浮游真菌對工廠化生產(chǎn)金針菇菌絲生長的影響試驗

蔡 婧 常堃 邊銀丙 肖 揚*

浮游真菌對工廠化生產(chǎn)金針菇菌絲生長的影響試驗

蔡 婧1，2常堃1，2邊銀丙1肖 揚1*

（1. 華中農(nóng)業(yè)大學應用真菌研究所，武漢 430070；2. 十堰市農(nóng)業(yè)科學院，湖北 十堰 442000）

采集金針菇工廠潔凈區(qū)域的浮游真菌樣本，通過對峙培養(yǎng)和真菌侵染性試驗觀察其對金針菇菌絲生長的影響。結果：小孢根霉（）、哈茨木霉（）、棘孢木霉（）、傘枝犁頭霉（）、黑曲霉（）、黃曲霉（）、馬菲氏青霉菌（）、尖孢枝孢霉（）、白囊耙齒菌（）、裂褶菌（）、撕裂蠟孔菌（）及串珠鐮刀菌（）等12種浮游真菌的菌絲生長速度快于或等于金針菇，對金針菇菌絲生長影響較大。其中哈茨木霉還能在已被金針菇菌絲封面的培養(yǎng)基上生長，具有競爭和侵染的雙重特性。

工廠化；金針菇；潔凈區(qū)；浮游真菌；對峙培養(yǎng)；菌絲生長

金針菇又名冬菇，富含精氨酸、賴氨酸、鋅等益于兒童智力發(fā)育的活性物質，營養(yǎng)價值高，味道鮮美，是我國工廠化生產(chǎn)的主要菇種之一[1-3]。為了降低雜菌基數(shù)和栽培瓶感染雜菌的風險，金針菇工廠的冷卻室和接種室設計成潔凈室，采用封閉式管理，通過空氣凈化設備防控雜菌的侵入。但潔凈室內(nèi)的換氣次數(shù)、發(fā)塵量、壓差控制、過濾器效率等會影響室內(nèi)潔凈度，其環(huán)境中不可避免存在一些微生物污染源。本研究對金針菇工廠的接種室、冷卻室等潔凈區(qū)域進行浮游真菌采樣，研究滅菌后、接種前的環(huán)境中浮游真菌與金針菇菌絲生長的關系，為生產(chǎn)企業(yè)制定有效的消毒措施、降低污染率提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 浮游真菌的采集

2013年5～9月，使用mas-100 eco固體撞擊式浮游菌采樣器，分別對冷卻室和接種室空氣中的微生物進行樣本采集，采樣高度距地面1.0 m，采樣器空氣流量為100 L/min，采樣時間7 min。采樣時，冷卻室中放入第一批處于高溫的滅菌培養(yǎng)料，設置11個采樣點。接種室有3臺接種機，兩名固定工作人員，采樣時間為接種時段，設置7個采樣點。樣本培養(yǎng)基采用SDA（sabouraud dextrose agar）培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿直徑9 cm。采樣后，SDA平板在（25±1）℃條件下培養(yǎng)5～7天。

觀察平皿中菌落的培養(yǎng)情況，不斷挑取單一的菌落轉接、分離、純化，經(jīng)多次純化后得到純培養(yǎng)物。此時培養(yǎng)皿內(nèi)只存有單一的菌落形態(tài)。挑取純培養(yǎng)的菌塊接種至裝有PDA培養(yǎng)基的試管內(nèi)，待長滿試管后，于4 ℃保藏備用。

1.2 分離微生物的鑒定

對分離菌株的ITS基因序列進行測定，將得到的序列結果提交至NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，按照與GenBank中已知序列相似性大于99%為相同種[4]的標準，鑒定分離菌株的種類。

1.3 金針菇菌絲與浮游真菌共同培養(yǎng)

采用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)金針菇與分離物，將按照文獻[5]的方法配制的培養(yǎng)基裝于25×200（mm）雙頭試管中，121 ℃滅菌1.5 h。采取以下兩種方法檢驗分離物對金針菇菌絲生長的影響。

（1）試管對峙培養(yǎng)試驗。在雙頭試管的一頭中接入直徑約7 mm的金針菇菌塊，于25 ℃恒溫箱內(nèi)避光培養(yǎng)10天后，在試管另一頭接入直徑約7 mm的分離物菌塊進行對峙培養(yǎng)，對照組為接入另一直徑約7 mm的金針菇菌塊，依然置于25 ℃恒溫箱內(nèi)避光培養(yǎng)。觀察兩種菌絲交界情況。

