1株產(chǎn)γ-氨基丁酸菌株的分離鑒定及發(fā)酵特性研究

陳國偉 賈嬌 杜丹 解修超 耿敬章 鄧百萬

摘 要：對謝村黃酒酒曲中細菌進行分離，利用薄層層析法定性、柱前衍生高效液相色譜法定量篩選出1株產(chǎn)γ-氨基丁酸（Gama-aminobutyric，GABA）能力的菌株N1，通過對該菌株進行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗、16S rDNA序列分析鑒定，并繪制其生長曲線，研究谷氨酸鈉（L-MSG）的添加量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度等對菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA含量的影響。結(jié)果表明：經(jīng)初篩得到的菌株N1，復(fù)篩測得發(fā)酵液中GABA含量為448.6 mg·L-1。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)鑒定菌株N1為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，菌株N1在液體培養(yǎng)0～4 h處于延滯期，4～12 h處于指數(shù)期，12～16 h為穩(wěn)定期，16 h之后為衰退期; 菌株N1最適培養(yǎng)條件為發(fā)酵時間72 h、發(fā)酵溫度36℃、pH值6、接種量2%、裝液量100 mL、谷氨酸鈉添加量1%，在此條件下菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA含量可達583.5 mg·L-1。

關(guān)鍵詞：謝村黃酒酒曲;γ-氨基丁酸;分離鑒定;發(fā)酵特性

中圖分類號：Q 93-331? 文獻標(biāo)志碼：A? 文章編號：0253-2301（2021）12-0012-07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.12.003

Isolation， Identification and Fermentation Characteristics of γ-aminobutyric acid-producing Strains

CHEN Guo-wei1， JIA Jiao1， DU Dan1，3， XIE Xiu-chao1，2*， GENG Jing-zhang1， DENG Bai-wan1，2

（1. College of Biological Science and Engineering， Shaanxi University of Technology， Hanzhong， Shaanxi 723000， China;

2. Shaanxi Engineering Research Center of Edible and Medicinal Fungi， Hanzhong， Shaanxi 723000， China;

3. Xianyang Academy of Agricultural Sciences， Xianyang， Shaanxi 712000， China）

Abstract： The bacteria in the yellow rice wine koji of Xiecun were isolated， and a strain N1 which was capable of producing γ-aminobutyric acid （GABA） was quantitatively screened by using the methods of thin layer chromatography and precolumn derivatization high performance liquid chromatography. The morphological observation， physiological and biochemical tests， 16S rDNA sequence analysis and identification of the strain were carried out， and its growth curve was plotted， in order to study the effects of the addition amount of sodium glutamate （L-MSG）， fermentation time and temperature on the content of GABA produced by the strain N1. The results showed that the content of GABA in the fermentation broth was 448.6 mg·L-1 after the initial screening. Combined with the identification of morphology， physiology， biochemistry and molecular biology， the strain was identified as Bacillus subtilis. The strain was in the lag phase from 0 to 4 h after the liquid culture， the exponential phase from 4 to 12 h， the stable phase from 12 to 16 h， and the decline phase after 16 h. The optimum culture conditions for the strain N1 were as follows： fermentation time 72 h， fermentation temperature 36℃， pH value 6， inoculation amount 2%， liquid volume 100 mL， and sodium glutamate 1%. Under these conditions， the content of GABA produced by the strain N1 could reach 583.5 mg·L-1.

Key words： Yellow rice wine koji of Xiecun; γ-aminobutyric acid; Isolation and identification; Fermentation characteristics

