應(yīng)用種特異性ITS引物（SS-ITS）鑒別新菠蘿灰粉蚧

徐淼鋒 閆邦奇 管維 廖力 蔡波 李惠萍

摘要?[目的]研究新菠蘿灰粉蚧的種特異性ITS引物，以快速準(zhǔn)確鑒定該蟲(chóng)，可為口岸快速通關(guān)提供依據(jù)。[方法]采用PCR擴(kuò)增方法，首次測(cè)定分析了11?種粉蚧39?個(gè)樣品的新菠蘿灰粉蚧及其他粉蚧的rDNA?ITS全序列?；贗TS區(qū)序列差異設(shè)計(jì)了針對(duì)新菠蘿灰粉蚧的特異性引物，通過(guò)篩選引物退火溫度、優(yōu)化PCR反應(yīng)條件建立了新菠蘿灰粉蚧的快速分子鑒定方法。[結(jié)果]種特異性ITS引物只對(duì)新菠蘿灰粉蚧有擴(kuò)增條帶，能有效擴(kuò)增出約665?bp的DNA片段，其余種類(lèi)均未有擴(kuò)增條帶。靈敏度試驗(yàn)結(jié)果顯示該對(duì)引物靈敏度高，其檢測(cè)限可達(dá)0.1?ng/μL。[結(jié)論]采用設(shè)計(jì)的ITS區(qū)種特異性引物可以對(duì)新菠蘿灰粉蚧進(jìn)行快速分子鑒定，該方法可為口岸一線(xiàn)檢測(cè)鑒定提供參考。

關(guān)鍵詞?新菠蘿灰粉蚧;?分子鑒定;?核糖體DNA

中圖分類(lèi)號(hào)?S41;Q96?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2021）03-0137-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.03.037

Abstract?[Objective]The?speciesspecific?ITS?primer?for?D.neobrevipes?was?studied?to?rapidly?and?accurately?identify?the?pests，which?can?provide?the?basis?for?the?port?customs?clearance.[Method]The?complete?fragments?of?rDNA?ITS?were?sequenced?by?universal?primer?PCR?amplification?method?for?39?samples?of?eleven?species?including?D.neobrevipes?and?other?mealybugs.Speciesspecific?primer?of?D.neobrevipes?was?designed?based?on?sequences?variation?of?rDNA?ITS?among?the?eleven?mealybugs.A?rapid?molecular?identification?method?for?D.neobrevipes?was?established?by?screening?primer?annealing?temperature?and?optimizing?PCR?reaction?conditions.[Result]?The?ITS?speciesspecific?primers?only?amplified?the?band?of?D.neobrevipes，and?could?effectively?amplify?DNA?fragments?of?about?665?bp.And?the?other?species?did?not?have?amplified?bands.The?sensitivity?test?results?showed?that?the?primer?had?high?sensitivity?and?the?detection?reached?to?0.1?ng/μL.[Conclusion]The?rapid?molecular?identification?for?D.neobrevipes?using?the?ITS?speciesspecific?primers?designed?in?this?paper?is?feasible.This?method?provides?reference?for?the?detection?and?identification?of?the?port.

Key?words?Dysmicoccus?neobrevipes;Molecular?identification;Ribosome?rDNA

新菠蘿灰粉蚧（Dysmicoccus?neobrevipes?Beardsley）隸屬半翅目（Hemiptera）粉蚧科（Pseudococcidae）灰粉蚧屬（Dysmicoccus），為我國(guó)禁止進(jìn)境植物檢疫性有害生物，嚴(yán)重危害多種水果和觀賞植物，是具有重要經(jīng)濟(jì)意義的害蟲(chóng)[1-3]。該蟲(chóng)與近似種菠蘿灰粉蚧（D.brevipes）在形態(tài)特征、寄主植物及分布區(qū)域等方面都極為相似。近年來(lái)，我國(guó)從菲律賓、越南、泰國(guó)、印度尼西亞、韓國(guó)、柬埔寨、馬來(lái)西亞和我國(guó)臺(tái)灣等地進(jìn)口的菠蘿、菠蘿蜜、香蕉、龍眼、榴蓮、番荔枝和山竹等寄主上截獲過(guò)以上2種粉蚧[4]，據(jù)統(tǒng)計(jì)在2005—2017年，共截獲3?111?批次新菠蘿灰粉蚧和2?392?批次菠蘿灰粉蚧。目前，新菠蘿灰粉蚧在我國(guó)海南和廣東有危害報(bào)道，且呈急劇蔓延擴(kuò)散趨勢(shì)[2]。傅遼等[5]根據(jù)CLIMEX?3.0與ArcGIS?9.3結(jié)合的方法分析了新菠蘿灰粉蚧在我國(guó)目前以及未來(lái)的潛在地理分布，發(fā)現(xiàn)該蟲(chóng)在我國(guó)包括海南、廣東、廣西、云南、福建、臺(tái)灣等地高度適生。由于粉蚧蟲(chóng)體小、體覆蓋白色蠟粉、身體為膜狀結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)，其鑒定十分依賴(lài)雌成蟲(chóng)玻片制作的好壞及微觀特征識(shí)別，這些往往需要經(jīng)驗(yàn)豐富的專(zhuān)業(yè)人員才能做到。因此研究該蟲(chóng)的準(zhǔn)確、快速鑒定可有效防止新菠蘿灰粉蚧新的傳入和擴(kuò)散。

