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    灰葡萄孢對腐霉利的抗性分子機制及快速檢測技術(shù)

    2021-02-05 09:38:12汪漢成戴德江吳鑒艷張傳清
    農(nóng)藥學(xué)學(xué)報 2021年1期
    關(guān)鍵詞:抗藥性灰霉病抗性

    鄭 遠, 沈 瑤, 汪漢成, 戴德江,沈 穎, 吳鑒艷, 張傳清*,

    (1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院,杭州 311300;2. 浙江省植物保護檢疫與農(nóng)藥管理總站,杭州 310004;3. 貴州省煙草科學(xué)研究院, 貴陽 550081)

    由灰葡萄孢Botrytis cinerea 引起的灰霉病是影響草莓產(chǎn)量和質(zhì)量的主要病害之一[1]。灰葡萄孢能夠侵染草莓植株地上部分的所有器官,包括葉片、花瓣、果實等,其中對果實的危害尤為嚴重[2],造成的產(chǎn)量損失達1 0%~3 0%,嚴重時高達50%以上,甚至絕棚[3]。目前,化學(xué)防治是防治灰霉病的主要手段。腐霉利是一種二甲酰亞胺類殺菌劑 (dicarboximide fungicides,DCFs),由于其對灰葡萄孢有特效,因此被大量用于果蔬灰霉病的防治[4],但隨著該藥劑的長期大量、連續(xù)使用,灰葡萄孢對其抗性問題也日益嚴重。相關(guān)抗性報道已有很多:趙虎等研究表明,江蘇省草莓灰霉病菌對腐霉利的抗性頻率達54%以上[5];宋晰等研究表明,內(nèi)蒙古灰霉病菌對腐霉利的平均抗性頻率高達90%以上[6]。然而,腐霉利作為浙江省用于草莓灰霉病防治的主要殺菌劑之一,卻鮮有相關(guān)研究報道。因此,明確浙江省草莓灰霉病菌對腐霉利的抗性現(xiàn)狀,對建立合理的用藥策略具有重要意義。

    幾種病原菌如灰葡萄孢[7]、鏈格孢Alternaria alternata[8]和粗糙脈孢霉Neurospora crassa[9]等在雙組分組氨酸激酶 (two component histidine kinase,TCHK) 上的突變研究表明,TCHK 是二甲酰亞胺類殺菌劑的主要作用靶點。嚴蕾燕等[10]通過敲除灰葡萄孢TCHK 傳遞系統(tǒng)途徑上5 個關(guān)鍵基因 BcOS1、BcOS2、BcOS4、BcOS5 和BRRG-1,并測定基因敲除突變體的藥劑敏感性發(fā)現(xiàn),只有BcOS1 基因敲除突變體對DCFs 表現(xiàn)抗性,其他4 個基因敲除突變體對該類藥劑表現(xiàn)更為敏感。因此,嚴蕾燕等認為BcOS1 是DCFs的靶標位點,該基因上的點突變可能會導(dǎo)致病原菌對DCFs 產(chǎn)生抗性。目前報道的灰葡萄孢抗藥性菌株BcOS1 基因上有I365N/R/S、V368F、Q369P/H、N373S 和T447S 等突變類型,其中除了Q369P 突變會導(dǎo)致灰葡萄孢對DCFs 產(chǎn)生低、中或高水平抗性外,其余突變類型均會導(dǎo)致灰葡萄孢對DCFs 產(chǎn)生低水平抗性[11]。

