羊肚菌衰老特性的測(cè)定分析

劉 偉 何培新 蔡英麗 馬曉龍 趙 雄

羊肚菌衰老特性的測(cè)定分析

劉 偉1，2*何培新3蔡英麗1馬曉龍1趙 雄4

（1. 武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，武漢 430345；2. 西南林業(yè)大學(xué) 應(yīng)用真菌研究所，昆明 650224；3. 鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450001；4. 武漢菇巴克農(nóng)業(yè)科技有限公司，武漢 430070）

應(yīng)用野生高羊肚菌（）及3種可馴化栽培的梯棱羊肚菌（）、六妹羊肚菌（）和七妹羊肚菌（）的15個(gè)樣品共計(jì)52個(gè)分離株，包括相同子囊果不同部位和相同部位的多個(gè)組織分離株，以及單孢分離株，采用繼代培養(yǎng)的方法測(cè)定這些菌株的生長(zhǎng)曲線和形態(tài)特征，分析這些菌株的菌絲生長(zhǎng)速度、菌核和色素產(chǎn)生及菌落形態(tài)等培養(yǎng)性狀。結(jié)果為：除了兩個(gè)組織分離菌株在繼代培養(yǎng)5 320 h仍然存活以外，其余供試菌株均在不同時(shí)間段內(nèi)老化死亡，其中壽命最長(zhǎng)者為連續(xù)繼代培養(yǎng)3 814 h，繼代培養(yǎng)總生長(zhǎng)距離213.7 cm；壽命最短者僅繼代培養(yǎng)360 h，總生長(zhǎng)距離5.9 cm。羊肚菌的老化表型為菌核產(chǎn)生數(shù)量下降、產(chǎn)生色素增加、菌絲生長(zhǎng)速度下降和菌落邊緣不整齊。表明羊肚菌菌絲的快速老化是一個(gè)普遍現(xiàn)象，可能與低等生物遺傳物質(zhì)的快速變異有關(guān)。鑒于菌株老化嚴(yán)重影響栽培產(chǎn)量，建議將菌株壽命測(cè)定作為羊肚菌優(yōu)質(zhì)菌種評(píng)判的一個(gè)指標(biāo)。并提出在生產(chǎn)中減緩羊肚菌老化的一些措施。

老化；繼代培養(yǎng)；菌株壽命；菌種質(zhì)量；菌核；色素

羊肚菌（spp.）是一類名貴的食用菌，受到全球蘑菇愛(ài)好者的追捧[1]。近年來(lái)，中國(guó)的羊肚菌人工栽培領(lǐng)先國(guó)際取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，栽培面積也逐年激增[2, 3]。然而，羊肚菌產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的背后是每年有70%的種植者無(wú)法穩(wěn)定盈利，其中菌種技術(shù)是決定栽培成敗的關(guān)鍵因素之一[4]。老化（Aging）是所有生物都規(guī)避不了的自然生理過(guò)程，涉及凋亡、自噬、壞死等多種基礎(chǔ)生物學(xué)事件，彼此交叉互作，受到精細(xì)的遺傳調(diào)節(jié)，并與環(huán)境條件和細(xì)胞發(fā)育密切相關(guān)[1, 5, 6]。

與多數(shù)高等擔(dān)子菌不同，子囊菌似乎更易老化。研究較多的子囊菌有柄孢殼[7]（）、粗糙脈孢霉（）[8]、白僵菌（）[9]和綠僵菌（）[10]等。Hervey等[11]發(fā)現(xiàn)普通羊肚菌（）部分子囊孢子萌發(fā)后存在生長(zhǎng)停滯現(xiàn)象，但作者未就菌絲生長(zhǎng)停滯原因深入研究。衰老是涉及到自噬和凋亡的系統(tǒng)性不可逆過(guò)程[12]。我們深入研究高羊肚菌（）的衰老特性，發(fā)現(xiàn)其在繼代培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)發(fā)生明顯的老化現(xiàn)象，不同菌株老化的宏觀和微觀特征不同。隨后我們測(cè)定了梯棱羊肚菌（）和六妹羊肚菌（）系列繼代培養(yǎng)菌株的培養(yǎng)性狀和栽培特性，發(fā)現(xiàn)隨繼代培養(yǎng)代數(shù)增加老化增強(qiáng)，兩菌株的脂質(zhì)過(guò)氧化程度增加，菌核產(chǎn)生能力下降，色素形成加劇，栽培產(chǎn)量持續(xù)下降。梯棱羊肚菌T4菌株在繼代培養(yǎng)的第6代，六妹羊肚菌T6菌株在繼代培養(yǎng)的第2代時(shí)，栽培產(chǎn)量下降到原代菌株的50%[5]。菌株老化嚴(yán)重影響羊肚菌的栽培產(chǎn)量。

