一種具有光熱/pH雙響應(yīng)納米載藥體系的制備及性能初探*

楊建英，陳燕宏，楊 帆，李新春

（廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，南寧 530021）

惡性腫瘤對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，是病死率最高的疾病之一[1-4]。目前，化療是對(duì)抗惡性腫瘤的主要手段，但單個(gè)化療藥物通常存在抑瘤效果不足或毒副作用大等缺點(diǎn)，難以達(dá)到有效治療目的[5-8]。設(shè)計(jì)一種響應(yīng)性功能載體實(shí)現(xiàn)抗癌藥物的高效運(yùn)輸和協(xié)同抑瘤是一種行之有效的手段[9-11]。

硫化銅（CuS）納米粒是一種常見(jiàn)的半導(dǎo)體材料[12-14]，可以有效吸收808 nm 近紅外光輻射而產(chǎn)生熱能，達(dá)到對(duì)腫瘤細(xì)胞的熱殺傷作用[15-16]，是一種極具前途的藥物載體材料。聚多巴胺（polydopamine,PDA）是一種生物兼容性良好的仿生材料，其具有獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，能與含有氨基、亞胺、羥基及鄰苯二酚官能團(tuán)的化合物發(fā)生反應(yīng)，從而賦予PDA 分子靈活的二次修飾能力[17-22]。聚丙烯酸（polyacrylic acid,PAA）富含羧基，具有pH 響應(yīng)性，在堿性條件下羧基發(fā)生解離帶上負(fù)電荷[23-24]，從而可以通過(guò)靜電作用與帶正電荷的藥物分子結(jié)合。重要的是，在腫瘤微酸環(huán)境下，PAA 的羧酸負(fù)離子與氫離子結(jié)合，從而將帶正電的藥物分子解離，實(shí)現(xiàn)藥物分子在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的定點(diǎn)釋放[25-26]?；诖?，本文開(kāi)發(fā)了一種具有光熱/pH 雙響應(yīng)的納米載藥體系，在CuS 納米粒表面通過(guò)自聚合反應(yīng)包裹上PDA，進(jìn)一步地，通過(guò)邁克爾加成法在其表面修飾PAA，得到CuS-PDA-PAA，為構(gòu)建集光熱效應(yīng)和pH 響應(yīng)于一體的抗腫瘤納米藥物提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

鹽酸多巴胺（DA，貨號(hào)：L1810071）、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl，貨號(hào)：H1404090）、氫氧化鈉（NaOH，貨號(hào)：E1907037）均購(gòu)自阿拉丁試劑上海有限公司；CuS 納米粉末和PAA 為廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；十萬(wàn)分之一電子分析天平（美國(guó)梅特勒－多利多儀器上海有限公司）；高速離心機(jī)（上海湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；超純水機(jī)（成都越純科技有限公司）；Zetasizer Nano 納米粒度電位儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司）；超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公

司）；紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津儀器有限公司）；X-射線光電子能譜儀（XPS）（賽默飛世爾科技有限公司）；傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）（賽默飛世爾科技有限公司）；透射電子顯微鏡（TEM）（日本電子株式會(huì)社）；磁力攪拌器（艾卡廣州儀器設(shè)備有限公司）。

1.3 納米載體制備條件優(yōu)化

1.3.1 CuS濃度和超聲時(shí)間對(duì)于粒徑的影響 稱取適量CuS 納米粉，分散于一定體積水中，使其濃度分別為12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL，超聲處理10 min 后，得到CuS 分散液。在確定最優(yōu)濃度后，配制該濃度的CuS 水溶液，分別超聲處理5 min、10 min、15 min、30 min、45 min、60 min，得到相應(yīng)的CuS分散液。

1.3.2 DA濃度和聚合時(shí)間對(duì)于CuS-PDA粒徑的影響 稱取CuS 納米粉適量，置于30 mL 濃度為0.01 mol/L的Tris緩沖液（pH=8.5）中，配制成最優(yōu)濃度并超聲分散均勻。另稱取DA 適量，溶于1 mL 水中，轉(zhuǎn)移至上述CuS 分散液中，使DA 終濃度分別為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL 和80 μg/mL，于室溫條件下攪拌反應(yīng)8 h，反應(yīng)結(jié)束后于12 000 r/min 離心10 min，棄去上清，下層沉淀用水反復(fù)洗滌3 次，用水重新分散，得到CuS-PDA 分散液。確定最優(yōu)濃度后，按上述操作，于室溫條件下，考察DA 聚合時(shí)間（分別為2 h、4 h、6 h、8 h、10 h）對(duì)產(chǎn)物粒徑的影響。

