miRNA-29c在前列腺癌中的表達及其臨床意義

蔡海榮，王 平，金百冶

(1.浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310002；2.浙江臺州市立醫(yī)院 泌尿外科，浙江 臺州 318000；3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 泌尿外科，浙江 杭州 310006)

前列腺癌(prostate cancer，PC)是男性中最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。據(jù)美國最新2019年研究調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，前列腺癌在美國十大癌癥新發(fā)病率中上升至第1位，其所致死亡數(shù)高居美國男性癌癥相關(guān)死亡第二位[1]；同樣，前列腺癌在我國的發(fā)病率亦呈逐年上升趨勢。目前臨床主要是通過檢測前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)表達水平來進行篩查和早期診斷，然而PSA作為前列腺癌早期診斷的標(biāo)志物缺乏敏感性和特異性。因此，積極尋找新的診斷標(biāo)志物來聯(lián)合PSA作為前列腺癌早期診斷標(biāo)記，是當(dāng)前研究的熱點[2]。

MicroRNA(miRNA)是一類調(diào)節(jié)蛋白編碼的內(nèi)源性小分子單鏈RNA,其主要通過與信使RNA的特定序列結(jié)合，從而抑制翻譯或剪切RNA轉(zhuǎn)錄物來對基因進行轉(zhuǎn)錄后表達的調(diào)控[3]。miRNA-29c在許多實體腫瘤如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細胞癌、胃癌、結(jié)腸癌、膀胱癌中均呈低表達，并且起到抑癌基因作用。然而，miRNA-29c在前列腺癌中的作用和潛在機制尚不明確。本文通過檢測miRNA-29c在前列腺癌患者中的表達量，探討其在前列腺癌中的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象選擇 選取本院泌尿外科2015年1月—2017年1月收治的40例前列腺癌患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理切片證實；②首次診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：①他處具有原發(fā)性腫瘤；②術(shù)前具有放化療治療；③不配合實驗者。患者年齡48～82歲，平均(64.5±9.8)歲，其中年齡≥60歲26例，<60歲14例。將腫瘤按2016AJCC TNM分期進行分期：Ⅰ期17例，Ⅱ期7例，Ⅲ期11例，Ⅳ期5例；將前列腺癌按病理Gleason評分分級：高分化腺癌26例(Gleason2～6分)，中分化腺癌8例(Gleason7分)，低分化腺癌6例(Gleason8～10分)。同期選取前列腺增生(BPH)患者30例，平均年齡(61.9±8.44)歲；健康體檢男性30例，平均(42.13±9.22)歲。所有患者疾病確診前后均未進行任何治療。

1.2 主要試劑和儀器 RNA 抽提試劑Trizol 購自Invitrogen 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix ExTaq 試劑盒均購自TaKaRa 公司，miRNA-29c、U6逆轉(zhuǎn)錄引物和PCR上下游引物均由廣州Ribobio生物科技有限公司提供。實時熒光定量 PCR儀器購自美國Bio-Rad有限公司。

1.3 標(biāo)本收集和處理 收集40例前列腺癌患者血清及其癌和癌旁組織、30例前列腺增生患者血清及30例健康體檢男性血清。前列腺癌患者新鮮靜脈血2 mL，以2 000 r/min在離心機上離心10 min，吸取其上清液移至2 mL離心管中，再以12 000 r/min離心2 min，吸取上層無細胞血清200 μL至2 mL EP中，放置-80℃冰箱中保存待測。用TRIzol試劑盒，根據(jù)操作說明提取各血清樣本中的總RNA，并測定總RNA濃度及純度，取吸光度比值為1.8～2.1的樣品用于后續(xù)試驗。前列腺癌及癌旁組織標(biāo)本直接放入液氮中保存?zhèn)溆茫煌瑯邮褂肨RIzol試劑盒提取癌及癌旁組織標(biāo)本的總RNA。取 400 ng總RNA，TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒酶進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為10 μL，包括 5×PrimeScript Buffer 2 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dT Primer(50 μM)0.5 μL，Random 6 mers(100 μM)0.5 μL，補無酶水至10 μL。 反應(yīng)條件為37℃ 15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))，85℃ 5 s(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))，4℃，產(chǎn)物置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 miRNA-29c的表達水平測定 根據(jù)TRIzol試劑盒操作說明提取各樣本的總RNA，并測定總RNA濃度；然后依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明，以U6作為內(nèi)參，將樣本分別逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA；再以U6作為內(nèi)參，SYBR? Premix Ex Taq II聚合酶、miRNA-29c引物和 SYBRGreen熒光染料進行實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)，miRNA-29c引物序列：上游序列5′-UGACCGAUUUCUCCUGGUGUUC-3′,下游序列5′-UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA-3′，其中以 U6 作為內(nèi)參引物， 其上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。相對表達量計算公式為 RQ=2-△△CT。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行整理及分析，計量資料2組間比較用t檢驗，多組間比較采用方差分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-29c的表達水平 前列腺癌患者、BPH者和健康體檢者血清中miRNA-29c的表達量分別為(0.357±0.012)、(0.836±0.023)和(0.818±0.015)。前列腺癌患者血清中miRNA-29c的表達水平顯著低于BPH和健康體檢者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；BPH組和健康對照組血清中的miRNA-29c表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

***：P<0.001圖1 miRNA-29c在前列腺癌(PCA)、良性前列腺增生(BPH)和健康對照(NC)血清中的相對表達量

2.2 血清miRNA-29c表達變化與PC患者臨床病理相關(guān)參數(shù)的相關(guān)性 對前列腺癌患者臨床病理相關(guān)參數(shù)進行分組(表1)，結(jié)果提示：不同Gleason評分、腫瘤分期及是否骨轉(zhuǎn)移的患者間血清miRNA-29c表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，不同血清前列腺抗原(PSA)水平的患者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 不同臨床病理參數(shù)前列腺癌患者的血清miRNA-29c表達水平比較