然而，由于缺乏關(guān)于羊肚菌老化的大樣本系統(tǒng)性研究，菌株老化是否是羊肚菌的普遍現(xiàn)象，不同種類羊肚菌的菌株老化特征是否存在差異等問(wèn)題無(wú)法定論。本文針對(duì)4種羊肚菌的15個(gè)不同樣品，共進(jìn)行52個(gè)組織和單孢分離菌株的老化性狀測(cè)定，分析比較不同部位和相同部位的組織分離株及單孢分離菌株的老化性狀，以期為羊肚菌菌種質(zhì)量評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株的選擇

以野生高羊肚菌及可人工栽培的梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌和七妹羊肚菌4種羊肚菌子囊果標(biāo)本的組織分離株和單孢分離株為實(shí)驗(yàn)材料，以第一代分離株作為原代菌株。組織分離和單孢分離方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[13]。所有供試樣品均通過(guò)ITS、LUS、RPB和EF片段的序列分析技術(shù)以確定其分類地位[1, 14]。

樣品編號(hào)說(shuō)明：14-An-a/b/c和15-Zh1-a/b/c為14-An和15-Zh1兩個(gè)分離株的3次生物學(xué)重復(fù)；MG04和MB04分別為同一子囊果的菌蓋和菌柄部位組織分離株；18-114-M03A、18-114-M01B及18-114-M05A為18-114標(biāo)本的3個(gè)單孢分離株；其他菌株均為組織分離株。標(biāo)號(hào)末尾的不同編號(hào)數(shù)字代表相同部位（菌柄）組織分離時(shí)不同組織塊萌發(fā)的分離株，如17-17-1和17-17-3分別是編號(hào)17-17樣品的同一菌柄組織分離的不同組織塊的萌發(fā)株。M4-1U和M4-3U采用U型管培養(yǎng)測(cè)定；其他菌株均采用直徑15 cm的大培養(yǎng)皿培養(yǎng)測(cè)定。M4-1M使用復(fù)合培養(yǎng)基（麥粒48%，木屑48%，石灰1%，石膏1%，含水量65%），其他菌株均使用CYM固體培養(yǎng)基。

1.2 繼代培養(yǎng)

繼代培養(yǎng)采用直徑15 cm培養(yǎng)皿或自制U型管，U型管由直徑2.5 cm、長(zhǎng)40 cm的玻璃管兩端各5 cm 以45°彎折而成。在培養(yǎng)皿或U型管內(nèi)倒入CYM固體培養(yǎng)基（葡萄糖 20 g，酵母膏 2 g，蛋白胨 2 g，K2HPO41 g，MgSO40.5 g，KH2PO40.46 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 L），其中15 cm大培養(yǎng)皿傾倒約40 mL，U型管倒入35 mL。待培養(yǎng)基冷卻凝固后接種，在培養(yǎng)皿的一邊或U型管的一端接種原代菌株菌種塊，23 ℃下培養(yǎng)。每隔3天在菌落前端劃線標(biāo)記；當(dāng)菌落生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿的另一邊或U型管的另一端前，用接種針切取菌絲前端0.3 cm × 0.5 cm的組織塊（包含完整的尖端菌絲細(xì)胞），按照菌絲生長(zhǎng)的方向，置于新的培養(yǎng)皿或U型管內(nèi)。如此反復(fù)，直至菌絲衰老死亡。

同一個(gè)樣品整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程只使用一種規(guī)格的大培養(yǎng)皿或U型管，實(shí)驗(yàn)過(guò)程避免菌落長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿或長(zhǎng)至U型管另一端。每一次轉(zhuǎn)接稱為一個(gè)世代，在轉(zhuǎn)接時(shí)保留一份培養(yǎng)物接種于新的CYM斜面試管作為繼代培養(yǎng)中間過(guò)程菌株，培養(yǎng)7～10天后保藏。詳細(xì)的繼代培養(yǎng)過(guò)程可參見(jiàn)文獻(xiàn)[15, 16]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

