秦皮苷對脂多糖誘導的軟骨細胞氧化應激和炎癥因子的影響*

詹彥婷，覃再嫩，鄭 立△

（廣西醫(yī)科大學 1.廣西生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心 廣西－東盟重大疾病預防協(xié)同創(chuàng)新中心；2.廣西組織器官修復醫(yī)用生物材料工程技術研究中心，南寧 530021）

骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）作為一種致殘率極高的疾病，給患者精神和經濟都帶來了沉重的負擔[1]。OA 涉及整個關節(jié)的變化，包括透明軟骨進行性丟失，軟骨下骨發(fā)育不良、骨贅和骨包膜的厚度增加[2-3]。促進OA 發(fā)展的主要原因包括炎癥介質過表達、降解酶的產生過多以及氧化應激等。其中，活性氧(ROS)引起的氧化應激能促進分解代謝，從而使軟骨穩(wěn)態(tài)遭到氧化及破壞，是軟骨細胞損傷的主要原因[4]。目前，非甾體類抗炎藥（NSAIDs）和阿片類的鎮(zhèn)痛藥已被應用于OA 的治療，然而這些藥物大部分情況下只能緩解OA 患者的癥狀，并且長期使用此類藥物對人體會產生較大的副作用[5]。因此，在OA 的治療策略上，可以采用抑制炎癥、降低氧化應激和維持軟骨代謝平衡的方法，有助于延緩OA的進展。

秦皮苷作為秦皮的有效成分，具有抑制炎癥反應、減少氧化應激、降低肺血管通透性、護肝、護腎的作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，秦皮苷可以通過抑制核因子κB（NF-κB）和激活核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）信號通路，保護小鼠免于內毒素休克[7]。在脂多糖（LPS）誘導的急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）小鼠模型中，秦皮苷能下調炎癥基因白介素（IL）-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和IL-1β 的表達，清除ROS，增加超氧化物歧化酶活性，從而避免氧化應激損傷[8]。在氧嗪誘導的高尿酸血癥模型中，秦皮苷可以抑制腎臟中的相關轉運體（如腎葡萄糖轉運蛋白9 和尿酸轉運蛋白1），從而使尿酸鹽的排泄增加，達到抗高尿酸血癥的目的[9]。然而，秦皮苷對LPS 誘導的OA 軟骨細胞的作用和機制目前尚未見報道。本研究旨在探討秦皮苷對炎癥環(huán)境下軟骨細胞的抗炎、抗氧化及軟骨保護作用，以期為OA的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 藥物和主要試劑 秦皮苷(純度≥95%)（麥克林，中國）；逆轉錄試劑盒（Fermentas Company，美國）；LPS、青/鏈霉素、MTT 試劑、總RNA 提取試劑盒、蘇木精－伊紅（HE）染色試劑盒、番紅O 染色試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒（Solarbio，中國）；二型膠原酶（Sigma，美國）；鈣黃綠素/乙錠均二聚物（Calcein-AM/EthD-I）染色試劑(百奧萊博，中國)；ROS檢測試劑盒（碧云天，中國）；基質金屬蛋白酶(MMP)-13 一抗、FITC 免疫熒光抗體（博士德，美國）；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國）；引物（金開瑞，中國）。

1.2 實驗動物 SPF 級雄性SD 大鼠，3～5 日齡，體重10～12 g，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SYXK 桂2020-0004。本研究涉及的動物實驗由廣西醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準，批準號：202010001。

1.3 T-AOC 檢測 使用T-AOC 檢測試劑盒評估秦皮苷的總抗氧化水平。在酸性狀態(tài)下，秦皮苷能將Fe3+-三吡啶三吖嗪（Fe3+-TPTZ）還原，生成藍色的Fe2+-TPTZ。秦皮苷按照對倍稀釋的方法配置成不同濃度（0 μg/mL、0.3125 μg/mL、0.625 μg/mL、1.25μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL）的溶液，取秦皮苷溶液30 μL，工作液900 μL 和雙蒸餾水90 μL，充分混合，室溫條件下孵育10 min，加入100 μL 的混合液于96 孔板，并用酶標儀檢測593 nm 處的吸光度（OD）值。