據(jù)報(bào)道，同一物種的核糖體DNA（rDNA）序列高度保守，無(wú)明顯的變異，而種間的rDNA序列具有高度變異性，因此，rDNA常作為昆蟲(chóng)等生物的分子標(biāo)記基因用于種類(lèi)的快速鑒定[6-7]。rDNA由編碼區(qū)和非編碼區(qū)組成，非編碼區(qū)序列種間差異較大，因此，常在18S、5.8S和28S編碼區(qū)之間的核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的ITS1和ITS2區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物用于種類(lèi)的快速鑒定。據(jù)記載，ITS?區(qū)序列被廣泛應(yīng)用于雙翅目、膜翅目昆蟲(chóng)種下分類(lèi)和近緣種鑒別[8-9];?Park等[10]通過(guò)分析粉蚧ITS區(qū)，設(shè)計(jì)特異性引物用于區(qū)分危害韓國(guó)產(chǎn)雪梨上的6?種粉蚧。Beuning等[11]基于分析ITS區(qū)差異序列，設(shè)計(jì)常規(guī)PCR引物，可特異區(qū)分新西蘭常見(jiàn)的4?種粉蚧。筆者嘗試基于rDNA?ITS序列特征差異設(shè)計(jì)種特異性引物建立針對(duì)新菠蘿灰粉蚧的分子快速檢測(cè)方法，為該蟲(chóng)的快速鑒定提供參考。

1?材料與方法

1.1?供試蟲(chóng)源?所用材料為2014—2017年珠?？诎都昂？诳诎哆M(jìn)境水果上截獲的粉蚧樣本，共11?種36?個(gè)樣品。所有標(biāo)本用無(wú)水乙醇浸泡并保存于-20?℃冰箱中供試驗(yàn)用。試驗(yàn)樣本基本信息見(jiàn)表1。

1.2?DNA提取

粉蚧類(lèi)昆蟲(chóng)DNA提取參照廖力等[12]的方法并稍加改進(jìn)。將單頭供試新鮮蟲(chóng)樣置于200?μL離心管中（如經(jīng)乙醇浸泡，需要用0.9%?NaCl溶液洗滌3?h以上），加入60?μL提取液A?（含1%?SDS，50?mmol/L?TrisHCl，25?mmol/L?NaCl，25?mmol/L?EDTA），用研磨棒搗碎樣品，振蕩混勻后于65?℃孵育45?min?（中途混勻2次）;孵化結(jié)束后，加入等體積提取液B?[3?mol/L?KAC（pH?7.2）]，緩慢上下顛倒混勻后于冰上放置1?h;取出后，于4?℃、12?000?r/min離心10?min，取上清液移入新的500?μL離心管中，加入2倍體積冷凍無(wú)水乙醇，輕輕混勻后置于-20?℃冰箱1?h;取出后，于4?℃、12?000?r/min?離心10?min，小心棄去上清液，加入500?μL?75%乙醇洗滌沉淀，于4?℃、12?000?r/min離心10?min，小心棄去上清液。然后將離心管倒扣于潔凈的濾紙上，自然晾干20?min后，每管加入50?μL?dd?H2O充分溶解，DNA溶液用Nano?Drop?1000微量分光光度計(jì)測(cè)定核酸質(zhì)量和濃度，于-20?℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3?粉蚧類(lèi)昆蟲(chóng)ITS序列PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定

