MicroRNAs調控細胞“上皮－間質轉換”的靶基因及相關信號途徑的研究進展*

王 婷，楊慶利，冷 靜

（廣西中醫(yī)藥大學 1.廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結合轉化醫(yī)學重點實驗室；2.基礎醫(yī)學院，南寧 530200）

細胞的“上皮－間質轉換”（epithelial-mesenchy‐mal transition，EMT）過程不僅關系到正常胚胎發(fā)育[1]、傷口愈合、組織纖維化等病理生理過程[2]，還與癌細胞從原發(fā)部位向遠處組織或淋巴結轉移的過程密切相關[3]。在EMT 過程中，上皮細胞失去連接性和極性，獲得間充質細胞特性，使遷移和侵襲性增強[3-4]。調控EMT 發(fā)生的因素包括轉錄因子（如SNAIL、TWIST、ZEB 等）、代謝因素、microRNAs（miRNAs）及l(fā)ncRNAs 等[5]。miRNAs是一類小的非編碼RNA，通過調控靶基因的表達在多種疾病中發(fā)揮重要作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs可靶向眾多基因并抑制其表達，通過影響特定信號通路以及代謝通路對EMT 過程發(fā)揮促進或抑制的調控作用。本文主要從miRNAs 直接調控EMT 的靶基因和相關信號途徑以及miRNAs表達調控等方面進行綜述。

1 促進EMT 發(fā)生的miRNAs 靶基因及其信號通路

miRNAs 可靶向多種基因并抑制其表達，通過特定信號通路促進EMT 表型分子表達和腫瘤細胞遷移、侵襲或轉移。研究發(fā)現(xiàn)，miR-10b 通過直接靶向E-鈣粘蛋白（E-cadherin）基因CDH1 的3’-UTR區(qū)461和481位核苷酸，下調其mRNA 和蛋白表達，但不影響Snail、Slug、Twist 和ZEB 的mRNA 和蛋白表達。miR-10b 下調E-鈣粘蛋白的同時，使N-鈣粘蛋白（N-cadherin）表達增加，使喉癌Hep-2細胞獲得間質紡錘樣形態(tài)，導致其EMT 并促進其遷移和侵襲[7]。miR-10b 還能靶向包含CUB 和Sushi 的多結構域蛋白1（CUB and Sushi multiple domains protein 1，CSMD1）并抑制其在胃癌組織和細胞的表達，活化炎癥與癌變相關的NF-κB 信號途徑，上調c-Myc、細胞周期蛋白D1（CCND1）和眾多EMT 標志物表達，在體外和體內(nèi)促進HGC27、MKN74 胃癌細胞系的侵襲和轉移[8]。再者，TGF-β1 誘導的miR-10b 還通過靶向凋亡蛋白酶活化因子1（apoptotic protease activating factor 1，Apaf-1）、同源性磷酸酶和張力蛋白（phosphatase and tensin homolog，PTEN），促進膠質母細胞瘤細胞EMT及其增殖和遷移[9]。

在乳腺癌細胞，miR-137 可直接與骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（bone morphogenetic protein-7，BMP7）mRNA的3’-UTR 結合而抑制其蛋白表達，促進乳腺癌細胞發(fā)生EMT 并增強其侵襲力[10]。另外，miR-182 通過靶向SMAD7 3’-UTR 抑制其蛋白表達，并促進乳腺癌細胞侵襲和骨轉移。其機制為SMAD7 蛋白水平降低導致其失去抑制TGF-β 誘導的乳腺癌細胞EMT 的效應[11]。同時，miR-181c 也可靶向SMAD7 mRNA 的3’-UTR，通過調控TGF-β/EMT 信號途徑影響骨肉瘤細胞的侵襲和遷移。但miR-181c 是否通過抑制SMAD7 促進骨肉瘤細胞TGF-β/EMT 信號途徑還不明確[12]。