1.4 軟骨細胞的提取、培養(yǎng)及鑒定 麻醉處死大鼠，備皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮膚，無菌操作下取下雙側股骨頭及膝關節(jié)（保留周圍肌肉，軟骨不能暴露），置于含1%的青/鏈霉素的PBS 中，去除軟骨周圍組織，將軟骨剪為1 mm×1 mm×1 mm 的小塊，胰蛋白酶消化30 min，含2 mg/mL的Ⅱ型膠原酶37 ℃下消化4 h，1 000 r/min 離心5 min，收集并重懸細胞于DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每兩天換1次液，待細胞密度約為90%時，對細胞進行傳代，使用第3 代細胞進行后續(xù)實驗。通過HE染色和番紅O染色法進行軟骨細胞鑒定。

1.5 MTT法檢測軟骨細胞增殖率 通過MTT法檢測軟骨細胞增殖率，以評價秦皮苷對軟骨細胞的毒性作用，具體步驟：將軟骨細胞接種于96孔板，待細胞充分貼壁后，加入100 μL 濃度分別為0 μg/mL、0.312 5 μg/mL、0.625 μg/mL、1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80μg/mL 的秦皮苷溶液，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗，換新培養(yǎng)基，加入MTT 試劑10 μL，置于37oC 培養(yǎng)箱中，4 h 后將培養(yǎng)基棄去，加入DMSO 100μL，37oC 避光孵育15 min，用酶標儀檢測490nm 處各孔的OD 值。細胞增殖率=[(實驗組OD－空白調零孔OD)/(對照組OD－空白調零孔OD)]×100%。實驗重復3次。

1.6 細胞分組和干預 將細胞分為對照組、模型組和處理組。對照組只加入完全培養(yǎng)基，模型組加入含10 μg/mL LPS 的完全培養(yǎng)基，處理組先提前1 h加入含10μg/mL LPS 的培養(yǎng)基誘導軟骨細胞損傷，隨后加入5μg/mL 秦皮苷的完全培養(yǎng)基。將細胞種植于6孔板中，待24 h細胞貼壁后，經過相應的藥物處理24 h 后，收集細胞。通過HE 染色和番紅O 染色法評價秦皮苷對LPS誘導OA軟骨細胞的作用。

1.7 Calcein-AM/EthD-I 染色檢測細胞活性 將細胞爬片置于6 孔板中，調整細胞密度為2×105個/孔，待細胞密度達到80%～90%時，藥物處理24 h，PBS清洗3次，加入0.05%Calcein-AM 和0.2%EthD-I染色試劑在暗室中37oC 孵育5 min，PBS 清洗掉熒光試劑，在熒光顯微鏡下觀察細胞的生存情況并拍照，用Image J 軟件統(tǒng)計活細胞和死細胞數(shù)目，計算細胞增殖率。

1.8 二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）熒光探針檢測軟骨細胞內ROS 按照1∶1 000 的比例用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA熒光探針，使終濃度為10μmol/L。棄去細胞培養(yǎng)基，加入0.5 mL DCFH-DA 熒光探針稀釋液，在37oC的CO2培養(yǎng)箱中避光孵育20 min，每3～5 min混勻1次，用無血清培養(yǎng)基將爬片洗滌3遍，在熒光顯微鏡下觀察細胞的熒光強度，用Image J 軟件分析熒光強度的平均值，熒光強度越強，細胞內的ROS水平越高。

1.9 免疫熒光染色檢測軟骨細胞MMP-13 的分泌情況 用PBS 洗滌細胞爬片3 次后，將細胞爬片置于3% H2O2中孵育15 min，PBS 洗滌3 次，與山羊血清溫育15 min，棄去血清；滴加一抗（MMP-13，1∶100）37oC孵育4 h，PBS洗滌3次；二抗（FITC-抗兔IgG，1∶100）37 ℃避光孵育1 h，PBS清洗3次，吸去水分，熒光顯微鏡下觀察熒光圖像并拍照，用Image J軟件分析熒光強度的平均值，綠色熒光強度越強，MMP-13的水平越高。

1.10 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）檢測相關基因的表達 提取細胞RNA，逆轉錄為cDNA，使用LightCycler?96 實時熒光定量PCR 儀（Roche，瑞士）進行qPCR反應，用GADPH作為內參，檢測炎癥基因IL-6、MMP-3、MMP-13 和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）以及軟骨特異性基因Col2al 的表達情況。引物序列見表1。實驗重復3次，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