粉蚧類(lèi)昆蟲(chóng)的ITS全序列PCR擴(kuò)增通用引物（ITSF/ITSR）參照徐淼鋒等[7]，分別為上游引物ITS?F的堿基序列為5′-AGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′，下游引物ITS?R的堿基序列為5′-TATGCTTAAATTCGGCGGGTGA-3′。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。然后，以新菠蘿灰粉蚧、菠蘿灰粉蚧等11種我國(guó)口岸常截獲的粉蚧類(lèi)害蟲(chóng)成蟲(chóng)DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為30?μL，每體系分別加入15?μL?2×PCR緩沖液（含dNTP混合液，Mg2+）、上下游引物各1.2?μL?（10?μmol/mL）、Taq?DNA聚合酶0.6?μL?（1.25?U/μL），最后加ddH2O補(bǔ)充至總體積為28?μL，再加2?μL?DNA模板，體系配好后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94?℃預(yù)變性1?min;?35個(gè)循環(huán)為98?℃?變性10?s、62?℃退火30?s、72?℃延伸30?s;最后72?℃延伸5?min，結(jié)束后產(chǎn)物于4?℃冰箱保存。反應(yīng)試劑購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）。

電泳及測(cè)序：取5?μL?PCR產(chǎn)物，加1?μL?6×上樣緩沖液（Loading?Buffer），在?1%瓊脂糖凝膠上以90?V電泳?（電泳液為1×TAE）?分離45?min，以BioRad?GelDoc?XR凝膠成像系統(tǒng)分析電泳結(jié)果。對(duì)經(jīng)電泳檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司和天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司協(xié)助完成。

1.4?新菠蘿灰粉蚧特異性SS-ITS引物的設(shè)計(jì)及退火溫度篩選

根據(jù)新菠蘿灰粉蚧及其他10?個(gè)種類(lèi)共36?個(gè)樣本的ITS測(cè)序結(jié)果，通過(guò)MEGA6.0[13]比對(duì)分析序列差異性，采用Primer?primer?6軟件設(shè)計(jì)新菠蘿灰粉蚧SS-ITS引物1對(duì)（ITS?Dn260F/?ITS?Dn925R），上游引物ITS?Dn260F的堿基序列為5′-CAAGTCGCCGTATCGAGTAC-3′，下游引物ITS?Dn925R的堿基序列為5′-?CGGCGAGGTATCTACTGCT?-3′。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。用新菠蘿灰粉蚧（5025786）基因組DNA為模板，對(duì)新菠蘿灰粉蚧種特異性SS-ITS引物進(jìn)行梯度PCR反應(yīng)來(lái)摸索該對(duì)引物的最佳退火溫度，退火溫度范圍上限為平均Tm值高5?℃、下限為平均Tm值低5?℃（ITSDn260F/ITSDn925R其平均Tm值約為58?℃，則退火溫度范圍設(shè)定為53～63?℃，篩選出該對(duì)引物的最佳退火溫度為60?℃。

1.5?引物的種特異性及靈敏度檢驗(yàn)

分別以我國(guó)口岸進(jìn)境水果上常見(jiàn)的11?種粉蚧成蟲(chóng)的DNA為模板，以新菠蘿灰粉蚧為陽(yáng)性對(duì)照，檢驗(yàn)新菠蘿灰粉蚧SS-ITS引物ITS?Dn260F/?ITS?Dn925R的種特異性。PCR反應(yīng)體系為30?μL，每體系分別加入15?μL?2×PCR緩沖液（含dNTP混合液，Mg2+）、上下游引物各1.2?μL?（10?μmol/mL）、Taq?DNA聚合酶0.6?μL（1.25?U/μL），最后加ddH2O補(bǔ)充至總體積為28?μL，再加2?μL?DNA模板，體系配好后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94?℃預(yù)變性1?min;35個(gè)循環(huán)為98?℃變性10?s;?60?℃退火30?s;72?℃延伸30?s;72?℃延伸5?min;最后于4?℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法與“1.3”相同。以新菠蘿灰粉蚧成蟲(chóng)DNA為模板，稀釋6?個(gè)10?倍濃度梯度來(lái)進(jìn)行靈敏度檢驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2?結(jié)果與分析

2.1?粉蚧類(lèi)昆蟲(chóng)ITS序列PCR擴(kuò)增?以新菠蘿灰粉蚧、菠蘿灰粉蚧、暗色粉蚧、李比利氏灰粉蚧、南洋臀紋粉蚧、桔臀紋粉蚧、大洋臀紋粉蚧、榕樹(shù)粉蚧、柑棲粉蚧、日本臀紋粉蚧和杰克貝爾氏粉蚧等口岸常截獲的11?種粉蚧共36?個(gè)樣本的基因組DNA為模板，以通用型引物ITSF/ITSR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，引物ITSF/ITSR對(duì)粉蚧的ITS序列擴(kuò)增通用性較好，11?種粉蚧均能擴(kuò)增出一條清晰的目標(biāo)片段，長(zhǎng)度約在1?200?bp（圖1）。將經(jīng)電泳檢測(cè)合格的產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，結(jié)果顯示，以上11?種粉蚧的ITS區(qū)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度在1?222～1?495?bp。

