甲酸與雙甲脒對意大利蜜蜂的時(shí)間-劑量-致死率分析

苗春輝, 楊 娟, 黃新球, 荀利杰, 胡宗文

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101)

蜜蜂 (如意大利蜜蜂、中華蜜蜂) 作為一種主要的授粉性昆蟲，對農(nóng)業(yè)增產(chǎn)、農(nóng)民創(chuàng)收具有重要作用，同時(shí)對于維護(hù)生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性具有重要而深遠(yuǎn)的意義[1-2]。對于意大利蜜蜂而言，其最大的威脅源于體表寄生螨的危害[3]。目前防治蜂螨的方法有多種，如使用殺螨劑、改變溫度及氣壓、割除雄蜂脾等，然而化學(xué)殺螨劑的頻繁使用不僅有可能污染蜂產(chǎn)品，并且使得害螨的抗藥性問題日益加重，因此蜜蜂殺螨劑的安全性越來越受到關(guān)注[4]。

甲酸是一種有機(jī)酸，同時(shí)也是蜂蜜中的天然成分，但對蜂螨有很強(qiáng)的刺激作用，于20 世紀(jì)80 年代在德國最早被嘗試用于防治蜂螨，后普及到全球蜂業(yè)治螨[5]。雙甲脒又稱N,N-雙 (2,4-二甲苯亞氨基甲基) 甲胺 (amitraz)，為常見的有機(jī)氮類殺螨劑，廣泛用于農(nóng)作物上害螨和蚜蟲、棉鈴蟲等害蟲的防治，因?qū)γ鄯潴w表寄生螨雅氏螨Varroa jacobsoni 和狄氏螨Varroa destructor 有良好的觸殺效果，且對蜜蜂低毒，因此也被廣泛用于蜂群殺螨[6]。有關(guān)甲酸和雙甲脒的殺螨效果在國內(nèi)有諸多文獻(xiàn)介紹[7-8]，而國外更多關(guān)注的則是其對蜜蜂的安全性及生理、病理學(xué)影響。Semkiv 等連續(xù)兩年觀測發(fā)現(xiàn)，波蘭蜂場使用雙甲脒后其在巢脾上的累計(jì)殘留檢出率高達(dá)94.6%[9]。Gregorc 等采用DNA 檢測的末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記 (TUNEL) 技術(shù)，檢測了經(jīng)雙甲脒處理的蜜蜂幼蟲，發(fā)現(xiàn)48 h 后有36% 的3 日齡蜜蜂發(fā)生了中腸上皮細(xì)胞死亡[10]；同樣，他們采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.97%的甲酸與31.95%的蔗糖混合后處理蜜蜂幼蟲，40 h 后發(fā)現(xiàn)有18%的3 日齡蜜蜂發(fā)生了上皮細(xì)胞死亡，到5 日齡時(shí)這一比例增加到82%[11]。

甲酸和雙甲脒對蜂螨的致死效果及對蜜蜂的生理影響均已得到很好的驗(yàn)證，但兩種殺螨劑對蜜蜂的致死規(guī)律還鮮有報(bào)道。在國內(nèi)的養(yǎng)蜂生產(chǎn)中，常將甲酸和雙甲脒配制成一定濃度的溶液后向蜂群噴灑以防治蜂螨[12-13]，而蜜蜂自身的清潔行為會促使工蜂之間相互舔舐而攝入殺螨劑，從而對蜜蜂產(chǎn)生胃毒作用[14]。隨著殺螨劑的廣泛使用，蜂螨已對常規(guī)濃度 (1 mL 殺螨劑 : 1 000 mL水，大致相當(dāng)于質(zhì)量濃度 1 μg/mL) 的化學(xué)類殺螨劑[如氟胺氰菊酯 (fluvalinate，螨凈)]產(chǎn)生了抗藥性[6,15-16]，必須加大濃度才能達(dá)到所需的殺螨效果，但有關(guān)高濃度下殺螨劑對意大利蜜蜂的影響尚未見報(bào)道。為此，本研究采用時(shí)間-劑量-致死率(time-does-mortality，TDM) 模型，研究了甲酸與雙甲脒對意大利蜜蜂成年工蜂的致死規(guī)律，以期掌握甲酸和雙甲脒對意大利蜜蜂的致死動態(tài)及時(shí)間-劑量效應(yīng)，旨在為田間合理應(yīng)用這兩種藥劑提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