1.3.3 PAA 濃度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)于CuS-PDA-PAA 粒徑的影響 取上述制備的CuS-PDA 分散液適量，用濃度為0.01 mol/L 的Tris 緩沖液（pH=8.5）稀釋成30 mL。另稱取PAA固體適量，溶于1mL水，于攪拌條件下將PAA 水溶液逐滴加入上述CuS-PDA 分散液中，使PAA 終濃度分別為10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL 和160 μg/mL，室溫條件下攪拌8 h，通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)得到CuS-PDA-PAA 納米復(fù)合物。反應(yīng)結(jié)束后于12 000 r/min離心10 min，棄去上清，下層沉淀用水反復(fù)洗滌3 次，用水重新分散，得到CuS-PDA-PAA 分散液。確定最優(yōu)濃度后，按上述操作，考察反應(yīng)時(shí)間（分別為2 h、4 h、6 h、8 h、10 h）對(duì)CuS-PDA-PAA 納米復(fù)合物粒徑的影響。

1.3.4 粒徑分布及Zeta 電位 采用納米粒度電位儀測(cè)定CuS、CuS-PDA 和CuS-PDA-PAA 的粒度分布及電位。

1.3.5 納米載體穩(wěn)定性考察將制備得到的CuSPDA-PAA 納米載體分散液超聲處理30 min，待其分散均勻后，分別取200 μL分散液于6只小瓶中，分別于4℃及25℃條件下，保存21 d，考察其在水、PBS（10 mmol/L，pH=7.4）和DMEM培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 納米載體表征分析

本實(shí)驗(yàn)采用各種光譜和電鏡技術(shù)對(duì)納米載體進(jìn)行了表征和驗(yàn)證。如圖1A所示，CuS納米粒在紫外－可見(jiàn)光區(qū)域并無(wú)特征性吸收峰[27]。CuS 修飾上PDA及PAA后，紫外－可見(jiàn)光譜無(wú)明顯變化[28]。

如圖1B所示，在CuS-PDA中，可以觀察到PDA的特征峰，如1 618 cm-1和1 485 cm-1為苯環(huán)上C=C伸縮振動(dòng)峰，2 927 cm-1為C-H 伸縮振動(dòng)峰，3 439 cm-1處的寬峰代表-OH 的伸縮振動(dòng)峰，表明PDA 成功修飾到CuS 表面。進(jìn)一步地，當(dāng)形成CuS-PDAPAA 復(fù)合物后，可以觀察到PAA 的特征吸收峰。由于修飾了PAA 后引入了羧基官能團(tuán)，相關(guān)峰的歸屬為：1 550 cm-1是C-O 的伸縮振動(dòng)峰，1 712 cm-1是羰基C=O 的伸縮振動(dòng)峰，2 594 cm-1為C-H 伸縮振動(dòng)，3 476 cm-1為羥基-OH 伸縮振動(dòng)峰，表明PAA 鍵合在PDA 分子上。采用XPS 譜對(duì)所制備的CuS-PDAPAA 納米載體進(jìn)行元素表征，如圖1C 所示，可以觀察到很強(qiáng)的C1s 峰和O1s 峰，以及較弱的S2p 峰（結(jié)合能163 eV），而Cu2p（結(jié)合能933 eV）則基本融于背景信號(hào)，這是由于形成了典型的核—?dú)そY(jié)構(gòu)，而CuS 納米粒被包裹其中（即為“核”），Cu 原子內(nèi)層電子激發(fā)信號(hào)被嚴(yán)重削弱。通過(guò)TEM 觀察CuS-PDAPAA 納米載體呈球形，中間分布有黑色的CuS 納米顆粒，平均粒徑約200 nm（圖1D）。

圖1 載體表征圖譜

2.2 不同濃度及超聲時(shí)間對(duì)CuS粒徑的影響

通過(guò)激光粒度儀檢測(cè)不同濃度下CuS 的粒徑，從圖2A 中可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CuS 濃度為100 μg/mL 條件下時(shí)粒徑僅為（144.70±10.97）nm，在該濃度下，CuS的粒徑滿足納米制劑的要求，同時(shí)又能達(dá)到腫瘤治療的光熱效應(yīng)。在最優(yōu)濃度條件下，考察超聲時(shí)間對(duì)CuS 粒徑的影響，從圖2B 中可以觀察到，隨著超聲時(shí)間的增加，粒徑呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間為15 min 時(shí)，粒徑僅為（121.30±6.15）nm，分散系數(shù)為0.174±0.012，并且當(dāng)時(shí)間超過(guò)15 min 后，粒徑減小的程度有趨于平緩，故選擇超聲時(shí)間為15 min，該條件下粒徑符合納米載體制備要求，同時(shí)能為后續(xù)的載體修飾留有足夠的空間。

