汪德秀,王 豐,徐 強(qiáng),孫孟坊
(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 神經(jīng)外科,浙江 溫州 325008)
膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的原發(fā)性惡性腫瘤疾病,常規(guī)手術(shù)、放化療治療效果均不十分理想,其中位生存期不足15個(gè)月[1]。膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多種致癌基因共同作用的結(jié)果,癌基因的篩查和分析有助于更好地認(rèn)識(shí)膠質(zhì)瘤,為膠質(zhì)瘤治療提供新靶點(diǎn)[2-4]。紡錘體極成分25(spindle pole body component 25,SPC25) ,又名著絲粒復(fù)合物成分(NDC80 kinetochore complex component)[5-6],被認(rèn)為參與著絲粒微管的相互作用和紡錘體檢查點(diǎn)活性的調(diào)控,在肺癌、前列腺癌等腫瘤中均具有促癌作用,但其在膠質(zhì)瘤中尚無(wú)研究報(bào)道。本研究觀察SPC25在膠質(zhì)瘤患者中的表達(dá)和對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響,以期為膠質(zhì)瘤治療的新靶點(diǎn)篩選提供思路。
1.1 一般資料 收集2009年1月—2014年12月溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院收治的不同級(jí)別膠質(zhì)瘤患者90例,其中男55例,女35例,年齡40~65歲,平均年齡(52.9±6.5)歲。根據(jù)WHO病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[2],Ⅱ級(jí)20例,Ⅲ級(jí)32例,Ⅳ級(jí)38例。收集同期10例腦外傷患者作為對(duì)照組,男6例,女4例,年齡40~65歲,平均年齡(53.7±6.8)歲。2組患者年齡、性別比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所選膠質(zhì)瘤患者均經(jīng)術(shù)后病理診斷確診,患者均不存在已明確的與SPC25表達(dá)相關(guān)的其它疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所選患者均簽署知情同意書。
1.2 材料 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù),胎牛血清FBS,DMEM,PBS,0.25%含EDTA的胰酶,1%青鏈霉素均購(gòu)自Gbico生物科技有限公司。人全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白上樣緩沖液、ECL發(fā)光液等Western blot相關(guān)試劑均購(gòu)自碧云天生物科技有限公司。免疫組化試劑盒購(gòu)自福建邁新生物科技有限公司,SPC25抗體、β-actin及HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體購(gòu)自CST生物科技有限公司,RNA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及qPCR試劑均購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司。SPC25-siRNA由上海生工生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成,轉(zhuǎn)染試劑lipo3000購(gòu)自Life invritogen有限公司,MTS試劑盒及結(jié)晶紫染色液購(gòu)自北京索萊寶凱基生物科技有限公司。
1.3 生物信息學(xué)分析 基于癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析和統(tǒng)計(jì)(https://cancergenome.nih.gov),采用GlioVis(http://gliovis.bioinfo.cnio.es)數(shù)據(jù)平臺(tái)獲取TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中膠質(zhì)瘤患者SPC25的表達(dá)水平、預(yù)后生存時(shí)間等臨床資料數(shù)據(jù),并進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
1.4 Western blot 將膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織進(jìn)行充分研磨、勻漿,或收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞,采用全蛋白提取試劑盒提取組織中的全蛋白,采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。配制上樣緩沖液,采用聚丙烯酰胺凝膠電泳,PVDF膜濕轉(zhuǎn),5%奶粉封閉,采用TBST以1∶1 000比例稀釋anti-SPC25、anti-β-actin,4℃孵育過夜(大于12 h),次日孵育HRP標(biāo)記的二抗,ECL曝光檢測(cè)SPC25的表達(dá)情況。
1.5 熒光定量PCR 組織RNA提?。喝∧z質(zhì)瘤組織充分研磨后,加入1 mL Trizol反復(fù)吹打、充分混勻后轉(zhuǎn)移至無(wú)RNA酶的1.5 mL EP 管中,室溫下靜置10 min。隨后加入200 μL氯仿,室溫下劇烈震蕩5 min,4℃ 12 000 g離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中,加入500 μL異丙醇,上下顛倒混勻后室溫靜置10 min。4℃ 12 000g 離心10 min,棄上清,向底部沉淀加入1 mL 75% 乙醇吹打洗脫,4℃ 7 500 g離心5 min,棄上清。沉淀室溫下干燥10 min后加入40 μL DEPC水溶解,即為RNA樣品,凍存于-80℃中。細(xì)胞RNA提?。哼x取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞接種至6孔板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度85%時(shí),用預(yù)冷的PBS清洗貼壁的細(xì)胞3次,每孔加入1 mL Trizol充分溶解細(xì)胞,后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同組織RNA提取。隨后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建cDNA,采用熒光定量PCR檢測(cè)各組織SPC25的表達(dá)水平。隨后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建cDNA,采用熒光定量PCR檢測(cè)各組織SPC25的表達(dá)水平。引物:SPC25:F: 5'- TTTGGTAACAGCGACACGG -3', R: 5'- CGGAGCCAGCAAGGTTT -3';GAPDH: 5'- TGATAATGAATGTGTAAAAT -3', R: 5'-CCTCTGCCTCCCGGGTTCACAG-3'。
1.6 免疫組化 將膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織立即給予4%的多聚甲醛固定48 h,酒精梯度脫水,二甲苯通透,石蠟包埋。采用4 μm厚度切片,酒精梯度復(fù)水、水化、抗原修復(fù)、去除內(nèi)源性過氧化物酶、封閉后給予anti-SPC25 4℃孵育過夜,次日孵育二抗、鏈霉菌抗生物素蛋白―過氧化物酶,DAB顯色,蘇木素染色細(xì)胞核,封片,鏡下觀察。