黃酒（Huangjiu）源于中國，是世界三大釀造酒之一，被譽為“液體面包”[1-3]，具有悠久的文化歷史，是我國古代禮儀的象征[4]。謝村黃酒產(chǎn)自陜西省漢中市洋縣，起源于上古夏商時期，民間有“南有紹興加飯，北有謝村黃酒”之說，謝村黃酒是一種具有營養(yǎng)保健功能的發(fā)酵型低酒精度酒，2010年已被納入陜西省第一批非物質(zhì)文化遺產(chǎn)[5]。據(jù)鑒定，謝村黃酒富含17種人體必需氨基酸，總含量高達115633.66 mg·L-1，比啤酒高11倍，比紅葡萄酒高8倍，比紹興加飯酒高出1倍多[6]?！扒鸀榫浦恰盵7-8]，酒曲作為酒中產(chǎn)生各種風(fēng)味物質(zhì)的動力源泉，其中微生物起到重要作用，微生物之間存在著共生、互生、寄生、拮抗的作用，在麥曲傳統(tǒng)制作工藝中，微生物逐漸形成一個復(fù)雜并與環(huán)境相適應(yīng)的微生物區(qū)系，決定著黃酒的品質(zhì)[9]。我國目前對黃酒研究仍然停留在生理效應(yīng)和活性物質(zhì)，對于酒曲研究主要集中于微生物產(chǎn)酶，功能活性成分γ-氨基丁酸（GABA）的研究較少，因此本研究對于黃酒中的新型功能因子GABA的研究有潛在應(yīng)用價值。

γ-氨基丁酸（GABA）是非蛋白組織氨基酸，產(chǎn)生機理是由前體物質(zhì)谷氨酸（L-glu）或谷氨酸鈉（L-MSG）經(jīng)谷氨酸脫羧酶（GAD）催化作用產(chǎn)而來，是動物神經(jīng)中樞系統(tǒng)的主要抑制性遞質(zhì)[10]。GABA具有舒降血壓、調(diào)節(jié)抗心律失常[11-12]、抗驚厥、鎮(zhèn)痛[13-15]等功能。2009年被國家衛(wèi)生部配準(zhǔn)為新資源食品，成為研究的熱門。謝廣發(fā)等[16]研究發(fā)現(xiàn)我國的古越龍山紹興黃酒中GABA含量達167～360 g·L-1;龔金炎等[17]從黃酒浸米液中篩選出產(chǎn)GABA植物乳桿菌，測得其發(fā)酵液中GABA濃度為1.02 g·L-1。本研究通過對謝村黃酒酒曲中分離的細菌，采用薄層層析法初篩定性和高效液相復(fù)篩定量，并對菌株N1進行鑒定及其發(fā)酵特性初步研究，探討菌株N1在不同條件下的發(fā)酵能力，旨在為菌株N1用于生產(chǎn)GABA的研究提供科學(xué)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料 黃酒酒曲，由陜西秦洋長生酒業(yè)有限公司提供。

1.1.2 儀器設(shè)備 電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，BSA8201）、生化培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，SPX25085HH）、顯微鏡（上海普赫興電科技有限公司，奧林巴斯CX22）、PCR擴增儀（上海恒久醫(yī)療器械有限公司，TA40英國Techne）、電泳儀（上海天能科技有限公司，TANOAEPS30）、高效液相色譜儀（廣東科曉分析儀器公司，Agilent HPLC1220）。1.1.3 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂15.0 g，pH自然，蒸餾水1000 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g、酵母膏10.0 g、蛋白胨5.0 g、硝酸鈉3.0 g、七水硫酸鎂0.02 g、硫酸錳0.001 g、氯化鈉0.001 g、七水硫酸亞鐵0.001 g、10 g L-MSG、pH 6.0。

其他培養(yǎng)基：甲基紅試驗培養(yǎng)基、V-P試驗培養(yǎng)基等配制方法參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[18]。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃酒酒曲中細菌的分離 酒曲樣本放在滅菌的研缽中粉碎，37℃、140 min振蕩30 min，稀釋涂布平板，37℃恒溫培養(yǎng)。觀察并挑取單菌落多次劃線純化，純化后的平板備用，菌液于50%甘油Ep管保藏。