蜂群：6 群意大利蜜蜂 Apis mellifera 飼養(yǎng)于云南農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所意大利蜜蜂試驗(yàn)蜂場內(nèi)，待工蜂出房后進(jìn)行標(biāo)記，采集蜂箱內(nèi)21 日齡的成年工蜂供試。

主要儀器：蜜蜂飼養(yǎng)盒[20 cm × 6 cm × 3.5 cm的木質(zhì)盒，內(nèi)含有 5 個(gè)飼養(yǎng)室 (6 cm × 3.5 cm × 3.5 cm)，每個(gè)飼養(yǎng)室前面有門檔，后面為孔徑1 mm 的鐵紗網(wǎng)]；WYA-2 S 型數(shù)字阿貝折射儀 (上海物光科技開發(fā)有限公司)。

藥劑：甲酸 (formic acid) 和雙甲脒 (amitraz)原液由浙江商貿(mào)浙雨試劑公司提供，分析純，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的蔗糖液作為溶劑，按表1 配制成梯度濃度藥液，并以30%蔗糖液作為空白對照。將配制好的藥液置于50 mL 離心管內(nèi)，于5 ℃保存，在試驗(yàn)開始前1 h 取出，于室溫下放置，待試驗(yàn)時(shí)搖勻飼喂。麻醉用CO2(蒙自市黃龍氧氣供應(yīng)站提供，裝于CO2鋼瓶中，通過鋼瓶閥門控制CO2流量)。

1.2 試驗(yàn)方法

蜜蜂捕捉：于試驗(yàn)開始前21 d 在蜂群內(nèi)標(biāo)記剛出房蜜蜂，為0 日齡，以獲得同一日齡工蜂。為防止蜜蜂捕捉過程中受傷，采用CO2麻醉后用鑷子和吸管小心捕捉，置入飼養(yǎng)盒中。共設(shè)12 個(gè)蜜蜂飼養(yǎng)盒，每盒含5 個(gè)飼養(yǎng)室，即總計(jì)60 個(gè)獨(dú)立的飼養(yǎng)室，每個(gè)飼養(yǎng)室放入20 只蜜蜂，以獲得每個(gè)濃度藥劑3 次重復(fù)。

饑餓處理：為剔除在捕捉過程中致死的蜜蜂，待被麻醉的蜜蜂蘇醒后，靜置饑餓處理2 h，用鑷子觸及蜜蜂軀體而不活動者判定為死亡，清理并記錄死亡蜜蜂數(shù)。

表1 兩種供試藥液濃度梯度Table 1 The concentration gradient of acaricide

飼喂處理：采用攝入法處理蜜蜂[14,17]。為準(zhǔn)確記錄蜜蜂取食藥量，采用移液槍每隔6 h 飼喂1 次。將1 000 μL 移液槍調(diào)到最大量程，吸取藥液后將槍頭傾斜45° 角對準(zhǔn)蜜蜂聚集區(qū)，輕輕旋轉(zhuǎn)排量按鈕，使在槍頭形成藥滴飼喂蜜蜂，至蜜蜂不再取食后移出，移液槍最大量程與此時(shí)刻度的差值即為蜜蜂取食藥量。每濃度重復(fù)3 次。當(dāng)每個(gè)飼養(yǎng)室蜜蜂死亡數(shù)量 ＞10 只時(shí)，改用100 μL的移液槍進(jìn)行飼喂。每次飼喂前記錄蜜蜂的死亡數(shù)，并清理已死亡的蜜蜂。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)以Excel 2012 軟件進(jìn)行收集整理和作圖，采用DPS 軟件對殺螨劑毒殺活性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行TDM (Time-Does-Mortality) 模型模擬和時(shí)間-劑量效應(yīng)參數(shù)估計(jì)[18]，采用Pearson 卡方檢驗(yàn)和Hosmer-Lemoshow 檢驗(yàn)對所建立的模型擬合度進(jìn)行驗(yàn)證，以評價(jià)兩種殺螨劑對蜜蜂的毒性作用。