1.7 siRNA轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞 將1×106個(gè)U87細(xì)胞接種至六孔板中,次日細(xì)胞匯合度至60%~80%時(shí),采用lipo3000分別轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照(siRNA-NC)和特異性針對(duì)SPC25基因的(siRNA-SPC25),正義鏈序列為:5'-CUUGACCUGUCCAACAACAUU-3',反義鏈序列為3'-UUGAACUGGACAGGUUGUUGU-5',轉(zhuǎn)染后48 h分別提取細(xì)胞蛋白和RNA,采用Western blot和熒光定量PCR檢測(cè)SPC25的沉默效果。
1.8 MTS實(shí)驗(yàn) 分別將1×103個(gè)U87-siRNA-NC和U87-siRNA-SPC25細(xì)胞接種至96孔板中,每孔4個(gè)重復(fù),連續(xù)接種五塊板,每日分別向其中1塊板中加入20 μL MTS試劑,3 h后采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)下吸光度值,分析其增殖率。
1.9 集落形成實(shí)驗(yàn) 分別向6孔板中接入500個(gè)U87-siRNA-NC和U87-siRNA-SPC25細(xì)胞,連續(xù)培養(yǎng)14 d,采用1%結(jié)晶紫染色10 min,PBS沖洗后觀察形成的集落數(shù),集落形成率=(集落形成數(shù)/500) ×100%。
1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn),患者生存時(shí)間分析采用Kaplan-Meier分析,全部實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 生物信息學(xué)分析 TCGA膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示, SPC25 mRNA在528例膠質(zhì)瘤組織中的平均表達(dá)水平(-0.23±0.41)高于10例正常腦組織(-1.72±0.45),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見圖1A。進(jìn)一步采用Kaplan-Meier分析SPC25表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者生存率的關(guān)系,結(jié)果顯示SPC25高表達(dá)的膠質(zhì)瘤患者(50例)平均生存時(shí)間為13.6個(gè)月,SPC25低表達(dá)患者(40例)平均生存時(shí)間為14.8個(gè)月,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03),見圖1B。
B
2.2 SPC25在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá) 90例膠質(zhì)瘤組織中SPC25蛋白和mRNA表達(dá)水平均高于10例對(duì)照腦組織,其表達(dá)水平隨膠質(zhì)瘤病理分級(jí)級(jí)別的升高依次增高,見封三圖1。SPC25高表達(dá)的膠質(zhì)瘤患者(50例)平均生存時(shí)間為22.4個(gè)月,SPC25低表達(dá)患者(40例)平均生存時(shí)間為29.5個(gè)月,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.029),見封三圖2。
2.3 SPC25對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響 Western blot和熒光定量PCR結(jié)果顯示,與U87-siRNA-NC細(xì)胞比較,U87-siRNA-SPC25細(xì)胞中SPC25蛋白呈低表達(dá),見封三圖3。MTS結(jié)果顯示,U87-siRNA-SPC25細(xì)胞的吸光度值低于U87-siRNA-NC細(xì)胞,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見封三圖4A。集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,U87-siRNA-SPC25集落形成率低于U87-siRNA-NC,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見封三圖4B。
研究發(fā)現(xiàn),SPC25在肝癌、前列腺癌、乳腺癌等腫瘤中均存在異常的高表達(dá)現(xiàn)象,SPC25的過表達(dá)可促進(jìn)肝癌、前列腺癌、乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[7-10]。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)SPC25過表達(dá)可導(dǎo)致小鼠生存時(shí)間顯著縮短,在前列腺癌細(xì)胞中沉默SPC25的表達(dá),腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲活性顯著受到抑制,荷瘤裸鼠的生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)[10]。前列腺癌干細(xì)胞存在過高的SPC25表達(dá),SPC25過表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞系具有更為典型的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞特征[10]。
本研究采用生物信息學(xué)技術(shù),TCGA膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示,SPC25在膠質(zhì)瘤組織中的平均表達(dá)水平明顯高于正常腦組織,SPC25高表達(dá)膠質(zhì)瘤患者平均生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)患者。同時(shí),本研究分別采用Western blot、熒光定量PCR和免疫組化檢測(cè)90例膠質(zhì)瘤組織和10例對(duì)照腦組織中SPC25蛋白和mRNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤組織中SPC25表達(dá)水平明顯高于對(duì)照腦組織,SPC25高表達(dá)的膠質(zhì)瘤患者平均生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)患者。本研究進(jìn)一步構(gòu)建siRNA,沉默膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中SPC25的表達(dá),MTS和集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示,U87-siRNA-SPC25細(xì)胞的吸光度值和集落形成率均明顯低于U87-siRNA-NC細(xì)胞。
綜上所述,有絲分裂調(diào)控相關(guān)基因SPC25在膠質(zhì)瘤中存在高表達(dá)現(xiàn)象,可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),導(dǎo)致膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后結(jié)局,SPC25可能為膠質(zhì)瘤治療研究的潛在靶點(diǎn)。