    根據(jù)菌絲生長速率法或孢子萌發(fā)法測定病原菌對藥劑的敏感性,是判定灰葡萄孢是否為抗藥性菌株的傳統(tǒng)方法[12]。雖然傳統(tǒng)檢測方法得出的結(jié)果可靠,但是檢測周期長,步驟繁瑣。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù) (loop-mediated isothermal amplification,LAMP) 是一種操作簡單、精確度高、反應(yīng)速度快且特異性高的檢測方法[13-14],可以用于檢測特定的病原菌種類。由于作用靶標發(fā)生點突變是目前植物病原菌產(chǎn)生抗藥性的主要機制,因此,近年來已有學(xué)者根據(jù)病原菌抗藥性分子機制,利用堿基錯配原則檢測DNA 片段上單堿基的差異,將LAMP 技術(shù)用于檢測由點突變引起的病原菌對藥劑的抗性[15-17]。

    本研究測定了從浙江省5 個地區(qū)采集的200株灰葡萄孢對腐霉利的抗性,分析了抗性分子機制,在此基礎(chǔ)上建立了可以特異性檢測灰葡萄孢對腐霉利高抗基因型的LAMP 檢測技術(shù),以期為腐霉利的進一步使用及灰葡萄孢的抗藥性治理提供理論依據(jù)和技術(shù)手段。

    1 材料與方法

    1.1 供試菌株

    2017—2018 年從浙江省5 個地區(qū) (寧波市、臺州市、湖州市、杭州市和嘉興市) 的草莓種植基地采集灰霉病樣品,參考杜穎等[11]的方法進行單孢分離純化,共獲得200 株灰葡萄孢,其中寧波50 株,臺州37 株,湖州37 株,杭州32 株,嘉興44 株。將獲得的單孢菌株編號 (地點縮寫 +B + 序號),保存至斜面凍存管中,于 ?4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 供試藥劑、試劑與培養(yǎng)基

    供試藥劑:95%腐霉利 (procymidone) 原藥由浙江新安化工集團股份有限公司提供。

    LAMP 體系試劑:(8 U/μL) Bst DNA Polymerase購自諾唯贊生物科技有限公司;10 × Thermopol Buffer、10 mmol/L dNTP Mix 購自 TaKaRa 生物工程公司、甜菜堿 (Betaine) 和羥基萘酚藍 (HNB) 購自Sigma 公司;25 mmol/L MgCl2購自生工生物工程股份有限公司。

    馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA):稱取去皮土豆200 g,煮沸后過濾,加入20 g 葡萄糖和20 g瓊脂,加無菌水定容至1 L,121 ℃高壓滅菌30 min,備用。

    1.3 灰葡萄孢對腐霉利的抗性檢測

    參考趙虎等[5]的區(qū)分劑量法,分別利用5、20 和100 μg/mL 作為灰葡萄孢對腐霉利敏感性水平的區(qū)分濃度。在5 μg/mL 上不能生長的灰葡萄孢是敏感菌株;在5 μg/mL 上能生長、20 μg/mL上不能生長的為低抗菌株;在20 μg/mL 上能生長、100 μg/mL 上不能生長的為中抗菌株;在100 μg/mL 上能生長的為高抗菌株。分別將200 個菌株活化到PDA 平板上,取菌落邊緣的菌餅 (直徑為5 mm) 轉(zhuǎn)移至新鮮的PDA 平板上,培養(yǎng)3 d 后打取直徑5 mm 的菌餅接種到含不同質(zhì)量濃度腐霉利的PDA 培養(yǎng)基平板上。每個處理重復(fù)3 次。置于23 ℃下黑暗培養(yǎng)3 d 后,統(tǒng)計在含不同質(zhì)量濃度腐霉利PDA 板上生長的菌株數(shù)量,按公式(1) 分別計算灰葡萄孢對腐霉利表現(xiàn)低水平、中水平和高水平抗性菌株的頻率。