TDM 模型因其數(shù)學(xué)結(jié)構(gòu)也可稱為互補(bǔ)重對數(shù)模型，其給出了某供試生物在任意時(shí)間tj(j = 1, 2,3, ···, J ) 下經(jīng)藥劑 (被供試因子) 劑量 di(i = 1, 2,3···, I ) 處理后的累計(jì)致死率 (cumulative mortality probability)[19]，其計(jì)算公式見式1。

式中：待估參數(shù)β 可描述為 “假設(shè)存在的每個(gè)關(guān)鍵生物受體所接受活性分子的平均數(shù)目”，即劑量效應(yīng)的斜率；τj描述截止于時(shí)間tj時(shí)的待估時(shí)間效應(yīng)參數(shù)。τj+ βlgdi與 ln[?ln (1?Pij)]具有線性關(guān)系，稱為線性預(yù)測因子 (linear predictor)。

累計(jì)致死率是連續(xù)性時(shí)間變量的非獨(dú)立性變量，因而，式1 并不能滿足模型模擬的獨(dú)立性假設(shè)。若時(shí)間區(qū)間[tj?1, tj]非常短，同時(shí)各時(shí)間段相互獨(dú)立，那么劑量di促使試蟲在時(shí)間段[tj?1, tj]內(nèi)發(fā)生的死亡率就是時(shí)間變量的獨(dú)立性變量，可模擬。這個(gè)死亡率即條件死亡率 (conditional mortality probability)，是指實(shí)際死亡數(shù)與供試時(shí)間起始的存活數(shù)之比，其計(jì)算公式見式2。

式中：γj為供試時(shí)間區(qū)間[tj?1, tj]內(nèi)時(shí)間效應(yīng)的待估參數(shù)。γj和 τj的關(guān)系見式 3。

式中， γk 為某一時(shí)刻時(shí)間效應(yīng)的待估參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 意大利蜜蜂死亡趨勢

不同濃度甲酸和雙甲脒處理后不同時(shí)間下意大利蜜蜂的累計(jì)致死率見圖1?？傮w而言，累計(jì)致死率隨藥劑質(zhì)量濃度遞增及處理時(shí)間的延長而增加。其中，目前田間所用質(zhì)量濃度 (1.67 μg/mL)的甲酸和雙甲脒對意大利蜜蜂的累計(jì)致死率迅速增加的時(shí)間始于處理后6 h，分別在處理后60 h和42 h 達(dá)到死亡率高峰，累計(jì)致死率超過50%的時(shí)間 (T50值) 分別為處理后12 h 和18 h，顯著高于推薦使用質(zhì)量濃度 (1 μg/mL) 下甲酸和雙甲脒的累計(jì)致死率 T50值 (分別為 27 h 和 24 h，P甲酸= 0.043，df = 18，P雙甲脒= 0.032，df = 18)。劑量≥5 μg/mL時(shí)，在處理后30 h 內(nèi)累計(jì)致死率達(dá)最高，T50小于9 h。低于1 μg/mL 時(shí)，兩種藥劑累計(jì)致死率隨處理時(shí)間變化的趨勢相近。結(jié)合各處理的累計(jì)致死率和處理時(shí)間看，濃度變化對累計(jì)致死率的影響程度次序?yàn)殡p甲脒＞甲酸。

2.2 TDM 模型模擬

兩種藥劑的處理時(shí)間效應(yīng)和劑量參數(shù)比較見表2。經(jīng)t 檢驗(yàn)，兩種藥劑的劑量效應(yīng)與時(shí)間效應(yīng)均極顯著 (P ＜ 0.01)，即相對于參數(shù)估計(jì)值標(biāo)準(zhǔn)誤均極小。條件死亡率是時(shí)間的相關(guān)函數(shù)，τj描述截止時(shí)間tj的待估時(shí)間參數(shù)，β 為劑量效應(yīng)的斜率。甲酸與雙甲脒的劑量效應(yīng)斜率β 分別為1.98和2.44，即意大利蜜蜂工蜂對兩種藥劑濃度變化的敏感性為雙甲脒＞甲酸。時(shí)間效應(yīng)參數(shù)γj估計(jì)值表明，相同時(shí)間點(diǎn)下雙甲脒的時(shí)間效應(yīng)參數(shù)均高于甲酸，并且甲酸的持續(xù)時(shí)間短于雙甲脒。模型擬合結(jié)果與試驗(yàn)結(jié)果 (圖1) 相符。