1.2.2 產(chǎn)GABA菌株的篩選

（1）產(chǎn)GABA菌株的初篩。薄層層析法測定見參考文獻[19] 。①發(fā)酵培養(yǎng)：以3%的接種量轉(zhuǎn)接100 mL（250 mL三角瓶）發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、140 r·min-1搖瓶振蕩發(fā)酵72 h。②發(fā)酵液處理：吸取2 mL發(fā)酵液于EP管，1000 r·min-1 4℃離心5 min，取上清液待測。③硅膠板的活化：硅膠板于烘箱105℃活化1.5 h，待用。④展開劑擴散層析缸：將展開劑倒入層析缸底部1 cm，蓋上玻璃蓋，靜置1 h。⑤點樣、層析、顯色：以1 mg·mL-1 GABA標(biāo)準(zhǔn)液和L-MSG標(biāo)準(zhǔn)液為對照，取10 μL發(fā)酵上清液，迅速點樣后吹干層析，待溶劑擴散至硅膠板上1～2 cm處取出，立即噴顯色劑置于85℃烘箱顯色15 min。

（2）產(chǎn)GABA菌株的復(fù)篩。PITC柱前衍生化法高效液相測定參照QB/T 4356-2012《黃酒中游離氨基酸的測定 高效液相色譜法》[20]。①發(fā)酵液處理：同薄層層析法的處理方法相同，得到發(fā)酵上清液即為樣品原液。②樣品衍生化、萃取、標(biāo)準(zhǔn)工作液衍生。③GABA標(biāo)品波長掃描：配置不同梯度GABA標(biāo)品液，衍生化后進行紫外分光光度計全波長掃描，確定最終檢測波長。④色譜條件：檢測波長為掃描波長。⑤標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制。⑥測定：進樣量10 μL，以峰面積為y軸，濃度為x軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 產(chǎn)GABA菌株的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)觀察 觀察37℃培養(yǎng)條件下的形態(tài)特征，包括邊緣、顏色和透明度等，用革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)和大小[21]。

（2）細菌生理生化試驗 甲基紅試驗（M.R）、V-P試驗、檸檬酸鹽試驗等參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[18]。

（3）分子生物學(xué)鑒定 水煮法提取細菌基因組，采用細菌通用引物1492r（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）和27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）擴增目的片段，PCR擴增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，33個循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后測序，測序結(jié)果整理后提交進行BLAST比對，利用Mega 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 目標(biāo)菌株的特性初步研究

1.3.1 目標(biāo)菌株的生長曲線 經(jīng)篩選鑒定得到的菌株為目標(biāo)菌株N1，用無菌槍頭取適量菌株N1接種于50 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、140 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)，每2 h測定OD600值[22]，并繪制生長曲線。

1.3.2 發(fā)酵條件對目標(biāo)菌株產(chǎn)GABA的影響

（1）谷氨酸鈉（L-MSG）添加量對菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA含量的影響 L-MSG是產(chǎn)生GABA的前體物質(zhì)，取活化后的菌液分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測定發(fā)酵液GABA含量，確定最佳添加量。

（2）發(fā)酵時間對菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA含量的影響 將種子液按3%的接種量接種于最優(yōu)谷氨酸鈉添加量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，37℃，140 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)24、48、72、84、96 h，測定發(fā)酵液GABA含量，確定最佳發(fā)酵時間。

（3）發(fā)酵溫度對菌株發(fā)酵N1產(chǎn)GABA含量的影響 將種子液接種于最優(yōu)谷氨酸鈉添加量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別置于溫度28℃、32℃、36℃、40℃、44℃條件下，140 r·min-1振蕩培養(yǎng)72 h，測定發(fā)酵液GABA含量，確定最佳發(fā)酵溫度。

（4）初始pH對菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA含量的影響 將種子液接種于最優(yōu)谷氨酸鈉添加量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，初始pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，140 r·min-1振蕩培養(yǎng)72 h，測定發(fā)酵液GABA含量，確定最佳pH。

（5）裝液量對菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA含量的影響 將種子液接種于最優(yōu)谷氨酸鈉添加量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，裝液量為25、50、100、150、200、250 mL，140 r·min-1振蕩培養(yǎng)72 h，測定發(fā)酵液GABA含量，確定最佳裝液量。

（6）接種量對菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA含量的影響 將種子液接種于最優(yōu)谷氨酸鈉添加量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接種量為1%、2%、3%、4%、5%，140 r·min-1振蕩培養(yǎng)72 h，測定發(fā)酵液GABA含量，確定最佳接種量。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒酒曲細菌分離