（2）真菌侵染性試驗。在試管中接入直徑約7 mm的金針菇菌塊，于25 ℃恒溫箱內(nèi)避光培養(yǎng)15天后，挑出金針菇接種菌塊，在同樣位置接入直徑約7 mm的分離物菌塊，依然置于25 ℃恒溫箱內(nèi)避光培養(yǎng)。觀察分離物即浮游真菌能否在已被金針菇菌絲封面的培養(yǎng)基上生長。

2 結果與分析

2.1 試管對峙培養(yǎng)表現(xiàn)

在潔凈區(qū)環(huán)境中共分離得到24種真菌（表1）。其中，棘孢木霉（）和小孢根霉（）的菌絲生長速度較快，在接種后第5天就與金針菇菌絲交界，比對照早10天；哈茨木霉（）和傘枝犁頭霉（）的菌絲在接種后第10天與金針菇菌絲交界，也快于對照；黑曲霉（）、黃曲霉（）、馬菲氏青霉菌（）、尖孢枝孢霉（）、白囊耙齒菌（）、裂褶菌（）、撕裂蠟孔菌（）及串珠鐮刀菌（）等8種浮游真菌的菌絲在接種后第15天與金針菇菌絲交界，與對照相似；其他12種浮游真菌菌絲均在接種后15天以上才與金針菇菌絲交界。

2.2 真菌的侵染性表現(xiàn)

在金針菇菌絲已封面的培養(yǎng)基上重新接種24種浮游真菌進行侵染性試驗的結果，僅哈茨木霉菌絲能夠生長（圖1上）。在接入哈茨木霉菌塊7天后，其菌絲覆蓋了金針菇菌絲，并產(chǎn)生大量孢子。包括馬菲氏青霉菌（圖1下）在內(nèi)的其他真菌均不能在金針菇菌絲已封面的培養(yǎng)基上生長。

表1 金針菇與浮游真菌試管對峙培養(yǎng)的菌絲交界所需時間

圖1 浮游真菌對金針菇侵染性試驗結果

注：上面箭頭所示為哈茨木霉，能生長；下面箭頭所示為馬菲氏青霉，不能生長。

3 結論與討論

從試管對峙培養(yǎng)結果看，小孢根霉、傘枝犁頭霉、棘孢木霉和哈茨木霉的菌絲生長較快，易感染封面前的金針菇菌絲，危害較大。黃曲霉、黑曲霉、馬菲氏青霉菌、尖孢枝孢霉、白囊耙齒菌、裂褶菌、撕裂蠟孔菌及串珠鐮刀菌的菌絲生長速度與金針菇菌絲生長速度不相上下，也有可能感染培養(yǎng)料。

根霉屬真菌的菌絲生長迅速，易感染用于食用菌栽培的棉籽殼培養(yǎng)基和小麥培養(yǎng)基[6]。傘枝犁頭霉是毛霉目、梨頭霉屬的絲狀真菌，主要分離于醋曲樣本[7]，其生長速度快，競爭性強。曲霉不僅和食用菌爭奪養(yǎng)分，還會分泌毒素抑制食用菌菌絲生長，最終導致栽培料報廢[8]。青霉菌能抑制食用菌菌絲生長，一旦覆蓋食用菌菌絲體，將導致無法出菇[9]。青霉主要在食用菌菌絲生長階段發(fā)生為害[8]?；ジ艚绘滄呙鼓芤鸲喾N植物病害，寄主范圍非常廣泛，包括谷類、蔬菜、油料作物、觀賞植物和水果等[10]，感染食用菌會引起食用菌培養(yǎng)料腐敗，使食用菌菌絲無法生長[8]。串珠鐮刀菌可引發(fā)植物根腐、莖腐、穗腐等癥狀[11]，也會引起平菇枯萎病[12]。以上真菌對食用菌生產(chǎn)均存在一定危害性。

枝孢屬真菌分布廣泛，幾乎存在于任何環(huán)境，一些枝孢屬真菌可侵染植物的枝條、葉片和果實，引起植物病害[13]。絲核薄膜革菌是煙草靶斑病的致病菌[14]。白囊耙齒菌是一種較常見的木腐真菌，我國除海南外，其他省份均有分布，是一種食藥用價值較高的常見真菌，近年來已經(jīng)馴化栽培成功[15, 16]。以上菌類目前尚未見其對食用菌的危害報道。