表1 PCR引物序列

1.11 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SKN-q檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 秦皮苷的T-AOC 在秦皮苷濃度為1.25 μg/mL時，總抗氧化水平較高（P＜0.05），并且隨著秦皮苷濃度的增加，總抗氧化水平也相應升高（圖1），表明秦皮苷具有良好的抗氧化的能力。

圖1 秦皮苷的T-AOC

2.2 軟骨細胞的鑒定結果 HE 染色顯示：細胞形態(tài)呈多邊形或橢圓形（圖2A），符合軟骨細胞形態(tài)特征。番紅O 染色中，堿性染料與細胞蛋白多糖結合，使細胞變?yōu)榧t色（圖2B），細胞具有分泌蛋白多糖的功能，表明提取的細胞為軟骨細胞。

圖2 SD大鼠軟骨細胞的鑒定

2.3 秦皮苷對軟骨細胞的毒性作用 秦皮苷濃度低于5μg/mL 時，對軟骨細胞無明顯毒性（P＞0.05）（圖3）。因此，選擇5 μg/mL 作為秦皮苷的工作濃度。

2.4 秦皮苷對LPS 誘導OA 軟骨細胞的作用 HE染色結果顯示：對照組軟骨細胞形態(tài)正常，模型組軟骨細胞數(shù)量較對照組明顯減少，細胞呈長梭型，與成纖維細胞形態(tài)類似；與模型組相比，秦皮苷處理后軟骨細胞形態(tài)改善，細胞數(shù)量顯著增加，形態(tài)接近于正常軟骨細胞（圖4），表明秦皮苷可以維持軟骨細胞的正常形態(tài)。

番紅O 染色顯示：對照組有大量蛋白多糖分泌，經LPS 處理后，模型組顏色變淺，蛋白多糖的分泌量（紅色細胞數(shù)）顯著減少，且經秦皮苷處理后，蛋白多糖分泌量（紅色細胞數(shù)）明顯高于模型組（圖5），說明秦皮苷可以促進蛋白多糖的分泌。

圖3 MTT檢測秦皮苷對軟骨細胞的毒性作用

2.6 3 組軟骨細胞活力比較 與對照組比較，模型組存活細胞數(shù)量顯著減少，細胞增殖率下降（P＜0.001）；經秦皮苷處理后，與模型組相比，處理組存活細胞數(shù)量增加，細胞增殖率升高（P＜0.001）（圖6），表明秦皮苷能促進軟骨細胞的增殖。

2.7 3 組細胞內ROS 水平比較 與對照組比較，模型組熒光強度明顯提高（P＜0.001），說明細胞內的ROS 水平顯著升高；與模型組相比，處理組熒光強度明顯降低（P＜0.001），說明細胞內的ROS 水平明顯降低，見圖7。

2.8 3組軟骨細胞MMP-13表達比較 與對照組相比，模型組MMP-13 的表達升高（P＜0.001）；與模型組相比，處理組MMP-13 表達明顯降低（P＜0.001），見圖8。

2.9 3組軟骨細胞特異性基因及炎癥相關基因表達比較 模型組IL-6、MMP-3、MMP-13 和iNOS 基因的表達均高于對照組(P＜0.001)，軟骨特異性基因Col2al 的表達降低（P＜0.001）。與模型組相比，處理組炎癥基因IL-6、iNOS、MMP-3 和MMP-13 的表達明顯降低（P＜0.05），軟骨特異性基因Col2al的表達升高（P＜0.05）(圖9)。提示秦皮苷可以逆轉炎癥相關基因及軟骨特異基因的表達。