2.2?新菠蘿灰粉蚧SS-ITS引物的種特異性檢驗(yàn)

以新菠蘿灰粉蚧及其他10?種粉蚧成蟲(chóng)的DNA為模板，以設(shè)計(jì)的種特異性SS-ITS引物（ITS?Dn260F/?ITS?Dn925R）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用所建立的PCR檢測(cè)體系，對(duì)新菠蘿灰粉蚧及其他種類(lèi)進(jìn)行種特異性引物檢驗(yàn)。為確保結(jié)果的可靠性，每次試驗(yàn)均重復(fù)3次。電泳結(jié)果顯示，該對(duì)引物只對(duì)新菠蘿灰粉蚧有擴(kuò)增效果，能擴(kuò)增出約665?bp的DNA片段（圖2），其余10?個(gè)種類(lèi)均未擴(kuò)增出條帶，表明該對(duì)引物為新菠蘿灰粉蚧的種特異性引物。

2.3?引物的靈敏度驗(yàn)證

利用微量分光光度計(jì)（Nanodrop?1000）測(cè)定新菠蘿灰粉蚧（5025786）的DNA濃度為102.3?ng/μL。用所建立的PCR檢測(cè)體系，以新菠蘿灰粉蚧DNA模板稀釋5?個(gè)10?倍濃度梯度的DNA模板來(lái)確定PCR反應(yīng)的檢測(cè)靈敏度，試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果顯示，模板濃度在1～100?ng/μL時(shí)，均能擴(kuò)增出強(qiáng)烈的檢測(cè)信號(hào);對(duì)于0.1?ng/μL的DNA模板，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物明顯降低，檢測(cè)信號(hào)較弱;當(dāng)DNA模板濃度為0.01?ng/μL時(shí)，由于無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物或檢測(cè)信號(hào)太弱而無(wú)法檢出。表明該方法具有較高的靈敏度，其檢測(cè)限度為0.1?ng/μL，最適檢測(cè)濃度為1～100?ng/μL（圖3）。

3?討論

粉蚧的識(shí)別一直以來(lái)是一線(xiàn)口岸鑒定的難點(diǎn)。其鑒別主要依據(jù)雌成蟲(chóng)的形態(tài)特征，而現(xiàn)場(chǎng)檢疫通常截獲的是卵和若蟲(chóng)而無(wú)法通過(guò)形態(tài)特征鑒定，即使截獲的是雌成蟲(chóng)也需要制成玻片標(biāo)本，其流程是一個(gè)繁瑣、耗時(shí)的過(guò)程。這與進(jìn)口水果的快速檢疫、快速通關(guān)的要求不符。研究表明，通過(guò)DNA條形碼技術(shù)和分子標(biāo)記技術(shù)可鑒別新菠蘿灰粉蚧。如徐浪等[14-15]采用DNA條形碼技術(shù)和線(xiàn)粒體COI基因片段差異特征對(duì)進(jìn)口水果上截獲的新菠蘿灰粉蚧及其近似種進(jìn)行了鑒別。黃蓬英等[16]應(yīng)用28S?rDNA基因區(qū)段的差異，設(shè)計(jì)了一種特異性引物用于鑒別新菠蘿灰粉蚧。該研究首次分析了珠海口岸和?？诳诎哆M(jìn)境水果上常截獲的11?種粉蚧36?個(gè)樣本的ITS區(qū)序列，通過(guò)分析新菠蘿灰粉蚧及其他種類(lèi)ITS區(qū)的序列差異，設(shè)計(jì)了新菠蘿灰粉蚧的種特異性引物，擴(kuò)增得到的特異性片段長(zhǎng)度約為665?bp。該試驗(yàn)結(jié)果表明，該對(duì)引物可成功區(qū)分新菠蘿灰粉蚧及其他常見(jiàn)種類(lèi)，靈敏度可高達(dá)0.1?ng/μL。

綜上所述，該研究建立的SS-ITS特異性引物快速鑒定新菠蘿灰粉蚧的方法具有快速簡(jiǎn)便、特異性高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，最快可在24?h內(nèi)完成新菠蘿灰粉蚧的鑒定，能夠滿(mǎn)足口岸進(jìn)境水果快速檢疫、快速通關(guān)的要求;對(duì)防止該蟲(chóng)的進(jìn)一步蔓延擴(kuò)散具有重要意義。

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