原因不明復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者血清IL-10 水平變化及其與miR-513c-5p的調(diào)控關(guān)系

尹紅，魏然，張振，朱肖肖，郭強(qiáng)，褚楚，付笑笑，趙霖，李霞

1 山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南250062；

2 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)（RSA）是指與同一配偶發(fā)生兩次或兩次以上的自然流產(chǎn)，發(fā)病率為1%～5%，嚴(yán)重威脅女性生殖健康［1-2］。近50%的RSA 病因是未知的，被稱為原因不明復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)（URSA）。從免疫學(xué)角度認(rèn)為，正常妊娠類似于成功的同種異體移植，如果免疫耐受狀態(tài)被破壞將導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生［3-4］。隨著生殖免疫學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞因子在維持正常妊娠過程中發(fā)揮的作用備受關(guān)注。白細(xì)胞介素10（IL-10）是體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及誘導(dǎo)免疫耐受過程中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，URSA 患者血清IL-10 水平低于正常妊娠婦女，提示IL-10 可能參與了URSA 的發(fā)生，但導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因尚不清楚。微小RNA（miRNA）是一種內(nèi)源性非編碼RNA，可通過與mRNA 的3"非翻譯區(qū)（3"UTR）結(jié)合以調(diào)控靶基因表達(dá)與功能，從而參與增殖、凋亡等多個(gè)生理過程。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 參與了URSA 發(fā)生與發(fā)展，但尚不清楚其是否可通過調(diào)控IL-10 參與URSA 的發(fā)生。本研究通過檢測(cè)URSA 患者外周血IL-10 及miR-513c-5p 水平變化，結(jié)合體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探討miR-513c-5p對(duì)IL-10是否存在調(diào)控作用，從生殖免疫調(diào)控角度探究URSA 發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供新的靶點(diǎn)與依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 將2019 年1 月—2020 年1 月山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院婦產(chǎn)科病房及門診就診的URSA 患者和正常早孕婦女作為研究對(duì)象，URSA患者及正常妊娠婦女納入標(biāo)準(zhǔn)參照本課題組前期文獻(xiàn)報(bào)道［5-6］。本研究共納入U(xiǎn)RSA 患者（URSA 組）和正常早孕婦女（正常妊娠組）各30 例，URSA 組孕（7.5±1.2）周、年齡（27.2±4.1）歲，對(duì)照組孕（7.7± 1.1）周、年齡（26.9 ± 4.5）歲。兩組孕周、年齡具有可比性。本研究經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所）倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本采集與試劑準(zhǔn)備 采集兩組清晨空腹靜脈血6 mL，離心分離血清用于ELISA 法檢測(cè)IL-10蛋白，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液試劑盒分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）用于qPCR 法檢測(cè)miR-513c-5p 表達(dá)及IL-10 mRNA。實(shí) 驗(yàn) 試 劑：TRIzol Reagent、UItra-SYBR Mixture 均購于北京康為世紀(jì)生物科技公司；miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit 及HiScript ⅡQ RT Super Mix for qPCR Kit 均購于南京諾唯贊生物科技有限公司；293T 細(xì)胞購于南京科佰生物科技有限公司；Lipofectamine2000購于美國Invitrogen公司；IL-10 ELISA 試劑盒購于杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；人外周血淋巴細(xì)胞分離液試劑盒購于北京華越洋生物科技有限公司；miR-513c-5p 過表達(dá)（mimics）、抑表達(dá)（inhibitor）、陰性對(duì)照（NC）序列見表1；qPCR 引物及內(nèi)參照U6逆轉(zhuǎn)錄引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，目的基因IL-10 qPCR 引物及內(nèi)參照GAPDH 由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見表2；野生型與突變型IL-10 3"UTR 載體均由美國Promega公司設(shè)計(jì)合成。

表1 miR-513c-5p過表達(dá)、抑表達(dá)及其陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染物序列

1.3 外周血中IL-10蛋白及miR-513c-5p檢測(cè)

1.3.1 IL-10蛋白檢測(cè) 取離心所得血清，以ELISA法檢測(cè)IL-10蛋白，嚴(yán)格按照說明書操作。使用酶標(biāo)儀測(cè)定雙波長（450 nm、630 nm）時(shí)的光密度（OD）值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD 值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照OD450-OD630值計(jì)算IL-10蛋白濃度。

1.3.2 miR-513c-5p 檢測(cè) 各組細(xì)胞總RNA 以TRIzol 法進(jìn)行提取，RNA 濃度與純度用紫外分光光度儀進(jìn)行測(cè)定。按照諾維贊公司miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit 說明書進(jìn)行miRNA 的cDNA 合成，選用UltraSYBR Mixture PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選用U6作為內(nèi)參，以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-513c-5p相對(duì)表達(dá)量。