將繼代培養(yǎng)過(guò)程中的菌株活化后接種于直徑9 cm的CYM培養(yǎng)皿，23 ℃培養(yǎng)，在第3天、6天、9天和14天時(shí)觀察并記錄菌絲的長(zhǎng)勢(shì)、濃密程度，菌落形態(tài)特征，菌核發(fā)生的時(shí)間和數(shù)量，色素產(chǎn)生的時(shí)間及狀態(tài)；在第14天時(shí)，對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行拍照。每菌株進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

生長(zhǎng)曲線的繪制：在繼代培養(yǎng)過(guò)程中，每3天測(cè)量一次菌絲生長(zhǎng)距離，計(jì)算該區(qū)間的菌絲生長(zhǎng)速度，并以此繪制生長(zhǎng)曲線。統(tǒng)計(jì)每一菌株在完整的繼代培養(yǎng)中的總培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)和總生長(zhǎng)距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株老化的培養(yǎng)特征

不同供試菌株培養(yǎng)的老化特征比較相似。隨菌株老化程度增加（繼代培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)），供試菌株的菌核減少，色素增多，菌絲生長(zhǎng)減慢。He等[12]依據(jù)羊肚菌菌落的宏觀、微觀特征，將典型的衰老分為健壯、衰老前、衰老三個(gè)階段。圖1為18-114-1菌株6個(gè)不同繼代培養(yǎng)物的宏觀特征（該菌株在CYM培養(yǎng)基上沒(méi)有明顯的菌核產(chǎn)生），在健壯階段（圖1a，b）菌落生長(zhǎng)均勻、菌落前端整齊，無(wú)明顯的色素產(chǎn)生；而從第3代開(kāi)始出現(xiàn)輕微的色素，即到了衰老前階段；隨著繼代進(jìn)程的延續(xù)，色素產(chǎn)生持續(xù)增強(qiáng)，在繼代培養(yǎng)至第5代時(shí)達(dá)到最強(qiáng)，整個(gè)培養(yǎng)皿培養(yǎng)物均呈棕色；直至最終（第6代）徹底死亡。衰亡階段的培養(yǎng)物生長(zhǎng)速度迅速下降，無(wú)法長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，菌落前端不整齊，菌落整體呈不規(guī)則形狀。而一些產(chǎn)生明顯菌核的菌株，則表現(xiàn)為在健壯階段菌核數(shù)量和形態(tài)無(wú)明顯的變化或僅數(shù)量輕微減少；而在衰老前階段則隨著繼代培養(yǎng)的延續(xù)，菌核數(shù)量明顯下降，直至無(wú)菌核產(chǎn)生。

圖1 18-114-1菌株連續(xù)6代繼代培養(yǎng)物的宏觀特征

注：a、b為健壯階段，初始菌落邊緣整齊，色素少；c、d、e為衰老前階段，隨著繼代次數(shù)的增加，色素增加；f為衰老死亡階段，菌絲生長(zhǎng)速度下降明顯，菌落邊緣不整齊，菌落呈不規(guī)則形狀。

2.2 不同菌株的壽命及衰老特性

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所有供試菌株中，除兩個(gè)七妹羊肚菌分離株19-33-4和19-33-10在連續(xù)培養(yǎng)5 320 h后仍舊健壯生長(zhǎng)外，其他菌株均在有限時(shí)間內(nèi)死亡（表1）。在已衰亡的菌株中，壽命最長(zhǎng)的為15-Zh4菌株，連續(xù)培養(yǎng)3 814 h，培養(yǎng)總長(zhǎng)度為213.7 cm；壽命最短的菌株17-17-1在培養(yǎng)360 h內(nèi)死亡，菌絲生長(zhǎng)總長(zhǎng)度僅為5.9 cm。實(shí)驗(yàn)中，我們以香菇（）商業(yè)菌株808和135（非原代組織分離菌株）作對(duì)照進(jìn)行相同的連續(xù)繼代培養(yǎng)，在連續(xù)培養(yǎng)16個(gè)月內(nèi)，未出現(xiàn)生長(zhǎng)速度下降現(xiàn)象，菌絲密度和菌絲爬壁能力也和原代菌株基本一致。這和生產(chǎn)的經(jīng)驗(yàn)趨同，作為子囊菌的羊肚菌比擔(dān)子菌類食用菌具有更快的衰老速度[1]。大部分高羊肚菌（n=30，83%）和六妹羊肚菌供試菌株（n=4，100%）的壽命低于所有供試菌株的平均壽命（2 033 h），似乎表明高羊肚菌具有更易老化的特性。其他六妹羊肚菌菌株是否也如本實(shí)驗(yàn)菌株一樣容易老化，還有待增加實(shí)驗(yàn)材料加以確證。