2.3 前列腺癌患者癌組織中的miRNA-29c表達水平 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，miRNA-29c在40例前列腺癌實體腫瘤組織及其癌旁組織中的表達水平分別為(0.86±0.038)、(1.38±0.072)，2者間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 miRNA-29c在前列腺癌及其癌旁組織中的表達水平

3 討論

迄今為止，前列腺癌的發(fā)病機制仍然沒有明確，早期前列腺癌患者接受及時有效的治療后，大部分能得到比較好的恢復(fù)，但由于前列腺癌早期無明顯的臨床特征，出現(xiàn)癥狀時，往往已經(jīng)處于晚期。臨床上對前列腺癌早期篩查主要是通過檢測前列腺特異性抗原(PSA)，且PSA是前列腺癌診斷及預(yù)后的常用指標(biāo)，診斷前列腺癌的PSA標(biāo)準(zhǔn)臨界值為4 ng/L，然而當(dāng)PSA值為4～10 ng/mL時(即PSA灰區(qū))，前列腺癌的檢出率不超過30%[4]，同時PSA又容易導(dǎo)致對前列腺癌的診斷和治療過度[5]；此外PSA在前列腺增生及前列腺炎患者中有時同樣會出現(xiàn)一定程度的升高，這就使其在臨床上的應(yīng)用產(chǎn)生局限性。

miRNA是一種內(nèi)源性非編碼RNA，主要通過特異性結(jié)合靶基因mRNA的3′-UTR序列，從而起到調(diào)控目的基因的表達及翻譯作用，miRNA參與機體內(nèi)60%以上的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[6]。作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列，miRNA參與機體的各種生理功能，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[7-9]。某些miRNA 表達與多種惡性腫瘤相關(guān)，起著抑癌基因及癌基因的作用，有些甚至與惡性腫瘤的診斷預(yù)后相關(guān)[10-11]。miRNA-29家族包括miR-29a/b/c, miRNA-29c位于第1號染色體，是此家族主要成員，miRNA-29a/b/c只是2個或者3個堿基不同，miRNA-29a和miRNA-29c主要通過RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA induced silencing complex RISC)機制發(fā)揮作用，miRNA-29b主要通過其他機制調(diào)節(jié)靶基因的表達[12]。該家族成員在惡性腫瘤細胞的表達都出現(xiàn)異常且執(zhí)行抗腫瘤的作用，其成員在功能上具有重疊的地方，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞凋亡、表觀遺傳修飾等[13]。雖然成熟的miR-29a/b/c序列高度相同，然而miRNA-29家族中不同亞型各自發(fā)揮其獨特的功能[14]。miRNA-29c在許多實體腫瘤如乳腺癌、肝細胞癌、胃癌、膀胱癌等中均呈低表達，并且起到抑癌基因作用[15-17]。如在三陰性乳腺癌癌前病變中，miRNA-29c及其下游通路起到重要調(diào)節(jié)作用[18]；在胃癌中，miRNA-29c可以通過和RCC2靶向結(jié)合，降低其表達，從而起到抑制胃癌增殖的能力[19]；在膀胱癌中，miRNA-29c通過調(diào)控靶基因CDK6起到抑制其增殖與侵襲的作用[20]；此外，Zhang等[21]研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中miRNA-29c呈低表達，SPARC被確定為miRNA-29c的直接靶標(biāo)，其沉默可降低腸癌細胞增殖和遷移。最近研究發(fā)現(xiàn)miRNA-29c通過多途徑對前列腺癌的發(fā)展起抑制作用，如Li等[22]研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)的miRNA-29c通過抑制前列腺癌中的SLC2A3基因表達來抑制其細胞增殖和糖酵解。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miRNA-29c在前列腺癌患者血清中的表達量顯著低于BPH患者和健康對照者，而BPH患者和健康對照者間無顯著性差異。進一步分析發(fā)現(xiàn)Gleason評分≥7分、Ⅲ/Ⅳ期、有骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者的miRNA-29c表達量明顯低于<7分、Ⅰ/Ⅱ期、無骨轉(zhuǎn)移的患者，可見miRNA-29c的表達水平隨著臨床分期的增加而進一步下降，而與血清前列腺抗原(PSA)水平無明顯相關(guān)。因此，可以通過檢測血清miRNA-29c的表達水平來區(qū)分前列腺癌患者與健康者，為臨床上對前列腺癌患者的早期診斷提供可靠依據(jù)。此外，miRNA-29c在Gleason評分及臨床分期越高的前列腺癌患者中表達越低，Gleason評分代表前列腺癌的腫瘤分化程度，積分為2、3、4分者屬于高分化腺癌；5、6、7分者屬于中分化腺癌；8、9、10分者屬于低或者未分化癌，據(jù)此可推測miRNA-29c可能參與了前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程及侵襲轉(zhuǎn)移過程。

綜上所述，目前對于前列腺癌的早期診斷，缺乏靈敏度和特異度較高的診斷標(biāo)志物，需要尋找具有較高靈敏度及特異度的診斷標(biāo)志物來進一步提高前列腺癌患者的診斷率。本研究結(jié)果提示miRNA-29c在前列腺癌組織及血清中低表達，且miRNA-29c的表達與前列腺癌臨床分期、病理學(xué)分級和遠處轉(zhuǎn)移等具有相關(guān)性，低表達的 miRNA-29c可能參與了前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，對其檢測在前列腺癌患者的早期診斷及預(yù)后判斷中具有一定價值。