1.4 miR-513c-5p 與IL-10 關(guān)系的預(yù)測(cè) 選用Target Scan7.1 生物信息學(xué)軟件，分析miR-513c-5p與IL-10 mRNA 3"UTR之間是否存在直接的結(jié)合。

1.5 miR-513c-5p 與IL-10 mRNA 3"UTR 結(jié) 合 位 點(diǎn)驗(yàn)證 以pmirGLO為載體構(gòu)建包含結(jié)合位點(diǎn)的野生型及突變型IL-10 mRNA 3"UTR 質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染至293T 細(xì) 胞，同 時(shí) 分 別 轉(zhuǎn) 染miR-513c-5p mimics 及NC，檢測(cè)雙熒光素酶報(bào)告基因活性。

1.6 miR-513c-5p 調(diào)控IL-10 蛋白表達(dá)情況觀察 將293T細(xì)胞分為過表達(dá)組、抑表達(dá)組與空白對(duì)照組，以Lipofectamine2000 分別轉(zhuǎn)染miR-513c-5p mimics、inhibitor 及NC；24 h 后收集各組細(xì)胞，ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中的IL-10 蛋白，qPCR 法檢測(cè)細(xì)胞中的IL-10 mRNA，檢測(cè)與計(jì)算方法同1.3.1。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism Version 8統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料均以±s 表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 IL-10 mRNA、miR-513c-5p及其對(duì)照基因的引物序列和產(chǎn)物片段長度

2 結(jié)果

2.1 正常妊娠組及URSA 組血清IL-10 蛋白及PBMC 中miR-513c-5p 表達(dá)水平比較 由表3 可見，URSA 組較正常妊娠組外周血IL-10 蛋白水平降低而miR-513c-5p表達(dá)升高（P均＜0.05）。

表3 兩組血清IL-10蛋白及PBMC中miR-513c-5p表達(dá)比較（±s）

表3 兩組血清IL-10蛋白及PBMC中miR-513c-5p表達(dá)比較（±s）

注：與正常妊娠組比較，*P＜0.05。

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2.2 miR-513c-5p 與IL-10 關(guān)系的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果 由表4 可見，miR-513c-5p 與IL-10 mRNA 3"UTR 之間具有潛在的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，提示miR-513c-5p可能通過結(jié)合IL-10 mRNA的3"UTR進(jìn)而抑制其轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)。見表4。

表4 miR-513c-5p與IL-10 3′UTR結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果

2.3 miR-513c-5p 對(duì)IL-10 mRNA 3"UTR 熒 光 素 酶報(bào)告基因活性的影響 由表5 可見，轉(zhuǎn)染miR-513c-5p mimics 可以降低野生型IL-10 mRNA 3"UTR 熒光素酶報(bào)告基因活性（P＜0.05），但對(duì)突變型IL-10 mRNA 3"UTR報(bào)告基因活性無顯著影響（P＞0.05）。

表5 miR-513c-5p對(duì)IL-10 mRNA 3"UTR熒光素酶報(bào)告基因活性調(diào)控（±s）

表5 miR-513c-5p對(duì)IL-10 mRNA 3"UTR熒光素酶報(bào)告基因活性調(diào)控（±s）

注：與NC比較，*P＜0.05。

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2.4 miR-513c-5p 對(duì)IL-10 mRNA 及蛋白表達(dá)的影響 由表6 可見，細(xì)胞中IL-10 mRNA 表達(dá)及細(xì)胞上清中IL-10 蛋白水平抑表達(dá)組＞對(duì)照組＞過表達(dá)組（P均＜0.05）。

表6 miR-513c-5p對(duì)IL-10 mRNA及蛋白表達(dá)的影響（±s）

表6 miR-513c-5p對(duì)IL-10 mRNA及蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05。

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3 討論

自2015 年我國全面實(shí)施二胎生育政策以來，高齡孕產(chǎn)婦的數(shù)量逐漸增多，URSA 發(fā)病率呈現(xiàn)增長趨勢(shì)，URSA 不僅嚴(yán)重影響育齡婦女生殖健康，也給患者及其家庭乃至社會(huì)帶來巨大壓力。因此，闡釋URSA 的發(fā)病機(jī)制、探索其診治方法具有重要的臨床價(jià)值和研究意義。研究發(fā)現(xiàn)，約80%的URSA 發(fā)病機(jī)制與免疫功能異常有關(guān)。隨著生殖免疫研究的不斷深入，維持母胎免疫耐受形成和導(dǎo)致RSA 發(fā)生的免疫失衡機(jī)制研究已經(jīng)從系統(tǒng)免疫逐漸深入到母胎界面的細(xì)胞和分子微觀水平［7］。