    式中:X—抗藥性頻率,%;N1—抗藥性菌株數(shù);N2—供試總菌株數(shù)。

    1.4 腐霉利抗感菌株的BcOS1 基因的分析

    根據(jù)灰葡萄孢組氨酸激酶基因BcOS1 序列(基因登錄號:AF396827.2),參考杜穎等[11]的文獻合成4 對引物,記為S1~S4 (表1) 用于擴增BcOS1 基因全長。采用25 μL 反應(yīng)體系,包含以下組分:12.5 μL 2 × Tag 聚合酶,上、下游引物各 1 μL,DNA 模板 1 μL。PCR 擴增參數(shù)為:94 ℃5 min;94 ℃ 30 s;55~62 ℃ 30 s;72 ℃ 2 min,34 個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR 擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果由SeqMan 11.2 和EditSeq 7.1 生物軟件進行分析。

    1.5 LAMP 引物的設(shè)計

    以灰葡萄孢對腐霉利抗性菌株BLB-13 的BcOS1 基因 (基因登錄號:MT375849) 含有Q369P 點突變的序列為模板,使用在線軟件Primer Explore (http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html) 設(shè)計檢測引物,記為S5 (表1)。引物干粉用ddH2O 溶解后置于 ?4 ℃冰箱中保存,備用。

    1.6 LAMP 擴增反應(yīng)體系的優(yōu)化

    參考胡小然等[18]LAMP 擴增反應(yīng)體系,分別對擴增體系中的各反應(yīng)組分濃度進行優(yōu)化:Bst DNA 聚合酶濃度依次設(shè)為0.08、0.16、0.24 和0.32 U/μL;Mg2+濃度依次設(shè)為 2.0、3.0、4.0、5.0 和 6.0 mmol/L;dNTP 濃度依次設(shè)為 0.4、0.6、0.8、1.0 和 1.2 mmol/L;FIP 和 BIP 的濃度分別依次設(shè)為 0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 和 2.0 μmol/L;F3 和B3 的濃度分別依次設(shè)為0.2、0.3、0.4、0.5 和0.6 μmol/L;甜菜堿濃度依次設(shè)為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 和 1.2 mmol/L。每個處理 3 個重復(fù),試驗重復(fù)3 次,下同。

    1.7 LAMP 擴增反應(yīng)條件的優(yōu)化

    參考胡小然等[18]LAMP 擴增反應(yīng)條件進行優(yōu)化。將反應(yīng)最優(yōu)體系溶液分別在59、60、61、62、63、64、65 和66 ℃恒溫條件下反應(yīng)60 min,然后在最佳反應(yīng)溫度下分別反應(yīng)10、20、30、40、50、60、70 和80 min。擴增反應(yīng)結(jié)束后,觀察反應(yīng)管顏色變化,以確定最佳反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度。

    1.8 LAMP 擴增反應(yīng)的靈敏度

    利用真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒 (上海生物工程有限公司) 提取菌株BLB-13 (高抗) 菌絲DNA,測定其質(zhì)量濃度后進行10 倍梯度稀釋, 用作LAMP 擴增反應(yīng)靈敏度測試的模板。質(zhì)量濃度梯度分別設(shè)置為 10 × 100、10 × 10?1、10 × 10?2、10 × 10?3、10 × 10?4、10 × 10?5、10 × 10?6和 10 ×10?7ng/μL。為了比較 LAMP 和常規(guī) PCR 之間的靈敏度,使用引物F1 和R1 (表1),擴增BcOS1基因上包含第369 位約1719bp 的DNA 片段,PCR 反應(yīng)程序如1.4 節(jié)所述。

    1.9 LAMP 擴增反應(yīng)的特異性

    為了評估LAMP 的特異性和準確性,分別以敏感、I365S/N 和Q369P + N373S 突變類型的菌株的DNA 作為模板,每種突變類型各選2 株菌株。在最佳反應(yīng)條件下,通過觀察反應(yīng)管顏色變化判斷LAMP 擴增的特異性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 灰葡萄孢對腐霉利的抗性

    從浙江省5 個地區(qū)采集分離的200 株灰葡萄孢對腐霉利的總抗性頻率高達71.5%,其中低水平抗性菌株 (LR) 100 株,頻率為50%;中水平抗性菌株 (MR) 38 株,頻率為19%;高水平抗性菌株 (HR) 5 株,頻率為2.5% (圖1)。

