固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法快速測(cè)定中藥材猴耳環(huán)中47 種農(nóng)藥殘留

李 純, 熊 穎, 顧利紅, 侯惠嬋, 栗建明

(廣州市藥品檢驗(yàn)所，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510160)

中藥材猴耳環(huán)Folium Archidendri 為豆科植物猴耳環(huán)Archidendron clypearia (Jack.) Nielsen 的干燥葉[1]，具有抗真菌、抗病毒、抗炎、抗過敏、抗腫瘤、抗胃潰瘍和抗結(jié)核等藥理作用[2]。目前，對(duì)猴耳環(huán)的研究多集中在品種歸屬、化學(xué)成分分離與藥理作用[3-5]，尚未見關(guān)于其農(nóng)藥殘留的報(bào)道。本課題組在調(diào)研過程中發(fā)現(xiàn)，在猴耳環(huán)種植過程中存在使用未登記農(nóng)藥現(xiàn)象，對(duì)其農(nóng)藥殘留處于監(jiān)管盲區(qū)，導(dǎo)致其使用存在安全隱患。鑒于此，本研究選擇47 種農(nóng)藥進(jìn)行篩查，包括：①課題組實(shí)地調(diào)查中發(fā)現(xiàn)種植過程中使用過的農(nóng)藥；②《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》) 2020年版通則“農(nóng)藥多殘留檢測(cè)法 第五法 藥材與飲片(植物類) 中禁用農(nóng)藥多殘留測(cè)定法”中收錄的部分禁用農(nóng)藥及農(nóng)藥代謝物[6]；③適用于高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)的農(nóng)藥。根據(jù)猴耳環(huán)基質(zhì)的特點(diǎn)，采用乙腈提取、HLB 固相萃取柱凈化的前處理方式，建立了一種簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定性好的農(nóng)藥多殘留快速篩查方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與藥劑

3200 QTRAP 質(zhì)譜聯(lián)用儀 (美國(guó) ABsciex 公司，分析軟件Analyst 1.6.3)；1200 高效液相色譜儀 (美國(guó) Agilent 公司)；AG245 和 XP-26 電子分析天平 (瑞士 Mettler Toledo 公司)；Maxi MixⅡ渦旋混合器 (美國(guó)Thermo 公司)；ST-16 高速勻漿儀(德國(guó) IKA 公司)；Milli-Q 超純水制備系統(tǒng) (美國(guó)MilliQ 公司)。

47 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品 (表 1) 包括 45 種液體 (濃度均為1 000 mg/L) 及苯線磷砜和涕滅威砜2 種固體(純度≥98%)，德國(guó) Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司；乙腈和丙酮 (色譜純)，德國(guó)Merck 公司；醋酸(色譜純)、乙酸氨 (色譜純) 和氯化鈉 (分析純)，上海安普科技有限公司；Oasis 親水親油平衡材料(HLB) 固相萃取柱 (規(guī)格200 mg，6 mL)，美國(guó)Waters 公司；20 批次猴耳環(huán)樣品由廣州萊泰制藥有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 將猴耳環(huán)樣品粉碎，過三號(hào)篩后，稱取5 g (精確到0.01 g) 于50 mL 聚苯乙烯聚塞離心管中，加入1 g 氯化鈉，混勻，加入20 mL 乙腈，于8 000 r/min 下勻漿提取20 min，于3 500 r/min下離心5 min；收集上清液，重復(fù)提取兩次；合并上清液，于40 ℃水浴濃縮至3～5 mL，用1～2 mL乙腈多次洗滌并轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，于3 500 r/min 下離心3 min；取3 mL 上清液，過HLB 固相萃取柱 (無需活化，直接上樣過柱)，收集全部?jī)艋?，混勻，待測(cè)。農(nóng)藥空白猴耳環(huán)基質(zhì)同法制備。