表1 不同羊肚菌分離菌株的老化性狀

菌絲長(zhǎng)速是菌株在繼代培養(yǎng)老化過(guò)程中的一個(gè)明顯可量化的指標(biāo)。兩個(gè)典型的繼代培養(yǎng)生長(zhǎng)速度變化曲線見(jiàn)圖2，在健壯階段和衰老前階段，菌絲的長(zhǎng)速?zèng)]有顯著的變化，趨于平均值持續(xù)生長(zhǎng)；而在衰老階段，菌絲生長(zhǎng)速度則急劇下降，在一個(gè)培養(yǎng)世代內(nèi)（～240 h）迅速死亡。

圖2 高羊肚菌4個(gè)菌株繼代培養(yǎng)生長(zhǎng)速度變化曲線

為了探究羊肚菌不同繼代菌株的生長(zhǎng)潛能和穩(wěn)定性，對(duì)高羊肚菌M4-2和M4-3菌株的不同繼代培養(yǎng)物進(jìn)行新輪次的繼代培養(yǎng)。結(jié)果表明，兩菌株的表現(xiàn)趨于一致。雖然靠前的兩個(gè)世代菌株（M4-2-1與M4-2-2，M4-3-1與M4-3-2）的壽命（總生長(zhǎng)距離）和親本趨同（圖3），但越接近衰老階段的繼代培養(yǎng)物，其新輪次繼代培養(yǎng)老化的速度越快（圖4）。這些結(jié)果表明，繼代培養(yǎng)逐漸趨于老化是羊肚菌的一種穩(wěn)定性狀。

圖3 M4-2和M4-3不同繼代菌株新輪次繼代培養(yǎng)的壽命

圖4 M4-2和M4-3不同繼代菌株新輪次繼代培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線

2.3 不同組織分離株和單孢分離株的衰老表型

同一個(gè)子囊果的不同部位組織分離菌株，甚至相同部位的多個(gè)組織塊萌發(fā)分離株，其老化特征都不盡相同。例如，MG04和MB04分別是同一個(gè)子囊果的菌蓋和菌柄組織的分離株，雖然兩者的平均生長(zhǎng)速度相近，但其連續(xù)繼代培養(yǎng)特征不同，表現(xiàn)為繼代培養(yǎng)次數(shù)和最終壽命的差異，其中MG04-1和MG04-2分離株的總培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)分別為2 520 h和1 822 h，而MB04-1、MB04-2和MB04-3的總培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)則分別為1 512 h、3 814 h和863.5 h。此外，同一個(gè)子囊果相同部位（菌柄組織）的不同組織塊的組織分離菌株的壽命也不盡相同（表1）。這種現(xiàn)象在多個(gè)樣品的分離株繼代培養(yǎng)中均存在，如17-19、17-20、17-21、17-22和17-23等5個(gè)樣品的各自不同組織分離株的繼代培養(yǎng)中，沒(méi)有任何兩個(gè)組織分離株表現(xiàn)出一致的壽命；而17-17-1和17-17-3兩個(gè)分離株的菌絲總生長(zhǎng)距離相差近10倍（表1）。

單孢分離菌株也具有快速老化的特性，表現(xiàn)出有限壽命。18-114-M03A、18-114-M01B和18-114-M05A分別是18-114菌株的3個(gè)單子囊孢子分離菌株。這3個(gè)單孢菌株的平均長(zhǎng)速近似（0.51～0.52 mm/h）；但壽命不同，最短的744 h，最長(zhǎng)的997 h，均短于18-114-1組織分離株的壽命1 319 h（表1）。

3 討 論

同一子囊果不同部位（菌柄和菌蓋）的分離株、同一部位（菌柄）的不同組織分離株、不同的單孢分離株之間表現(xiàn)出不同的老化性質(zhì)，暗示羊肚菌子囊果不同組織細(xì)胞（包括子囊孢子）具有不同的生理和遺傳狀態(tài)。絲狀真菌菌絲以頂端生長(zhǎng)的方式進(jìn)行，菌絲最前端的細(xì)胞核在頂端細(xì)胞中發(fā)生有絲分裂，隨后隔膜在頂端細(xì)胞和亞頂端細(xì)胞之間形成，將部分細(xì)胞核割裂在頂端細(xì)胞內(nèi)繼續(xù)進(jìn)行新的有絲分裂，實(shí)現(xiàn)多核細(xì)胞結(jié)構(gòu)，依次形成新的細(xì)胞[17]；雖然隔膜孔的開(kāi)合允許細(xì)胞器在細(xì)胞間流動(dòng)，快速生長(zhǎng)的頂端細(xì)胞在持續(xù)的有絲分裂后可能就具有了后端細(xì)胞“不同”的細(xì)胞核遺傳物質(zhì)（錯(cuò)配修復(fù)、突變積累等導(dǎo)致的堿基突變的增加）。