    2.2 腐霉利抗感菌株的BcOS1 序列比對分析

    通過比對32 個抗性菌株的堿基序列發(fā)現(xiàn)在BcOS1 基因上存在3 種突變類型 (表2)。低抗菌株和中抗菌株的第365 位密碼子由ATC 突變成AGC或AAC,導(dǎo)致氨基酸由異亮氨酸 (Ile,I) 突變成絲氨酸 (Ser,S) 或天冬酰胺 (Asn,N);高抗菌株的第369 和373 位密碼子同時發(fā)生突變,導(dǎo)致第369 位氨基酸由谷氨酰胺 (Gln,Q) 突變成脯氨酸(Pro,P),第373 位氨基酸由天冬酰胺 (Asn,N)突變成絲氨酸 (Ser,S)。

    表2 灰葡萄孢BcOS1 堿基序列及氨基酸的比較Table 2 Comparison of base sequence and amino acids of different strains of BcOS1

    2.3 LAMP 檢測體系的優(yōu)化

    最終確定LAMP 檢測體系的最佳濃度組分(表 3):Bst DNA 聚合酶為 0.16 U/μL,Mg2+為3 mmol/L,dNTP 為1 mmol/L,內(nèi)引物FIP 和BIP均為 1.2 μmol/L,外引物 F3 和 B3 均為 0.4 μmol/L,甜菜堿為0.6 mmol/L。

    表3 LAMP 體系Table 3 LAMP component

    2.4 LAMP 檢測體系的反應(yīng)條件

    結(jié)果表明:當溫度在59~61 ℃時,反應(yīng)管顏色不變;當溫度到達62 ℃時,反應(yīng)管顏色開始變藍;當溫度到達63 ℃時,反應(yīng)管顏色明顯變藍,因此確定63 ℃為最佳反應(yīng)溫度 (圖2)。在63 ℃下,當反應(yīng)進行50 min 時,反應(yīng)管變化最明顯(圖3)。因此,確定該體系的最佳反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度63 ℃、時間50 min。

    2.5 LAMP 檢測的靈敏度

    以BLB-13 菌株的DNA 為模板,10 倍梯度稀釋DNA。結(jié)果表明:當DNA 質(zhì)量濃度為10 ×10?4ng/μL 時,LAMP 反應(yīng)管顏色仍為紫色,表明此時LAMP 反應(yīng)已檢測不到DNA,說明該檢測體系的最低檢測限為 10 × 10?3ng/μL。而常規(guī)PCR 的最低檢測限僅為 10 × 10?2ng/μL,可見,LAMP 檢測比常規(guī) PCR 的靈敏度高 10 倍 (圖 4)。

    2.6 LAMP 檢測特異性

    結(jié)果(圖5)表明,敏感菌株、低水平和中水平抗藥性菌株中的Ⅰ類突變和Ⅱ類突變的反應(yīng)管均呈陰性反應(yīng),顏色無明顯變化,只有高水平抗藥性菌株,即第 Ⅲ 類突變的反應(yīng)管由紫色變?yōu)樘焖{色,表明該LAMP 檢測具有較好的特異性。

    3 結(jié)論與討論

    灰霉病是影響草莓產(chǎn)量和質(zhì)量的主要病害。二甲酰亞胺類殺菌劑 (DCFs) 腐霉利作為草莓灰霉病防治的主要藥劑之一,有報道指出,草莓灰葡萄孢已對其產(chǎn)生嚴重的抗性[16],然而浙江省內(nèi)卻缺乏相關(guān)研究報道。本研究通過區(qū)分劑量法測定了浙江省5 個地區(qū)共200 株草莓灰葡萄孢對腐霉利的抗性水平,總抗性頻率為71.5%。與遼寧、山西省等地相比,抗性頻率相對較低[11,19],這可能與不同地區(qū)施藥水平不同有關(guān)。同時本研究發(fā)現(xiàn),浙江省灰葡萄孢對腐霉利的抗性菌株以低水平抗性為主,占抗性菌株的69.9%。因此本研究認為,腐霉利可繼續(xù)用于浙江省草莓灰霉病的防治,但前提是要加強灰葡萄孢對腐霉利的抗性監(jiān)測。