稀釋涂布、劃線法對黃酒酒曲樣品進行單菌落分離，4℃平板保藏和50%甘油保藏，便于后續(xù)試驗。

2.2 產(chǎn)GABA菌株N1篩選

2.2.1 產(chǎn)GABA菌株N1的初篩結(jié)果 菌株的發(fā)酵液離心后，進行薄層層析法初篩，其中N1菌株可利用1%L-MSG生成GABA（圖1）。由圖1可知，N1菌株發(fā)酵液與標(biāo)液有一致的顯色位置，顯色較深，初步篩選出其具有產(chǎn)GABA的能力。

2.2.2 產(chǎn)GABA菌株N1的復(fù)篩結(jié)果 發(fā)酵液與標(biāo)品GABA衍生化處理后，對衍生樣品進行波長掃描，確定波長為254 nm，通過各濃度GABA衍生物測定結(jié)果比對分析，確定GABA保留時間為5.132 min，測定結(jié)果見圖2和圖3，以出峰面積為y軸，濃度為x軸，得到GABA濃度在0～80 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=12.522x-13.068（R2=0.9992），曲線有較好的線性相關(guān)關(guān)系。

通過比對發(fā)現(xiàn)，初篩菌株的發(fā)酵液樣品在相同時間出現(xiàn)峰值。經(jīng)計算發(fā)酵液中GABA含量為448.6 mg·L-1，將其確定為目標(biāo)菌株進行后續(xù)特性研究。

2.3 產(chǎn)GABA目標(biāo)菌株N1的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)特征鑒定 牛肉膏蛋白胨平板上生長的菌株表面褶皺無光澤，邊緣微凸不整齊并向四周蔓延，顏色乳白色，濕潤不透明，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢為紫色短桿狀，陽性桿菌（圖4）。

2.3.2 生理生化試驗鑒定結(jié)果 參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[18]對比試驗結(jié)果，并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，初步鑒定N1為芽孢桿菌屬，試驗結(jié)果見表2。

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定 以菌株N1總DNA為模板，經(jīng)PCR擴增并檢測合格后送至生工生物工程（上海）股份有限責(zé)任公司測序，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。最終鑒定菌株N1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.4 菌株N1生長特性

由圖6可知，菌株0～4 h為延滯期，4～12 h為指數(shù)期，12～16 h為穩(wěn)定期且時間較短，16 h之后進入衰退期，70 h后大部分菌株死亡菌體釋放，菌株在該培養(yǎng)基上有一定特異性，此后試驗均以對數(shù)期為研究對象。

2.5 不同發(fā)酵條件對菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA的影響

2.5.1 谷氨酸鈉（L-MSG）添加量對菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA含量的影響 前體L-MSG可在谷氨酸脫羧酶存在條件下催化生產(chǎn)GABA[23]。由圖7可知，添加0～4%的L-MSG發(fā)酵液均可產(chǎn)GABA，添加量為1%時GABA濃度最高，為538 mg·L-1，超過1%時會略有下降，不添加L-MSG的空白發(fā)酵液中有少量GABA，可能與基礎(chǔ)培養(yǎng)基

成分有關(guān)。

2.5.2 發(fā)酵時間對菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA含量的影響 發(fā)酵時間的長短直接影響微生物的代謝產(chǎn)物量。由圖8可知，發(fā)酵72 h時GABA含量最高，此后略有下降，說明該菌株在穩(wěn)定期和衰退期會產(chǎn)生酶催化前體物質(zhì)合成GABA，故確定菌株N1的最佳發(fā)酵時間為72 h。并推測該酶為谷氨酸脫羧酶。

2.5.3 發(fā)酵溫度對菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA含量的影響 溫度是影響微生物生長代謝的重要因素。由圖9可知，N1菌株最適宜的發(fā)酵溫度在 36～44℃，在此區(qū)間產(chǎn)GABA的能力較強，40℃時達到最大。因此，考慮后繼試驗條件將36℃作為發(fā)酵溫度。