圖4 細胞HE染色圖（×100）

圖5 細胞番紅O染色圖（×100）

圖6 Calcein-AM/EthD-I染色檢測細胞的活性

圖7 熒光探針檢測細胞內的ROS

圖8 免疫熒光染色顯示MMP-13的表達情況

圖9 特異性軟骨基因和炎癥相關基因的表達

3 討論

OA 作為一種慢性退行性病變，多涉及關節(jié)軟骨，軟骨下骨和滑膜等部位[10]。軟骨變性的最關鍵特征是基質降解酶（包括MMP 和蛋白聚糖）的上調。研究表明，由炎癥介質過度表達引起的氧化應激可導致分解代謝酶增加，細胞外基質降解，OA 癥和軟骨細胞凋亡，從而促進了OA 的整體進展[11]。秦皮是臨床常用的中藥，具有清熱解毒、消炎、抗氧化、抗菌、抗高尿酸血癥和平喘止咳等功能[12-14]。秦皮苷是秦皮的有效活性成分，在LPS 誘導的ARDS小鼠模型中，具有明顯的抗炎及抗氧化的作用。但目前尚未有研究報道秦皮苷對OA 的作用，本研究探討了秦皮苷對LPS 誘導的體外OA 模型的影響。結果發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內，秦皮苷具有抑制軟骨細胞外基質降解、減少炎癥介質和抗氧化作用，在一定程度上延緩了OA的進展。

關節(jié)軟骨周圍有大量的細胞外基質，而基質僅由軟骨細胞產生，一旦受損，關節(jié)軟骨內源性修復困難[15]。細胞外基質的主要成分是膠原和蛋白多糖，細胞外基質合成與降解的不平衡是導致OA 的主要因素[16]。因此，維持細胞外基質分解代謝的平衡，對于OA 的治療具有至關重要的作用。MTT 結果顯示，5 μg/mL 的秦皮苷對軟骨細胞無毒性，Cal‐cein-AM/EthD-I染色結果表明，秦皮苷在該濃度下，能促進軟骨細胞的增殖，抑制細胞的凋亡。蛋白多糖作為軟骨細胞外基質的重要組成部分，其分泌的減少不利于軟骨的生長，而蛋白多糖的分泌的增加則有助于調節(jié)細胞外基質穩(wěn)態(tài)[17]。HE 和番紅O 染色結果顯示，秦皮苷能維持軟骨細胞的正常形態(tài)，增加蛋白多糖的分泌，對軟骨起保護作用。MMPs參與膠原降解，MMP-13是軟骨分解代謝的關鍵酶，其過表達會導致細胞外基質降解[18-19]。MMP-13 在軟骨細胞的分解代謝活動中起著重要的作用，抑制MMP-13 的表達有助于保護軟骨[20]。本研究結果顯示，秦皮苷能抑制MMP-3和MMP-13的表達(均P＜0.05)，有利于維持軟骨分解代謝的平衡，避免細胞外基質的降解。此外，秦皮苷可上調軟骨特異性基因Col2al的表達(P＜0.001)，提示秦皮苷能促進Ⅱ型膠原的合成，間接促進軟骨細胞外基質的形成。

過量ROS 引起的氧化應激是引起軟骨降解和OA 的主要原因，清除ROS 可以抑制氧化應激，對OA 的治療起著重要的作用[21]。T-AOC 結果表明，秦皮苷具有良好的抗氧化性能，并且隨著秦皮苷濃度的增加，其抗氧化能力也增加。DCFH-DA 熒光探針的結果也表明了秦皮苷具有清除軟骨細胞內ROS、抑制氧化應激的作用。研究表明，炎癥對OA的發(fā)展起著重要的作用，炎癥因子的過度表達往往導致骨與軟骨的破壞[22]。因此，抑制炎癥因子的過表達有助于延緩OA 的進展。據(jù)文獻報道，秦皮苷能通過降低炎性介質IL-1β 和IL-6 的表達，抑制JAK/STAT 和激活NF-κB 信號通路，以達到緩解肺炎克雷伯菌所致重癥肺炎癥狀的目的[23]。本研究qPCR 結果顯示，秦皮苷能抑制LPS 誘導IL-6、iNOS的過度表達（均P＜0.05），表明秦皮苷能抑制LPS誘導的炎癥，以發(fā)揮對軟骨的保護作用。

綜上所述，秦皮苷可以抑制炎癥因子和分解代謝基因的過表達，促進軟骨特異性基因的上調，清除ROS，對軟骨細胞具有良好的抗炎、抗氧化和保護作用。因此，秦皮苷在LPS 誘導的體外OA 模型中具有抗氧化、抗炎的作用，其有望應用于OA 的治療，作用機制有待進一步研究。