    Lerous 等[20]通過對雙組分組氨酸激酶(TCHK) 的基因測序比對發(fā)現(xiàn),田間灰葡萄孢抗性菌株的BcOS1 第365 位氨基酸由異亮氨酸突變?yōu)榻z氨酸,認為該點突變可能影響了病原菌對二甲酰亞胺類殺菌劑的敏感性。Oshima 等[9]也在灰葡萄孢對該類藥劑的抗性菌株上發(fā)現(xiàn)同樣的突變類型,認為該基因序列的突變導(dǎo)致了菌株對藥劑產(chǎn)生了抗性。本研究通過比對敏感、抗性菌株BcOS1基因序列表明,草莓灰葡萄孢抗腐霉利菌株有3 種突變類型:第Ⅰ類和第Ⅱ類分別為第365 位氨基酸由異亮氨酸 (I) 突變成絲氨酸 (S) 或天冬酰胺(N),即I365S/N;第 Ⅲ 類包含兩個突變位點,分別為第369 位氨基酸由谷氨酰胺 (Q) 突變成脯氨酸(P) 和第373 位氨基酸由天冬酰胺 (N) 突變成絲氨酸 (S),即Q369P + N373S。過去已有研究者報道,這3 種突變類型可能是灰葡萄孢對二甲酰亞胺類殺菌劑產(chǎn)生抗性的原因[21-23]。此外,本研究發(fā)現(xiàn),I365S/N 突變類型菌株的抗性水平為低抗或中抗,而Q369P + N373S 突變類型菌株的抗性水平為高抗。Muhammad 等[21]也報道了 Q369P + N373S 突變會導(dǎo)致灰葡萄孢對腐霉利產(chǎn)生高水平抗性。而杜穎等[11]研究中顯示,BcOS1 基因編碼的氨基酸上發(fā)生Q369P 突變后,菌株不僅表現(xiàn)為低抗,還可能表現(xiàn)中高或高抗。因此N373S 突變在灰霉病菌對腐霉利產(chǎn)生高水平抗性中的貢獻還需進一步研究。

    在抗藥性分子機制分析的基礎(chǔ)上,本研究建立了可以快速檢測灰葡萄孢對腐霉利高抗菌株Q369P 的技術(shù)。傳統(tǒng)的抗藥性檢測主要是通過組織或單孢分離的方法分離培養(yǎng)病原菌,再根據(jù)菌絲生長速率法或孢子萌發(fā)法來判定是否為抗性菌株[12],該方法檢測周期長,步驟繁瑣。后來研究者根據(jù)抗藥性的分子機制設(shè)計錯配引物擴增病原菌的DNA,通過PCR 技術(shù)可特異性區(qū)分敏感和抗藥性菌株[24],但也存在耗時長、檢測成本高等不足,且不適用于田間的快速檢測。本研究建立的快速檢測體系可在63 ℃恒溫條件下,用時50 min 便可完成整個檢測,并且具有較高的靈敏度,該體系理論上能檢測到低至質(zhì)量濃度為10 ×10?3ng/μL 水平的基因組 DNA,是普通 PCR 反應(yīng)的10 倍。Zou 等[25]報道過一種可在30s 內(nèi)快速提取病原真菌DNA 的方法,在未來可將該方法與LAMP 檢測技術(shù)相結(jié)合,從而實現(xiàn)在田間對灰葡萄孢更為快速、簡單的檢測。

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