2.5.4 初始pH對菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA含量的影響 初始pH不同的培養(yǎng)基會反應(yīng)菌株對酸堿度的生長耐受情況。由圖10可知，在pH 5.5～6.0，GABA含量隨pH的升高而增加，pH 6.0時最高，為564 mg·L-1，之后隨pH升高而降低，由于酒曲微生物實際所處環(huán)境偏弱酸性，因此推測菌株可在弱酸性環(huán)境穩(wěn)定生產(chǎn)GABA。

2.5.5 裝液量對菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA含量的影響 不同微生物對氧氣的需求量不同，對于需氧菌來說，溶氧量對發(fā)酵產(chǎn)物有著直接影響。以 250 mL 三角瓶中不同裝液量來考察溶氧量對菌株N1發(fā)酵GABA的影響。由圖11可知，隨著裝液量的增加GABA含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，裝液量為100 mL時GABA含量最大，為583.5 mg·L-1，溶氧量較少時對菌株生長產(chǎn)生影響，導(dǎo)致自身產(chǎn)酶較少，從而影響產(chǎn)GABA的能力。

2.5.6 接種量對菌株發(fā)酵產(chǎn)GABA含量的影響 接種量的多少可影響發(fā)酵液中的活菌量。由圖12可知，隨著接種量的增加發(fā)酵液中GABA含量先增加后減小，但接種量對GABA產(chǎn)量整體影響較小。因此，以2%接種量作為發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳接種量。

3 結(jié)論

GABA作為新型功能因子，神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)，具有降血壓、治療精神性疾病、促進睡眠等多種生理功能[24-25]。羅少華等[26]利用大腸桿菌制備γ-氨基丁酸并應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，但大腸桿菌會產(chǎn)生內(nèi)毒素，在安全性方面存在爭議?？莶菅挎邨U菌是一種發(fā)酵過程中無內(nèi)毒素產(chǎn)生的食品級微生物，獲得美國FDA資格認證[27]，是酒曲中的優(yōu)勢菌，產(chǎn)蛋白酶和糖化酶優(yōu)勢明顯并與黃酒風(fēng)味物質(zhì)密切相關(guān)[28]。因此，本研究利用枯草芽孢桿菌代謝生產(chǎn)GABA應(yīng)用于黃酒和其他發(fā)酵食品行業(yè)的思路可行，研究并利用該微生物的特性，在后期生產(chǎn)富含GABA食品中具有潛在價值。

本研究通過從謝村黃酒酒曲中分離、篩選得到的1株產(chǎn)GABA能力的菌株N1，經(jīng)初篩定性和復(fù)篩定量測得發(fā)酵液GABA含量達448.6 mg·L-1，經(jīng)過形態(tài)學(xué)、生理生化試驗、分子生物學(xué)鑒定確定菌株N1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）;生長曲線表明該菌株在液體培養(yǎng)基0～4 h為延滯期，4～12 h為指數(shù)期，12～16 h為穩(wěn)定期，16 h之后為衰退期。發(fā)酵特性試驗結(jié)果顯示，菌株N1最適發(fā)酵條件為pH 6.0、發(fā)酵溫度37℃、裝液量100 mL、發(fā)酵時間72 h，谷氨酸鈉添加量1%，接種量2%。在此條件下菌株N1發(fā)酵液產(chǎn)GABA含量為583.5 mg·L-1。本試驗結(jié)果表明，菌株N1不僅能直接發(fā)酵代謝生產(chǎn)富含GABA的黃酒，還能間接發(fā)酵代謝產(chǎn)酶促進GABA的生產(chǎn)，研究結(jié)果可為開發(fā)富含GABA黃酒或其他功能食品提供參考依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：林玲娜）

收稿日期：2021-11-28

作者簡介：陳國偉，男，1995年生，在讀碩士研究生，主要從事微生物資源保育及應(yīng)用開發(fā)研究。

通信作者：解修超，男，1982年生，博士，副教授，主要從事微生物資源開發(fā)與利用研究（E-mail：xiexiuchao@126.com）。

基金項目：陜西省重點研發(fā)計劃（2019NY-134）;陜西省教育廳2020年服務(wù)地方專項科學(xué)研究計劃（20JC010）。