本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格進(jìn)行尖端細(xì)胞的繼代培養(yǎng)，最大程度地確保菌絲一直朝一個(gè)方向生長(zhǎng)。理論上，經(jīng)過(guò)一定世代后，前端的菌絲細(xì)胞就有可能已經(jīng)和后端有所不同，這可能是造成供試材料在實(shí)驗(yàn)條件下發(fā)生明顯的快速老化的一個(gè)原因；而對(duì)照的擔(dān)子菌香菇菌株則一直沒(méi)有出現(xiàn)老化跡象。子囊菌中的柄孢殼、粗糙脈孢霉、白僵菌等也有快速老化的特性[7-9]。因此我們推測(cè)，作為一種大型子囊真菌，羊肚菌的快速老化是這一物種的本性。

本研究供試的大部分菌株，隨著繼代培養(yǎng)的延續(xù)，老化程度顯著加劇，特別是在供試高羊肚菌和六妹羊肚菌菌株中，平均壽命均偏低。此外，栽培試驗(yàn)表明，人工栽培的產(chǎn)量與繼代培養(yǎng)代數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，隨繼代培養(yǎng)代數(shù)的增加，產(chǎn)量急劇下降[5]。生產(chǎn)中肆意擴(kuò)繁會(huì)造成菌絲纖細(xì)、菌絲活力下降，產(chǎn)量降低。以上結(jié)果表明，測(cè)定即將用于商業(yè)化生產(chǎn)的菌株生長(zhǎng)曲線，了解其老化特性，選擇不易老化的菌株進(jìn)行推廣應(yīng)用，對(duì)羊肚菌高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

雖然目前還無(wú)法限定一個(gè)潛在高產(chǎn)菌株的最短壽命標(biāo)準(zhǔn)，但是依據(jù)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，傾向于認(rèn)定營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)2.5個(gè)月（生產(chǎn)中最短1個(gè)月可以出菇，但短的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)間不利于營(yíng)養(yǎng)的轉(zhuǎn)化和儲(chǔ)備，不利于高產(chǎn)）仍未出現(xiàn)明顯老化癥狀的菌株為潛在優(yōu)良菌株。若菌株出現(xiàn)了菌絲纖細(xì)、菌落不整齊、色素增加、菌核量下降和/或菌絲長(zhǎng)速下降時(shí)，可初步判定發(fā)生了衰老事件，不能用于生產(chǎn)。

不利的環(huán)境因素如高溫、富營(yíng)養(yǎng)容易造成菌株老化。因此，在菌種生產(chǎn)過(guò)程中，以低于23 ℃的低溫培養(yǎng)為宜。培養(yǎng)溫度偏高，菌絲生長(zhǎng)纖細(xì)，色素分泌加劇，菌核量少，甚至不產(chǎn)生菌核。在大田生產(chǎn)中，可通過(guò)低溫播種、遮陽(yáng)棚遮陽(yáng)等措施，營(yíng)造低溫發(fā)菌和養(yǎng)菌環(huán)境。營(yíng)養(yǎng)富足也是一個(gè)容易誘發(fā)衰老的外因。生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)表明，在純小麥、純玉米芯或過(guò)高比例的小麥栽培種培養(yǎng)基上培養(yǎng)，羊肚菌菌絲較易產(chǎn)生色素，不易形成菌核。另外，連續(xù)繼代培養(yǎng)代數(shù)過(guò)多、接種物比例過(guò)小、不科學(xué)的菌株保藏方法、保藏時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等也易加劇老化，影響商業(yè)栽培。

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國(guó)家食用菌產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-20）；湖北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)2020BBA041）

劉偉（1984—），男，博士，主要從事食用菌遺傳育種研究。

，E-mail：zhenpingliuwei@163.com。

Q93-3，S646

B

2095-0934（2021）01-044-06