1.2.2 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)條件

色譜條件：菲羅門Kinetex C18色譜柱(100 mm × 2.1 mm, 2.6 μm) 及預(yù)保護(hù)柱 (4 mm ×2.0 mm，2.6 μm)；流動(dòng)相 A 相為 95% 乙腈 (含5 mmol/L 甲酸銨和 0.1% 甲酸)，B 相為水 (含5 mmol/L 甲酸銨和0.1%甲酸)。梯度洗脫程序：0～1 min，30%A；＞1～12 min，30%→100%A；＞12～14 min，100%A；＞14～15 min，100%→30%A；＞15～20 min，30%A。流速 0.3 mL/min；柱溫40 ℃；樣品盤溫度20 ℃。進(jìn)樣體積2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子掃描模式(ESI+)，依賴保留時(shí)間的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式 (scheduled MRM)，檢測(cè)窗60 s。氣簾氣 (CUR) 0.01 MPa，碰撞氣 (CAD) 0.06 MPa，噴霧電壓 (IS) 5 500 V，離子化溫度 (TEM) 600 ℃，霧化氣 (GS1) 與輔助氣(GS2) 均為0.35 MPa。47 種農(nóng)藥保留時(shí)間及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

農(nóng)藥單一標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確吸取45 種液態(tài)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液 (1 000 mg/L) 1.0 mL，用丙酮稀釋，配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的農(nóng)藥單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確稱取苯線磷砜和涕滅威砜2 種固態(tài)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品5 mg (精確至0.001 mg)，用丙酮溶解，配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的農(nóng)藥單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。所有儲(chǔ)備液均于 ?30 ℃保存。

農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：移取一定體積的47 種農(nóng)藥單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋，配制成農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 (表 2)，于 ?30 ℃ 保存。

基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取1 mL 猴耳環(huán)

空白基質(zhì)溶液，采用氮吹濃縮至約0.5 mL，分別加入農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10、20、50、100、150 和200 μL，用乙腈稀釋并定容至1 mL，配制成系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

表1 47 種農(nóng)藥的保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention time and HPLC-MS/MS detection parameters of 47 pesticides

表2 47 種農(nóng)藥的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、定量限、添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Linear range, r, LOQ, recoveries and RSDs of 47 pesticides

分別量取基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及經(jīng)1.2.1 節(jié)處理的樣品溶液各1 mL，加入0.1 mL水，混勻，過0.22 μm 微孔濾膜，按1.2.2 節(jié)的條件測(cè)定，以各農(nóng)藥的質(zhì)量濃度 (x) 為橫坐標(biāo)，以各農(nóng)藥的定量離子峰的峰面積響應(yīng)值 (y) 為縱坐標(biāo)，繪制校正曲線，權(quán)重系數(shù)選擇1/x，得到47 種農(nóng)藥的回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用農(nóng)藥單一標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜掃描獲取離子對(duì)信息，根據(jù)響應(yīng)值優(yōu)化碰撞電壓、去簇電壓等參數(shù)，每個(gè)待測(cè)物篩選出2～4 組特征離子對(duì)。根據(jù)猴耳環(huán)基質(zhì)特點(diǎn)，每種農(nóng)藥選擇2 組響應(yīng)值高且干擾少的特征離子對(duì)作為監(jiān)測(cè)離子對(duì)，其中豐度最高的選為定量離子對(duì)，所有離子對(duì)均為定性離子。選擇依賴保留時(shí)間的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，在化合物保留時(shí)間 ± 30 s 內(nèi)掃描，獲得準(zhǔn)確的定性及定量結(jié)果，優(yōu)化后的結(jié)果見表1。

根據(jù)《中國(guó)藥典》[6]進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)，如果檢出的色譜峰保留時(shí)間與對(duì)照品一致，且離子豐度比與對(duì)照品的離子豐度比一致 (相對(duì)豐度＞50%，允許 ± 10%偏差；相對(duì)豐度＞20%～50%，允許 ± 15%偏差；相對(duì)豐度＞10%～20%，允許 ± 20%偏差；相對(duì)豐度 ≤ 10%，允許 ± 50%偏差)，則可判定為檢出。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1，典型色譜圖見圖1。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