通過TDM 模型擬合優(yōu)度的顯著性可以檢驗(yàn)建模是否成功，若差異顯著則表明建模成功。從表3可看出，本研究的數(shù)據(jù)符合TDM 模型，Pearson卡方檢驗(yàn)和Hosmer-Lemoshow 擬合異質(zhì)性檢驗(yàn)顯著水平均＜0.05，表明模型的擬合異質(zhì)性能夠描述兩種藥劑的時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.3 兩種藥劑的劑量效應(yīng)

甲酸和雙甲脒處理意大利蜜蜂工蜂后不同時(shí)間的劑量效應(yīng)模擬結(jié)果見圖2。隨著處理時(shí)間延長，達(dá)到同等致死效應(yīng)所需的藥劑濃度呈遞減趨勢，即甲酸和雙甲脒對意大利蜜蜂工蜂的LD50和LD90值與處理后時(shí)間的對數(shù)呈負(fù)相關(guān)函數(shù)關(guān)系，處理后 66 h 的 LD50和 LD90值分別為 7.40 × 10?2、2.99 × 10?2μg/mL 和 4.21 × 10?2、2.60 × 10?2μg/mL。處理12 h 后蜜蜂死亡率趨于平穩(wěn)，表明在處理后12 h 內(nèi)蜜蜂死亡率偏高，后期則變化較小。從圖2還可看出，甲酸的LD50和LD90值均高于雙甲脒，且兩種藥劑間差異顯著 (P = 0.014，df = 42，t = 0.81)，表明雙甲脒對蜜蜂的毒性強(qiáng)于甲酸。

2.4 時(shí)間效應(yīng)

根據(jù)TDM 模型可得出不同濃度甲酸和雙甲脒對意大利蜜蜂的LT50和LT90值 (圖3)。從中可看出，時(shí)間效應(yīng)與處理劑量間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即隨劑量升高兩種供試藥劑對意大利蜜蜂的致死時(shí)間縮短。藥劑的LT50和LT90值越小，表明其毒性越強(qiáng)。從圖3 可知，1 和10 μg/mL 質(zhì)量濃度下，甲酸和雙甲脒的LT50值分別為4.8、4.2 h 和1.5、1.4 h，差異極顯著 (P = 0.005，df = 7，t = 4.06)，表明雙甲脒對蜜蜂的毒性強(qiáng)于甲酸，與圖2 的結(jié)果相似。當(dāng)質(zhì)量濃度升至2.5 μg/mL 后，兩種藥劑對蜜蜂的LT50值相當(dāng)，說明此時(shí)兩種藥劑對蜜蜂的毒性相近。

待估參數(shù)γj在不同時(shí)間區(qū)間[tj?1, tj]內(nèi)條件死亡率與藥劑濃度di的函數(shù)關(guān)系見式2，其擬合曲線與試驗(yàn)測定值的關(guān)系見圖4。甲酸和雙甲脒條件死亡率迅速遞增的線性預(yù)測因子為 ?0.1～0.1，通過比較擬合曲線的系數(shù)及R2值可知，甲酸的擬合曲線二項(xiàng)式系數(shù)為1.493 1，R2為0.518 7，雙甲脒的擬合曲線二項(xiàng)式系數(shù)為2.285 1，R2為0.678 7，即雙甲脒的擬合曲線二項(xiàng)式系數(shù)和R2值均高于甲酸，同樣表明兩種藥劑的毒性順序?yàn)殡p甲脒＞甲酸。

表2 甲酸和雙甲脒對意大利蜜蜂的TDM 模型模擬和時(shí)間-劑量效應(yīng)參數(shù)估計(jì)Table 2 Time- and dose- effect parameter estimated from the time-does-mortality data of formic acid andamitraz on the honeybees, Apis mellifera