在肺腺癌細胞，miR-214 直接與融合蛋白抑制因子（suppressor-of-fused，Sufu）的3’-UTR結合抑制其蛋白表達，通過Hedgehog 信號通路活化，促進肺腺癌細胞EMT 和轉移[13]。而在非小細胞肺癌細胞中，miR-150 通過靶向FOXO4 mRNA 的3’-UTR 并抑制其表達，通過NF-κB/snail/YY1/RKIP 信號通路使E-鈣粘蛋白表達降低，導致肺癌細胞EMT 和轉移[14]。在肝癌細胞，miR-197 通過靶向軸抑制蛋白2（Axis inhibition protein 2，Axin-2）、裸角質膜同源蛋白1（Naked cuticle drosophila 1，NKD1）和Dickkopf相關蛋白2（Dickkopf-related protein 2，DKK2），激活Wnt/β-catenin 信號通路并促進肝癌細胞EMT 及其侵襲和轉移[15]。在甲狀腺癌組織中發(fā)現(xiàn)miR-483表達上調，同時Pard3 蛋白（partitioning-defective 3）表達下調。抑制miR-483可促進Pard3表達增加，并抑制TGF-β1 誘導的Tiam1/Rac1 信號活化以及未分化甲狀腺癌細胞的遷移和侵襲[16]。

除上述以外，研究還發(fā)現(xiàn)晶狀體上皮細胞Spry1 和Spry 2 缺乏可促進RTK 介導的細胞外信號調控激酶1/2 磷酸化和TGF-β 相關信號，導致上皮細胞EMT 和白內(nèi)障發(fā)生。而miR-23b 能通過直接靶向SPRY2 促進晶狀體上皮細胞增殖、遷移和EMT，在白內(nèi)障發(fā)病中起促進作用[17-18]。除此之外，miR-494 與環(huán)孢素A 誘導的腎小管上皮細胞EMT密切相關。應用環(huán)孢素A 可導致miR-494 表達增加，后者靶向Pten的3’-UTR 區(qū)，抑制PTEN 蛋白表達[19]。PTEN 是PI3K/Akt 途徑的負向調控因子，在該途徑誘導的EMT 過程中發(fā)揮主要作用。PTEN下調導致PI3K/Akt 信號途徑活化，促進EMT 發(fā)生[20]。而miR-494 是否通過調控Pten的表達影響腫瘤細胞EMT過程等問題還不明確。

2 抑制EMT 發(fā)生的miRNAs 靶基因及其信號通路

目前研究表明，miRNAs 除對EMT 發(fā)生過程發(fā)揮促進作用外，還通過靶向眾多目標基因對細胞EMT發(fā)揮重要的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-98高表達可在體外抑制喉鱗狀細胞癌（LSCC）細胞EMT相關基因表達及其轉移和侵襲性，并在小鼠體內(nèi)顯著抑制腫瘤的肺轉移。miR-98 直接靶向高遷移率族蛋白A2（High mobility group A2，HMGA2）的3’-UTR 區(qū)并抑制其表達，導致受HMGA2 調控的介導EMT 發(fā)生的POSTN 蛋白的轉錄抑制[21]。另外，在臨床膀胱癌組織標本及其細胞系中發(fā)現(xiàn)miR-124-3p下調并伴隨整合素ITGA3上調，且miR-124-3p過表達可抑制腫瘤轉移和侵襲。進一步研究證實，miR-124-3p 可直接靶向ITGA3，通過FAK/PI3K/AKT 和FAK/Src 信號通路并調控N-/E-鈣粘蛋白表達來抑制EMT 過程[22]。臨床研究還發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織和細胞miR-138-5p 表達顯著降低并伴隨菱形結構域蛋白1（rhomboid domain-containing protein 1，RHBDD1）表達升高。miR-138-5p 過表達可上調E-鈣粘蛋白，同時下調N-鈣粘蛋白和Vimentin 表達并抑制乳腺癌細胞EMT 及其體外遷移和侵襲。進而證明，miR-138-5p 通過靶向RHBDD1 發(fā)揮抑制EMT 的效應[23]。在前列腺癌組織中檢測到miR-150低表達并伴隨瞬時受體電位（transient receptor po‐tential，TRP）離子通道蛋白M4（TRPM4）高表達，進而證實miR-150 通過靶向TRPM4 影響腫瘤細胞EMT。在體外上調miR-150 可抑制TRPM4 表達并阻斷β-catenin 信號通路活化，抑制腫瘤細胞EMT、增殖、遷移和侵襲，并在裸鼠體內(nèi)抑制腫瘤生長和轉移[24]。miR-202 在子宮內(nèi)膜癌組織中表達降低。進一步研究明確了miR-202通過靶向成纖維細胞生長因子2（fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2）抑制子宮內(nèi)膜癌細胞N-鈣粘蛋白、vimentin 等表達以及EMT發(fā)生[25]。研究還發(fā)現(xiàn)，miR-488 水平在骨肉瘤和舌鱗狀細胞癌組織和細胞中均顯著下調，分別伴隨水通道蛋白3（aquaporin 3，AQP3）和活化轉錄因子3（activating transcription factor 3，ATF3）表達顯著增加。進一步研究表明，miR-488 分別靶向AQP3 和ATF3，通過下調其表達分別抑制骨肉瘤和舌鱗狀細胞癌細胞EMT及其增殖和侵襲[26-27]。