木霉屬真菌既能引起食用菌菌絲體的競爭性病害，還能引起侵染性病害。其菌絲生長速度都很快，均在接種后10天內(nèi)就與金針菇菌絲交界。木霉菌適應性強，傳播蔓延快[17]，優(yōu)勢木霉菌能侵入并覆蓋食用菌菌絲體[18]，寄生于多種食用菌子實體上。如香菇[19]、雙孢蘑菇[20]、平菇[21]、木耳[22]、金針菇[23]、草菇[24]、姬菇[25]、雞腿蘑[26]、靈芝[27]等幾乎所有食用菌在菌種制作及栽培過程中都易受其侵染危害。從侵染性試驗結果看，哈茨木霉的侵染性很強，可在已封面的金針菇培養(yǎng)基上生長，產(chǎn)生極大危害。

Savoie等[28]對香菇和哈茨木霉進行對峙培養(yǎng)的結果，其菌絲交界處常會產(chǎn)生棕褐色的拮抗線，在拮抗過程中，香菇菌絲所分泌的錳過氧化物還原酶活性降低，對峙培養(yǎng)后的香菇菌絲生長速度顯著減慢。Dennis等[29]的研究結果，哈茨木霉菌絲通過纏繞、產(chǎn)生鉤狀分枝纏繞及形成附著胞等3種方式作用于宿主菌絲。Wang等[30]研究發(fā)現(xiàn)哈茨木霉菌絲對香菇菌絲存在纏繞現(xiàn)象。在互作過程中，哈茨木霉所產(chǎn)生的幾丁質酶和1,3-β-D 葡萄糖苷酶的活性均高于其單獨培養(yǎng)，在降解真菌細胞壁時這些胞外酶有著關鍵作用[31, 32]。Badalyan等[33]對哈茨木霉與金針菇菌絲在平板內(nèi)進行對峙培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉能快速長滿平板并覆蓋金針菇菌絲。熊小龍[34]研究哈茨木霉對金針菇侵染能力，發(fā)現(xiàn)其存在種間的差異性，而哈茨木霉和金針菇間的作用機制還有待于探明。

根據(jù)本研究結果，金針菇工廠化生產(chǎn)環(huán)境中存有多種具有致病性的真菌，建議企業(yè)定期監(jiān)測潔凈室環(huán)境，掌握潔凈區(qū)的浮游真菌群落結構，采取相應的消毒措施，降低浮游真菌濃度，保證生產(chǎn)安全。

[1] Smiderle F R , Carbonero E R , Sassaki G L , et al. Characterization of a heterogalactan: Some nutritional

values of the edible mushroom[J]. Food Chemistry, 2008, 108(1): 329-333.

[2] Cai H , Liu X , Chen Z , et al. Isolation, purification and identification of nine chemical compounds fromfruiting bodies[J]. Food Chemistry, 2013, 141(3): 2873-2879.

[3] 李長田, 譚琦, 邊銀丙,等. 中國食用菌工廠化的現(xiàn)狀與展望[J]. 菌物研究, 2019, 17(1): 1-10.

[4] Landeweert R; Leeflang P; Kuyper TW; Hoffland E; Rosling A; Wernars K; Smit E. Molecular Identification of Ectomycorrhizal Mycelium in Soil Horizons[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(1): 327-333.

[5] 呂作舟. 食用菌栽培學 [M]. 高等教育出版社, 2006: 204.

[6] 盧東升, 王金平, 汪軍玲, 等. 食用菌污染真菌的調查研究[J]. 信陽師范學院學報:自然科學版, 2007(4): 70-73.

[7] 秦臻. 一株產(chǎn)生淀粉分解酶犁頭霉的分離鑒定及其酶學性質[J]. 微生物學通報, 2011, 38(5): 729-735.

[8] 李寶聚, 闞琳娜, 徐凱,等. 食用菌生產(chǎn)中主要競爭性病害的種類及其防控技術[J]. 中國蔬菜, 2005(12): 61-62.

[9] 邊銀丙. 食用菌病害鑒別與防控 [M]. 中原農(nóng)民出版社, 2016: 147.

[10] Logrieco A, Moretti A, Solfrizzo M.toxins and plant diseases: an overview of origin, occurrence and risks[J]. World Mycotoxin Journal, 2009, 2(2): 129-140.

[11] 劉新宇, 李大皓, 李佩瑤. 不同培養(yǎng)條件對哈茨木霉菌抑制串珠鐮刀菌能力的影響[J]. 安徽農(nóng)學通報, 2020, 26(10): 82-85.