表3 TDM 模型擬合優(yōu)度Table 3 Goodness fitness of TDM model

3 討論與結(jié)論

在評價(jià)藥劑生物活性的參數(shù)中，劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)是重要的指標(biāo)之一[20]。TDM 模型能夠充分揭示劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)的關(guān)系，合理表達(dá)時(shí)間-劑量相互作用關(guān)系，并且直觀地展示藥劑致死的動態(tài)變化、高峰期、致死劑量等指標(biāo)[21]，在評價(jià)藥劑的毒力、害蟲敏感程度及致死率變化等方面有著顯著的優(yōu)勢[22]。楊振國等[23]采用TDM 建模，通過Hosmer-Lemoshow 擬合異質(zhì)性檢驗(yàn)，證明了植物源類殺螨劑的數(shù)據(jù)分析能夠無偏差地描述時(shí)間-劑量-致死率的相互關(guān)系。本研究中TDM模型的擬合異質(zhì)性 (表2) 檢驗(yàn)同樣能夠描述兩種藥劑對意大利蜜蜂的時(shí)間-劑量-致死率相互關(guān)系。

甲酸和雙甲脒作為常用的殺螨劑，對意大利蜜蜂體表寄生螨，尤其是狄斯瓦螨 (大蜂螨) 有著良好的觸殺和防治效果[5,7-8,10-11]，但在防治蜂螨的同時(shí)也會對意大利蜜蜂產(chǎn)生毒殺效應(yīng)。本研究中，兩種藥劑處理后對意大利蜜蜂的累計(jì)致死率隨藥劑質(zhì)量濃度遞增及處理時(shí)間的延長而遞增：≥5 μg/mL 時(shí)，在處理后30 h 內(nèi)累計(jì)致死率均達(dá)100%；低于 1 μg/mL 時(shí)，兩種藥劑的累計(jì)致死率隨處理時(shí)間變化的趨勢相近 (圖1)，且在劑量效應(yīng)中甲酸的LD50和LD90值均高于雙甲脒 (圖2)，以及在時(shí)間效應(yīng) (圖3) 中甲酸和雙甲脒在1 和10 μg/mL處理后的LT50值分別為4.8、4.2 h和1.5、1.4 h。研究表明，相同濃度下雙甲脒的作用時(shí)間較短，毒性較強(qiáng)，依據(jù)各處理的累計(jì)致死率和處理時(shí)間，表明濃度變化對意大利蜜蜂的影響程度次序?yàn)殡p甲脒＞甲酸。

劑量效應(yīng)的斜率β 描述了假設(shè)存在的每個(gè)關(guān)鍵生物受體所接受的活性分子的平均數(shù)，可表示為殺蟲劑對昆蟲的毒力參數(shù)[24-25]。最早報(bào)道多種殺蟲劑對昆蟲的毒力參數(shù)估計(jì)范圍的是Preisler等[21]，為1.4～3.5。本研究中甲酸與雙甲脒的劑量效應(yīng)斜率β 值分別為1.98 和2.44，表明甲酸對意大利蜜蜂的毒性與常用化學(xué)殺蟲劑雙甲脒相當(dāng)。TDM 模型劑量效應(yīng)參數(shù)能充分證明生物測定數(shù)據(jù)的完整性和客觀性，對生物測定有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值，在姜靈等[26]及王艷秋等[27]檢測真菌類生物制劑殺蟲效果的研究中均得到了很好的驗(yàn)證。本研究中，TDM 模型也可較好地反映出甲酸與雙甲脒對意大利蜜蜂的致死效應(yīng)。

在實(shí)際生產(chǎn)中，為使效果最大化，養(yǎng)蜂員常將甲酸和雙甲脒藥液霧化后再進(jìn)行噴施[8,13,28]，以擴(kuò)大藥劑在蜂箱內(nèi)的擴(kuò)散范圍，但因此也增大了成年工蜂因清潔行為舔舐攝入殺螨劑的風(fēng)險(xiǎn)。目前多數(shù)殺螨劑使用說明書的推薦濃度均為1 mL 殺螨劑 : 1 000 mL 水 (大致相當(dāng)于質(zhì)量濃度 1 μg/mL)[8]，但在實(shí)際使用中往往高于該濃度。從本研究結(jié)果(圖1) 看，1.67 μg/mL 甲酸和雙甲脒處理的累計(jì)致死率T50值分別為處理后12 h 和18 h，顯著高于推薦質(zhì)量濃度的累計(jì)致死率T50值 (分別為27 h和24 h)，因此在田間使用甲酸和雙甲脒防治意大利蜜蜂的狄斯瓦螨時(shí)，綜合考慮殺螨劑對蜜蜂的致死率及對蜂螨的殺滅效果，建議藥劑質(zhì)量濃度最高不宜超過 1.67 μg/mL 。