在肺癌方面，miR-132 和miR-373 在非小細胞肺癌（NSCLC）組織和細胞中表達均降低，二者分別通過抑制TGF-β1/Smad2 信號通路和白細胞介素-1受體相關激酶樣蛋白2（IRAK2）和溶酶體相關膜蛋白1（LAMP1）基因對EMT 起抑制作用[28-29]。此外，miR-129 還通過靶向SRY 相關高遷移率族盒蛋白4（SOX4）的3’-UTR，抑制TGF-β誘導的NSCLC細胞系A549 的EMT 及其遷移和侵襲[30]。而miR-1246在A549、H1650 和H1299 肺癌細胞系的表達降低。進一步研究證實miR-1246靶向CXCR4并抑制其表達，通過阻斷JAK/STAT 和PI3K/AKT 信號通路，促進E-鈣粘蛋白表達，同時抑制N-鈣粘蛋白、vimen‐tin、ZEB1 和Snail 表達，結果顯著抑制腫瘤細胞EMT及其侵襲過程[31]。

受p53 誘導的miR-34 家族也能抑制腫瘤的EMT 及其早期轉移。促進結直腸癌、乳腺癌、前列腺癌等EMT 和轉移發(fā)生的IL-6R/STAT3 信號即通過后者直接抑制MIR34A基因第一內(nèi)含子中保守的STAT3 結合位點發(fā)揮作用。人結直腸癌細胞p53 基因的活化能誘導miR-34 表達并下調IL-6R，從而干擾IL-6 誘發(fā)的腫瘤細胞遷移和侵襲[32]。此外，miR-370 和miR-33a 的表達在胃癌組織和細胞系中顯著下調，分別伴隨孕激素和脂肪酸受體4（progestin and adipoQ receptor 4，PAQR4）和Snail 家族轉錄抑制因子2（SNAI2）基因表達增加。通過生物信息學和熒光素酶報告分析分別證實了miR-370 和miR-33a 分別靶向PAQR4 和SNAI2 并抑制其表達，通過抑制Snail/Slug信號抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移[33-34]。與此同時，miRNAs 對癌癥干細胞及相關EMT 也具有調控作用，目前研究主要集中于EMT可以由多種細胞信號經(jīng)由轉錄因子和信號傳導途徑引發(fā)的腫瘤相關分子和細胞機制。在胃癌細胞，miR-95 可上調腫瘤抑制劑雙特異性磷酸酶5(dualspecificity phosphatase 5，DUSP5)，并阻斷MAPK 通路及抑制癌癥干細胞標記物(CD133、CD44、ALDH1和Lgr5)的水平，這表明miR-95 可抑制胃癌細胞EMT 及癌癥干細胞表型表達[35]。而Shayimu 等[36]也證明miR-377 可通過調控轉錄因子ZEB2 (zinc fin‐ger E box-binding homeobox 2) 抑制結腸癌細胞EMT及癌癥干細胞表型表達。