2.3 DA 濃度及反應(yīng)時(shí)間對(duì)CuS-PDA 的粒徑的影響

為了優(yōu)化CuS-PDA 載體的粒徑大小，分別考察不同濃度DA 及聚合時(shí)間對(duì)于CuS-PDA 粒徑的影響。從圖2C 中可見(jiàn)，當(dāng)DA 濃度逐漸增大時(shí)，CuSPDA 粒徑呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DA濃度為20 μg/mL 時(shí)，CuS-PDA 粒徑僅為（195.7±15.80）nm，在該濃度下制備的載體不僅具有納米級(jí)結(jié)構(gòu)，并且具備良好的光熱效應(yīng)。明確DA 最佳濃度后，考察聚合時(shí)間對(duì)于CuS-PDA 粒徑的影響，從圖2D 中可以觀察到，隨著聚合時(shí)間的增加，粒徑逐漸增大，當(dāng)聚合時(shí)間為4 h 時(shí)，載體粒徑為（212.50±7.81）nm，分散系數(shù)為0.121±0.013，該粒徑符合納米載藥體系的制備要求。

2.4 PAA 濃度及反應(yīng)時(shí)間對(duì)CuS-PDA-PAA 的粒徑的影響

確定CuS-PDA 最佳制備條件后，考察PAA 濃度及反應(yīng)時(shí)間對(duì)于CuS-PDA-PAA 粒徑的影響。結(jié)果見(jiàn)圖2E，隨著PAA 濃度的增加，載體粒徑逐漸增大，當(dāng)PAA 濃度為80 μg/mL 時(shí)，可以觀察到納米粒徑逐漸趨于平穩(wěn)，粒徑為（271.60±8.15）nm。明確PAA 最佳濃度后，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)于粒徑的影響，結(jié)果如圖2F，從圖中可以觀察到，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，粒徑呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，為了確保所制備的納米載體符合要求，并具有良好的治療效果，本實(shí)驗(yàn)采用反應(yīng)時(shí)間為6 h，此時(shí)的粒徑為（253.90±4.76）nm，分散系數(shù)為0.128±0.009，該反應(yīng)條件下可以制備出粒徑合適的納米載體。

2.5 粒徑分布及Zeta電位分析

在上述最優(yōu)制備條件下，通過(guò)激光粒度儀檢測(cè)各載體的粒徑及Zeta 電位。結(jié)果如圖3 所示，隨著各載體的逐級(jí)修飾，納米載體粒徑和電位發(fā)生了明顯的變化，粒徑逐漸增大，電位絕對(duì)值也逐漸增大，可以證明各載體之間成功連接。同時(shí)也可以觀察到三種載體材料均帶負(fù)電荷，電位絕對(duì)值隨著功能分子的逐步修飾而逐漸變大（圖3B），可以證明CuS-PDA-PAA的成功制備。

2.6 納米載體穩(wěn)定性考察

從圖3B可以觀察到，本實(shí)驗(yàn)制備的納米載體具有強(qiáng)電負(fù)性，絕對(duì)值較高，可以推測(cè)出該載體具有良好的穩(wěn)定性。如圖4 所示，在4 ℃條件下，CuSPDA-PAA 在水中分散性良好，在5 d 內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)聚沉，在10 d 內(nèi)僅出現(xiàn)部分沉淀；CuS-PDA-PAA 在PBS 中分散良好，在考察的21 d 中分散液未出現(xiàn)聚沉及變質(zhì)現(xiàn)象；分散液于DMEM 培養(yǎng)基中保存時(shí)，在第10 天僅出現(xiàn)少量聚沉，于培養(yǎng)基中性質(zhì)穩(wěn)定。在25 ℃條件下，CuS-PDA-PAA 在水中分散性良好，在5 d 內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)聚沉，在10 d 內(nèi)出現(xiàn)少量沉淀；CuS-PDA-PAA 在PBS 中分散良好，可以觀察到在10 d 時(shí)出現(xiàn)沉淀，穩(wěn)定性良好；當(dāng)CuS-PDA-PAA 載體于DMEM 中保存，10 d 內(nèi)出現(xiàn)部分沉淀，均呈現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。綜上結(jié)果分析說(shuō)明該載體在PBS溶液中4 ℃條件下分散性良好，至少能穩(wěn)定儲(chǔ)存大于21 d。