[12] 張克勤, 李家俊. 食用平菇枯萎病—平菇的一種新病害[J]. 植物病理學報, 1992, 22(3): 223-228.

[13] Bensch K, Braun U, Groenewald J Z, et al. The genus[J]. Studies in mycology, 2012, 72: 1-401.

[14] 吳元華, 王左斌, 劉志恒, 等. 我國煙草新病害-靶斑病[J]. 中國煙草學報, 2006, 12(6): 22, 51.

[15] 董曉明, 宋新華, 劉寬博, 等. 藥用真菌白囊耙齒菌的研究現(xiàn)狀及展望[J]. 菌物學報, 2017, 36(1): 28-34.

[16] 馬布平, 劉書暢, 李榮春, 等. 裂褶菌的栽培研究[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版), 2019, 40(1): 11-21.

[17] 邊銀丙. 食用菌栽培學[M]. 高等教育出版社, 2017: 266.

[18] 邊銀丙. 食用菌病害鑒別與防控[M]. 中原農(nóng)民出版社, 2016: 141.

[19] 蔡丹鳳. 香菇爛筒病蟲害防治劑的篩選試驗[J]. 福建輕紡, 2005(8): 8-11.

[20] Seaby D A. Infection of mushroom compost byspecies[J]. Mushroom J, 1987, 179: 355-361.

[21] 張士義, 楊軍, 劉娜, 等. 平菇生產(chǎn)中木霉的防控技術[J]. 蔬菜, 2007(1): 28-29.

[22] 李冬霞. 黑木耳主要病蟲雜菌及其防治[J]. 植物醫(yī)生, 2006, 19(1): 13.

[23] 劉昆昂, 張根偉, 馬宏, 等. 金針菇主要侵染性病害及其預防措施[J]. 中國食用菌, 2018, 37(4): 82-85.

[24] 陳貴省. 草菇雜菌污染的綜合防治[J]. 植保技術與推廣, 2003(1): 16-17.

[25] 池惠榮, 王朝江, 高春燕. 不同姬菇品種對霉菌抗耐能力測定與分析[J]. 河北農(nóng)業(yè)科學, 2003, 7(4): 17-20.

[26] 暴增海, 馬桂珍. 不同雞腿蘑品種對霉菌抗耐能力的測定與分析[J]. 中國食用菌, 2002, 21(2): 12-13.

[27] 黃鑫偉, 嚴寅琿, 張通,等. 靈芝綠霉病病原菌的分離鑒定及快速檢測[J]. 植物保護學報, 2018, 45(6): 1435- 1436.

[28] Savoie J M, Delpech P, Billette C, et al. Inoculum adaptation changes the outcome of the competition betweenandspp. during shiitake cultivation on pasteurized wheat straw[J]. Mushroom Sci, 2000, 15: 667-674.

[29] Savoie J M, Mata G. The antagonistic action ofsp. hyphae tohyphae changes lignocellulotytic activities during cultivation in wheat straw[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 1999, 15(3): 369-373.

[30] Dennis C, Webster J. Antagonistic properties of species-groups of: III. Hyphal interaction[J]. Transactions of the British Mycological Society, 1971, 57(3): 363-369.

[31] Wang G, Cao X, Ma X, et al. Diversity and effect ofspp. associated with green mold disease onin China[J]. Microbiologyopen, 2016, 5(4): 709-718.

[32] Elad Y, Chet I, Boyle P, et al. Parasitism ofspp. onand Sclerotium rolfsii- scanning electron microscopy and fluorescence microscopy[J]. Phytopathology, 1983, 73(1): 85-88.

[33] Ridout C J, Coley-Smith J R, Lynch J M. Enzyme activity and electrophoretic profile of extracellular protein induced inspp. by cell walls of[J]. Microbiology, 1986, 132(8): 2345-2352.

[34] Badalyan S M, Innocenti G, Garibyan N G. Interactions between xylotrophic mushrooms and mycoparasitic fungi in dual-culture experiments[J]. Phytopathologia Mediterranea, 2004, 43(1): 44-48.

[35] 熊小龍. 四川金針菇木霉病害的研究及金針菇菌株抗性分析[D]. 雅安: 四川農(nóng)業(yè)大學, 2011.

國家食用菌產(chǎn)業(yè)技術體系（CARS-20）

蔡婧（1988—），女，碩士，農(nóng)藝師，主要從事食用菌育種與栽培研究。

，E-mail：xyfungi@163.com。

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2095-0934（2021）01-070-04