳥苷、甲基丙二酸鹽、琥珀酸鹽、腺嘌呤、焦檸檬酸在疾病惡化患者血清中的水平顯著高于疾病穩(wěn)定和完全緩解者，建立由上述差異代謝物表征的模型，其受試者工作曲線、靈敏度、特異性均優(yōu)于傳統(tǒng)的標志物CEA，該研究表明代謝物輪廓分析可以用于CRC病程監(jiān)測。Kühn等[26]通過LC-MS法對163例CRC患者血液標本進行脂質(zhì)和己糖方向的代謝組學分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶血磷脂膽堿(lysoPCs)表達水平越高，結(jié)直腸癌發(fā)病風險越低，且惡性腫瘤被診斷出的時間往往比血清中脂質(zhì)代謝物變化發(fā)生要遲數(shù)年，相較于目前臨床常用的腫瘤標志物對CRC診斷及預防缺乏特異性，溶血卵磷脂可以作為早期診斷CRC的代謝指標運用于臨床。Nishiumi等[27]運用代謝組學技術(shù)分析CRC(分期為 0、Ⅰ、Ⅱ期)患者血清標本，其中發(fā)現(xiàn)一組由丙氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、3-羥基異戊酸、羥基乙酸、棕櫚酸、延胡索酸色氨酸構(gòu)成的新組合。上述代謝物組合預測CRC的特異性為99.3%，敏感性為93.8%，隨腫瘤分期的增加，其敏感性、特異性逐漸降低。在一項涉及250例CRC血樣本的隊列研究中，發(fā)現(xiàn)包括4個有機化合物、5個有機酸、7個芳香族化合物、9個非甘油磷脂脂類、12個甘油磷酸脂類在內(nèi)的共35個代謝產(chǎn)物失調(diào)與結(jié)直腸癌發(fā)生相關(guān)[28]，結(jié)直腸癌高風險性與甘油磷酸脂類失調(diào)關(guān)系最為密切，具有診斷價值。

2.3尿液中的代謝組學研究 Chen等[29]及樊靜等[30]運用基于MRB的CE-MS技術(shù)分析結(jié)直腸癌患者(早期8例、晚期12例)以及14例健康人尿液樣本中的9種有機酸和20種游離氨基酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常對照組相比，精氨酸、亮氨酸、纈氨酸、乳酸和異亮氨酸這5種氨基酸在腸癌患者尿液標本中的含量較高，而蘋果酸、琥珀酸鹽、門冬氨酸、檸檬酸、組氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸含量顯著降低；隨結(jié)直腸癌病理分期的提高，纈氨酸、異亮氨酸含量逐漸降低。由此可見，結(jié)直腸癌患者與健康人之間、早期與晚期腸癌患者之間的尿液代謝輪廓差異都存在統(tǒng)計學意義。Cheng等[31]收集61份CRC患者和62份正常對照者的尿液樣本，聯(lián)合運用UPLC-QTOFMS、GC-TOFMS技術(shù)，構(gòu)建了由2氨基丁酸鹽、犬尿酸、枸櫞酸、馬尿酸鹽、腐胺、十四酸鹽和對甲酚7個代謝物組成的模型，并后續(xù)利用健康對照組和結(jié)直腸癌患者各40份的尿液樣本進行了驗證。該診斷模型通過ROC曲線分析，在測試組和確認組中診斷結(jié)直腸癌的特異性與靈敏度均超過97%。有研究發(fā)現(xiàn)，肝再生磷酸酶3(PRL-3)通過誘導HK2、PKM2、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(Glutl)和LDHA表達促進糖酵解和減少胞內(nèi)ROS水平，在肝轉(zhuǎn)移型結(jié)直腸癌的代謝調(diào)節(jié)中起重要作用[32]。

2.4糞便中的代謝組學研究 徐梅華等[33]利用端粒酶PCR-ELISA法分析端粒酶在健康對照者、結(jié)直腸腺瘤患者及大腸癌患者的糞便腸脫落細胞中的活性表達，結(jié)果顯示按健康對照者、結(jié)直腸腺瘤患者及大腸癌患者順序，端粒酶陽性表達率逐漸上升。由此可以看出，糞便腸脫落細胞端粒酶活性表達對大腸癌的早期篩查有潛在意義。2017年有研究證實，與正常對照組相比，結(jié)直腸癌患者中熊去氧膽酸、丁酸鹽、亞油酸等水平明顯降低。2018年Ahmed等[34]研究證實，miR-135b在對照組、腺瘤組到腸癌組中的表達水平依次增加，并由此證明了糞便標本中的miR-135b可作為晚期腺瘤和CRC診斷的代謝標志物。Song等[35]收集糞便標本進行代謝組學分析發(fā)現(xiàn)，腸癌患者與健康對照組的脂肪酸代謝輪廓顯著不同，提示糞便脂肪酸可以成為CRC篩查的新型工具。Bosch 2019年對11項研究進行分析總結(jié)，提出短鏈脂肪酸和氨基酸在糞便氣相中水平升高，而多元醇和膽汁酸水平降低[36]。

綜上所述，CRC患者的組織、血、尿、糞便中的代謝物均發(fā)生改變，通過檢測其中各種代謝產(chǎn)物，如糖類、脂質(zhì)、脂肪酸、氨基酸和miRNA等，可篩選鑒定出差異代謝物，聯(lián)合運用數(shù)據(jù)庫信息分析，能得到相關(guān)的紊亂代謝通路，代謝組學因自身固有優(yōu)勢在CRC臨床研究中有著良好的應用前景。但是我們也發(fā)現(xiàn)隨著樣本種類、數(shù)量，研究人員，技術(shù)方法等因素的變化，代謝組學研究分析的結(jié)果也存在差異。標本收集處理標準不一、無標準化實驗流程、技術(shù)平臺操作復雜、數(shù)據(jù)分析軟件功能較少等局限使代謝組學的運用還需要進行更多的實驗和臨床研究探索。筆者相信隨著技術(shù)手段的不斷完善和優(yōu)化，運用代謝組學技術(shù)對結(jié)直腸癌進行研究分析會出現(xiàn)更多的成果，從而為腫瘤診斷、分期、評估療效和預測預后等提供更多的信息和幫助。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。