圖2 優(yōu)化納米材料的制備條件

圖3 載體的粒徑和Zeta電位

圖4 載體在不同介質(zhì)中的穩(wěn)定性考察

3 討論

抗腫瘤納米藥物是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，這是因?yàn)榧{米藥物制劑能夠增加藥物體內(nèi)循環(huán)時(shí)間、可控釋放以及靶向輸運(yùn)，使納米藥物被腫瘤細(xì)胞有效地?cái)z取，從而提高治療效果。目前常用的納米載體材料包括金屬及氧化物納米顆粒（如金納米粒、氧化鐵等）、無(wú)機(jī)非金屬納米材料如二氧化硅、生物高分子材料如殼聚糖、明膠、PAA 等，以及生物大分子顆粒（如脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)等），這些納米材料可以通過(guò)功能化的修飾形成多模式的治療策略（如光熱、光動(dòng)力學(xué)、化學(xué)動(dòng)力學(xué)等），在多種治療模式中，光熱治療是一種效果比較顯著的方法。其中，光熱治療聯(lián)合化療可以在一定程度上減少化療藥物的用量從而降低藥物的毒副作用；另一方面，可以抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性，最終實(shí)現(xiàn)協(xié)同抗腫瘤作用。目前報(bào)道的光熱納米材料有MoS2、石墨烯、金屬納米粒、CuS等。

納米載體的粒徑是影響納米藥物性能的關(guān)鍵因素之一。粒徑過(guò)大，難以被腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞；粒徑太小，則容易被正常的防御細(xì)胞（如單核巨噬細(xì)胞）清除。其中，分散系數(shù)是衡量納米載體粒徑均勻度的重要指標(biāo)，分散系數(shù)范圍在0～1；數(shù)值越小，表明粒子尺寸分布寬度越窄。一般認(rèn)為分散系數(shù)小于0.2時(shí)，該載體具有良好的分散度。

載體材料分散穩(wěn)定性的另一個(gè)重要指標(biāo)是Zeta電位，直接影響材料在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間以及腫瘤細(xì)胞的攝取速率等。Zeta 電位為負(fù)值時(shí)，可以增加納米載體在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，并且數(shù)值越大，納米載體越穩(wěn)定?？紤]到本研究制備的納米載體是多步組裝和修飾獲得的，因此對(duì)每一步中間載體材料進(jìn)行考察和優(yōu)化。

本實(shí)驗(yàn)制備了一種穩(wěn)定的具有光熱/pH 雙響應(yīng)的核—?dú)そY(jié)構(gòu)納米載藥體系（CuS-PDA-PAA）。采用UV-vis、FT-IR、XPS 和TEM 等手段進(jìn)行表征，可以證明各載體被成功制備。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)考察載體制備條件，得到最佳制備條件為：CuS 的濃度為100 μg/mL，超聲時(shí)間為15 min；DA 的濃度為20 μg/mL，反應(yīng)時(shí)間為4 h；PAA 的用量為80 μg/mL，反應(yīng)時(shí)間為6 h，最終得到粒徑為（253.90±4.76）nm，分散系數(shù)為0.128±0.009的載藥體系。首先，該載體帶有負(fù)電荷，可以通過(guò)靜電吸附作用與帶正電荷的抗腫瘤藥物（如阿霉素）結(jié)合，從而達(dá)到裝載藥物的效應(yīng)，并且其電位絕對(duì)值較大，可以裝載大量的堿性抗腫瘤藥物，從而提高治療效果。其次，該載體中的CuS和PDA 均具有光熱效應(yīng)，兩種光熱材料的聯(lián)合，可以增加光熱治療效應(yīng)。最后，PAA 具有良好的pH響應(yīng)性，在腫瘤微酸環(huán)境下，可以將抗腫瘤藥物釋放，而在正常的組織器官中幾乎不釋放，從而實(shí)現(xiàn)藥物的控制釋放和精準(zhǔn)治療，減少抗腫瘤藥物的不良反應(yīng)和毒副作用。從穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)可以看出，該載體在4 ℃條件下，可以穩(wěn)定保存至少21 d，穩(wěn)定性能良好，為構(gòu)建集光熱效應(yīng)和pH 響應(yīng)于一體的抗腫瘤納米載藥復(fù)合體系藥物提供一定的研究基礎(chǔ)。