HPLC測定真菌及其制品中麥角甾醇含量

王曉琴 黃秀麗 陳月景 羅旋 胡嘉珊 翁嘉

摘要：本研究旨在找出真菌及其制品的特征指標，用于其質(zhì)量評價、摻偽鑒別等。建立了真菌及其制品中麥角甾醇含量測定的高效液相色譜法（HPLC），并利用建立的HPLC法對冬蟲夏草、破壁靈芝孢子粉等真菌及其制品以及螺旋藻、大豆油等6種植物油樣品進行麥角甾醇含量的測定。結(jié)果顯示，麥角甾醇在5～160μg/mL范圍內(nèi)具有較好的線性，線性相關(guān)系數(shù)大于0.999，檢出限為0.1μg/mL，平均回收率為86.32%～105.24%。螺旋藻以及大豆油等6種植物油中均未檢出麥角甾醇，真菌類及其制品中均含有麥角甾醇，麥角甾醇具有專屬性。該方法操作簡便、靈敏，且具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，可應(yīng)用于真菌及其制品中麥角甾醇含量的定量分析。

關(guān)鍵詞：真菌及其制品；麥角甾醇；專屬性，高效液相色譜法（HPLC）

中圖分類號：S567.3文獻標志碼：A論文編號：cjas20191000244

Determination of Ergosterol in Fungi and Its Products by HPLC

Wang Xiaoqin， Huang Xiuli， Chen Yuejing， Luo Xuan， Hu Jiashan， Weng Jia

（Huizhou Institute for Food and Drug Control， Huizhou 516000， Guangdong， China）

Abstract： The aim is to find out the characteristic indexes of fungi and its products for quality evaluation and adulteration identification. The HPLC method was established for determining ergosterol in fungi and its products. With the established HPLC method， the contents of ergosterol were determined in fungi and its products （Cordyceps sinensis and Ganoderma lucidum spores powder）， spirulina and six kinds of plant oil， such as soybean oil. The results showed that there was a good linearity in the range of 5-160μg/mL of ergosterol， the correlation coefficient was more than 0.999， the detection limit was 0.1μg/mL， and the average recovery was from 86.32% to 105.24%. Ergosterol was not determined in spirulina and six kinds of plant oil （such as soybean oil）， while it was detected in fungi and its products. Ergosterol had specificity in fungi and its products. This study suggests that the method is simple and sensitive， and has good repeatability and stability， thus it can be adopted to quantitatively analyze ergosterol in fungi and its products.

Keywords： Fungi and Its Products； Ergostero； Specificity； High Performance Liquid Chromatography （HPLC）

0引言

目前，真菌在保健方面的作用漸漸被大家所認識，如冬蟲夏草、靈芝孢子系列等產(chǎn)品已經(jīng)廣為大家所接受，另外在篩選新藥及尋找抗癌藥物方面，食藥用真菌也已作為重要的研究對象[1-3]。甾體類成分對真菌有著重要的生理功能，同時還具有多種生物學活性，因此研究真菌甾體類成分具有十分重要的理論意義和應(yīng)用前景[4-6]。

麥角甾醇是大型真菌中普遍存在的甾體類化合物，也是真菌類的特征甾醇，主要存在于絕大多數(shù)的真菌細胞膜中[7]，維系著真菌細胞的正常代謝[8]，可以增強人體抵抗疾病的能力，是重要的脂溶性維生素D2源[9-11]，具有明顯的抑菌、抗腫瘤功效[12-13]，其含量與真菌生物量存在相關(guān)性[14]，可以通過檢測麥角甾醇含量來測量真菌的生物量。

目前，真菌中麥角甾醇的含量研究已經(jīng)有了一些成果，靈芝、靈芝孢子油，香菇，喇叭菌、美味牛肝菌、冬蟲夏草等已有研究，不同真菌中麥角甾醇的提取方法主要有皂化回流[16]、超臨界提取[17]、閃式提取[18]和超聲輔助提取[19]等，對麥角甾醇的定性與定量分析研究主要報道的方法有UV法[20]、毛細管電泳法[21]、高效液相色譜法[22- 23]、液相色譜-質(zhì)譜法[8，24]和氣相色譜-質(zhì)譜法[25-26]等，與其他方法相比，HPLC分析不需要進行衍生化，操作簡單，結(jié)果可靠。關(guān)于真菌中多糖的研究開發(fā)較多，但是麥角甾醇作為食藥用真菌所含有的一種重要資源還沒有得到廣泛開發(fā)利用，現(xiàn)有研究大多集中于單一種類真菌中麥角甾醇的研究，系統(tǒng)研究較少，同時也缺乏菌類麥角甾醇檢測的國家標準，導致把關(guān)不嚴，市場上銷售的真菌質(zhì)量參差不齊，尤其摻假靈芝孢子油的亂象不斷。因麥角甾醇在大部分植物中不含有或含量很小，其良好的特異性和穩(wěn)定性使其可作為真菌的特征指標，建立麥角甾醇含量測定的方法，對于推動其在食藥用真菌及其產(chǎn)品質(zhì)量控制與評價中的應(yīng)用具有重要作用。