猴耳環(huán)藥用部位為干燥葉，含水量低 (低于8%)，且含較多葉綠素、纖維等[1]。考慮到方法的通用性及便捷性，采用乙腈勻漿提取制備原液，但原液渾濁，呈深綠色，超過50%的檢測(cè)指標(biāo)回收率低于50%，基質(zhì)干擾大，需要凈化。HLB 是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，保留機(jī)理為反相，適用于pH 值范圍較寬的多種分析物。HLB 固相萃取柱與乙腈提取液聯(lián)合使用時(shí)無需活化，直接過柱，操作簡(jiǎn)單，大大降低了試驗(yàn)難度。結(jié)果表明，經(jīng)HLB 固相萃取柱凈化后，80%以上的待測(cè)物回收率在70%～120%之間。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

本研究采用絕對(duì)法評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng) (Me)[7-11]，當(dāng)Me在85%～115%時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)在可控范圍，基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果的影響可忽略，當(dāng)Me＞115%或＜85%時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果的影響表現(xiàn)為抑制或增強(qiáng)效應(yīng)，應(yīng)對(duì)測(cè)得值進(jìn)行校正[9]。結(jié)果顯示，有41 種農(nóng)藥的Me在85%～115%之間，表明其影響可忽略不計(jì)；而甲胺磷受基質(zhì)嚴(yán)重抑制影響 (Me＜50%)，氧化樂果、吡蟲啉、涕滅威亞砜和多菌靈受基質(zhì)輕度抑制影響 (60%＜Me＜85%)，敵百蟲受基質(zhì)輕度增強(qiáng)影響 (Me＞ 115%)。因此，本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正。

2.4 方法線性范圍、靈敏度、準(zhǔn)確度及精密度

結(jié)果 (表2) 顯示，47 種農(nóng)藥在各自的線性范圍內(nèi)，其質(zhì)量濃度與對(duì)應(yīng)的峰面積間均呈良好的線性關(guān)系 (r＞0.992 0)。以10 倍信噪比的最低添加水平確定其定量限 (LOQ) 為0.001～0.015 mg/kg。在LOQ、5 倍 LOQ、20 倍LOQ 3 個(gè)添加水平下，47 種農(nóng)藥在猴耳環(huán)中的平均回收率在54%～117%之間，RSD (n = 6) 在2.0%～15%之間，其中40 種農(nóng)藥平均回收率在70%～120%之間，符合農(nóng)藥殘留分析要求[12]。部分農(nóng)藥的回收率較低，可能與復(fù)雜基質(zhì)的干擾或自身極性、穩(wěn)定性等理化性質(zhì)有關(guān)。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果

根據(jù)產(chǎn)地及采集樣本數(shù)目按比例選擇20 批樣品，運(yùn)用所建立的方法測(cè)定。結(jié)果顯示，共有4批次樣品檢出農(nóng)藥 (表3)。其中，苯線磷和甲胺磷均為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的禁用農(nóng)藥，炔螨特為常見的廣譜殺蟲殺螨劑。根據(jù)《中國(guó)藥典》2020 年版通則0212 規(guī)定[6]：禁用農(nóng)藥不得檢出 (低于定量限)，苯線磷與甲胺磷定量限分別為0.02 和0.05 mg/kg。表明樣品殘留量均未超過標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

表3 實(shí)際樣品的殘留測(cè)定結(jié)果Table 3 The concentrations of pesticide residues of real samples

3 結(jié)論

本研究建立了樣品經(jīng)乙腈高速勻漿提取-HLB固相萃取柱提取與凈化，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定中藥材猴耳環(huán)中47 種農(nóng)藥多殘留的檢測(cè)方法。本方法簡(jiǎn)單高效，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，為中藥材猴耳環(huán)的日常監(jiān)控、殘留限量制定及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等提供了可靠的分析手段。