IL 是一組由多種細(xì)胞產(chǎn)生的可介導(dǎo)白細(xì)胞或免疫細(xì)胞間相互作用，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子。其中，IL-10 是一種重要的調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，主要由多種免疫細(xì)胞如T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌［8］。IL-10 在炎癥抑制和免疫調(diào)控過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，其表達(dá)與功能異常參與了炎癥、腫瘤等多種疾病的發(fā)生與發(fā)展［9-10］。母胎界面免疫研究發(fā)現(xiàn)，IL-10 在生殖免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用［11］。研究顯示，URSA 患者外周血及局部母胎界面IL-10 表達(dá)均低于正常妊娠婦女，提示IL-10 參與了URSA 的發(fā)生與發(fā)展，但致使URSA中IL-10 表達(dá)降低的上游調(diào)控靶點(diǎn)還不十分清楚。因此，探索URSA 中IL-10 表達(dá)異常的調(diào)控機(jī)制將進(jìn)一步從生殖免疫調(diào)控角度闡釋URSA 的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供新的依據(jù)。

隨著生命科學(xué)研究的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)曾因不能編碼蛋白質(zhì)而被稱為基因組中不被關(guān)注的RNA 或“垃圾RNA”的非編碼RNA 在許多生命活動(dòng)過程中發(fā)揮了很重要的作用，成為生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。miRNA 是重要的非編碼RNA 之一，是一組長度為21～25 個(gè)核苷酸生物體基因組編碼的內(nèi)源性非編碼小分子RNA。miRNA 具有高度保守性，是一類重要的基因表達(dá)調(diào)控因子，其作用于mRNA 主要的三個(gè)途徑是靶基因裂解、翻譯抑制或翻譯增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生理過程中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)異常參與了多種疾病如腫瘤的發(fā)生發(fā)展及血管損傷等病理過程［12］。研究顯示，miRNA 調(diào)控其靶基因表達(dá)與功能異常參與了自然流產(chǎn)的發(fā)生。例如，研究發(fā)現(xiàn)RSA 患者miR-365 表達(dá)升高，升高的miR-365 通過誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡參與流產(chǎn)發(fā)生［13］。此外，研究報(bào)道RSA 患者miR-27a-3p 表達(dá)升高通過靶向泛素特異性蛋白酶25（USP25）抑制滋養(yǎng)細(xì)胞遷移和侵襲導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生［14］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-6165 能夠靶向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3）抑制pDC亞群分化打破母胎免疫耐受導(dǎo)致流產(chǎn)［15］，并發(fā)現(xiàn)miR-103 能夠通過抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子1（STAT1）逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞極化異常減輕流產(chǎn)發(fā)生［16］。但是，miRNA 調(diào)控IL-10 表達(dá)在URSA 中作用與機(jī)制的研究尚未見報(bào)道［17］。

miR-513c-5p 是由位于人的X 染色體的編碼基因編碼的長度為22 個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，參與了多種癌癥的發(fā)生發(fā)展多有報(bào)道，但其在妊娠及妊娠相關(guān)疾病的中作用仍不清楚［18-19］。本研究發(fā)現(xiàn)，URSA 組患者外周血PBMC 中miR-513c-5p較正常妊娠組表達(dá)明顯升高，提示升高的miR-513c-5p 可能參與了URSA 發(fā)生。通過生物信息軟件Target Scan 預(yù)測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)miR-513c-5p與IL-10 mRNA 的3"UTR 之間存在潛在堿基互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步提示miR-513c-5p 可能通過結(jié)合IL-10 mRNA 3"UTR 從而抑制其轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。為證實(shí)這一設(shè)想，我們進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，結(jié)果證實(shí)miR-513c-5p與IL-10 mRNA 3"UTR可以堿基互補(bǔ)而直接結(jié)合。在這一發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，我們選用293T 細(xì)胞作為工具細(xì)胞，轉(zhuǎn)染miR-513c-5p mimics上調(diào)miR-513c-5p 表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)IL-10 mRNA 及蛋白表達(dá)水平均顯著降低；而且，在轉(zhuǎn)染miR-513c-5p inhibitor 抑制miR-513c-5p 表達(dá)后，IL-10 mRNA 及蛋白表達(dá)均顯著升高。以上結(jié)果提示，miR-513c-5p能夠通過與IL-10 mRNA 3"UTR 直接結(jié)合進(jìn)而抑制IL-10 mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)miR-513c-5p 升高參與了URSA 的發(fā)生，闡釋了miR-513c-5p 異常升高通過抑制其靶基因IL-10 的轉(zhuǎn)錄與翻譯進(jìn)而打破母胎免疫耐受狀態(tài)導(dǎo)致URSA。本研究從非編碼RNA表觀遺傳調(diào)控母胎免疫耐受角度進(jìn)一步闡釋了URSA 的發(fā)病機(jī)制，提示miR-513c-5p 有望成為URSA 診斷與預(yù)后評(píng)估的新的生物學(xué)指標(biāo)，靶向調(diào)控miR-513c-5p/ IL-10 信號(hào)通路可能為臨床治療URSA的有效方法。