miRNAs 除抑制腫瘤細胞EMT 過程外，還通過抑制非腫瘤細胞EMT 參與眾多疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。例如，miR-200 家族（包括miR-200c/miR-141和miR-200a/miR-200b/miR-429 群）在抑制細胞EMT、腫瘤發(fā)展和組織纖維化過程中發(fā)揮重要作用。miRNA200a 可直接靶向β-catenin 基因CTN‐NB1的3’-UTR并抑制其表達，能抑制TGF-β1誘導的腎近曲小管上皮細胞HK-2的EMT和遷移。miR‐NA200a 可能在抑制腎間質纖維化過程中發(fā)揮重要作用[37]。miR-200b 通過靶向RhoE 的3’-UTR 區(qū)抑制其表達，使RhoE 不能發(fā)揮調節(jié)E-鈣粘蛋白、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）和vimentin 的表達的共功能，結果抑制宮頸癌HeLa 細胞的EMT 過程[38]。miR-141 在子宮內(nèi)膜異位癥患者在位和異位子宮內(nèi)膜組織中表達降低。miR-141 能抑制TGF-β1 誘導的Ishikawa（ISK）細胞EMT、增殖和侵襲能力。SMAD2信號通路也參與該過程，但miR-141是否直接靶向SMAD2還不明確[39]。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-204-5p 在繼發(fā)性白內(nèi)障組織中表達降低。miR-204-5p 能靶向SMAD4，通過抑制TGF-β/SMAD 信號而抑制晶狀體上皮細胞（LECs）EMT 發(fā)生[40]。研究還發(fā)現(xiàn)，miR-30a 在糖尿病性白內(nèi)障組織中的表達也降低，并伴隨α-SMA 和vimen‐tin表達增加以及E-鈣粘蛋白表達降低。miR-30a能靶向Snail同源物1（Snail homolog 1，SNAI1）使其下調而抑制該EMT 過程[41]。miR-204-5p 和miR-30a對于白內(nèi)障防治具有潛在應用價值。此外，在正常組織中高表達的miR-29b除與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切關聯(lián)外，其表達降低還參與增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變（PVR）的發(fā)病過程。與此同時，miR-29b 可靶向Akt2，逆轉TGF-β1 誘導的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞（ARPE-19）EMT[42]。

受miRNAs 調控的影響細胞EMT 的靶基因種類眾多，所涉及的信號轉導途徑復雜多樣。事實上，miRNAs 除對EMT 發(fā)揮促進或抑制效應外，miRNAs 靶向特定基因還介導MET 的“逆轉”過程，其機制與特定miRNAs（如miR-524-5p）靶向TP53INP1、ZEB2 和SMAD4 等基因有關，并與誘導性多能干細胞（iPSCs）的生成緊密關聯(lián)[43]。而調控EMT 相關miRNAs 表達的因素較多，涉及代謝和表觀調控等方面。近來研究發(fā)現(xiàn)，抑制EMT 發(fā)生的miR-200c 的表達受甲基化表觀遺傳調控。甲基CpG 結合蛋白2（MeCP2）與Suv39h1 蛋白結合協(xié)同介導miR-200c 基因啟動子區(qū)組蛋白H3K9me3，抑制miR-200c 表達并促進神經(jīng)膠質瘤細胞EMT 發(fā)生[44]。研究還發(fā)現(xiàn)，HCV 核心蛋白可促進DNA 甲基轉移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）表達并導致HCV 相關肝內(nèi)膽管癌中miR-124 的表達降低，該過程也與靶基因甲基化修飾密切相關[45]。另外，有研究還闡明了與神經(jīng)嵴細胞EMT生理分化過程相伴隨的“表觀遺傳-miRNAs-基因”負反饋調控機制。該研究發(fā)現(xiàn)，DNA 從頭甲基轉移酶DN‐MT3B 和SNAIL2蛋白（可結合miR-203基因啟動子抑制其轉錄）二者共同介導miR-203基因調控區(qū)Cp‐Gs 甲基化并使miR-203 的表達水平降低，使miR-203 靶向Snail2和Phf12基因3’UTRs 抑制其表達的作用降低，結果導致SNAIL2-PHF12 蛋白復合物產(chǎn)生并抑制Cad6b 蛋白表達，使神經(jīng)嵴細胞發(fā)生EMT并出現(xiàn)生理遷移。該負反饋調控過程由SNAIL2 與miR-203的相互識別和結合實現(xiàn)[46]。

綜上所述，全面了解miRNAs 正向和負向調控細胞EMT 發(fā)生有關的靶基因及其信號途徑以及miRNAs 表達的調控對于認識惡性腫瘤和其他相關疾病發(fā)生、發(fā)展機制有重要意義。通過干預特定miRNAs 的表達可以影響細胞EMT 及其轉移過程，對腫瘤及相關疾病治療具有重要潛在價值。然而，特定細胞EMT 的發(fā)生可能受多個miRNAs 調控，其各自調控作用可能完全相反。研究調控特定細胞EMT 發(fā)生的miRNAs 表達譜及其網(wǎng)絡調控機制可能是全面認識miRNAs 調控細胞EMT 病理生理過程，尋找實際可行的miRNAs 干預治療靶點的重要環(huán)節(jié)。