本研究旨在提取真菌及其制品中的麥角甾醇，建立高效液相色譜（HPLC）測定方法，為食藥用真菌的進一步研究和開發(fā)利用提供依據(jù)，同時為食藥用真菌質(zhì)量評價提供方法參考。

1材料與方法

1.1儀器

高效液相色譜儀（島津LC-20A），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀

（BUCHI Rotavaper R-210）。

1.2材料與試劑

麥角甾醇標準品為HPLC級，純度≥98%，購于中檢院。冬蟲夏草，蛹蟲草，赤靈芝子實體，紫芝子實體，靈芝孢子粉、豬苓、猴頭菇、香菇、樺褐、黑木耳、茯苓、靈芝孢子油、螺旋藻購買于專賣店、藥店或官方旗艦店，菜籽油、大豆油、玉米油、葵花籽油、花生油和橄欖油購于當?shù)卮笮唾徫锍?。色譜分析用流動相甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。試驗在惠州市食品藥品檢驗所食品室，于2018年10月—2019年5月進行。

1.3實驗方法

1.3.1色譜條件色譜柱為ODS-2 HYPERSIL（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相為甲醇；流速1 mL/min；檢測波長282 nm；柱溫37℃；進樣量10μL；外標法定量。

1.3.2對照品溶液的制備準確稱取20 mg（精確至 0.0001 g）麥角甾醇于20 mL棕色容量瓶中，用甲醇-三氯甲烷溶液（1：1，V/V）定容至刻度，搖勻，即得（濃度為1 mg/mL）。

1.3.3供試品溶液的制備稱取約0.5 g粉碎后樣品（精確至0.001 g）于100 mL密封玻璃容器中，加入40 mL 50 g/L的氫氧化鈉-甲醇溶液，混勻后于80℃水浴皂化1 h，皂化后立即用冷水冷卻至室溫。

將皂化液轉(zhuǎn)移到250 mL的分液漏斗中，加入50 mL石油醚，振蕩提取，將下層溶液轉(zhuǎn)移至另一250 mL的分液漏斗中，重復(fù)提取1次，合并醚層。將醚層并入蒸發(fā)瓶內(nèi)，于50℃水浴中減壓蒸餾濃縮，待瓶中醚液近干時，取下蒸發(fā)瓶。用甲醇-三氯甲烷溶液（1：1，V/V）將蒸發(fā)瓶中殘留物溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL棕色容量瓶中，定容至刻度。過0.45μm有機系濾膜，待上機測定。

2結(jié)果與分析

2.1提取條件的選擇

對2種水解液（50 g/L NaOH-甲醇溶液；50 g/L KOH-乙醇溶液）、水解液體積（20、30、40 mL）、皂化溫度（40、60、70、80、90℃）、皂化時間（30、45、60、75、120 min）等因素進行了考察。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種水解液中，相同提取條件下以50 g/L氫氧化鈉-甲醇溶液提取效果較佳。水解液體積（20、30、40 mL）對麥角甾醇提取率影響不大，差異不顯著，考慮到真菌類樣品菌絲體較輕，所占體積較大，為了保證樣品能皂化完全同時又不造成浪費，選用水解液體積為40 mL?？疾炝瞬煌砘瘻囟葘溄晴薮继崛÷实挠绊懀l(fā)現(xiàn)80℃和90℃下皂化效果均較佳，從安全及能耗等方面考慮，確定皂化溫度為80℃。對80℃下皂化時間進行了考察，發(fā)現(xiàn)隨著皂化時間的延長，提取率不斷升高，當皂化時間為60 min時，麥角甾醇提取率最高，皂化時間為120 min時，提取率反而有所下降，為此確定皂化時間為60 min。

2.2色譜條件的選擇

2.2.1檢測波長的選擇利用紫外分光光度計對麥角甾醇標準品進行掃描，波長范圍為190～700 nm，結(jié)果麥角甾醇在282 nm處具有最大吸收峰，為此確定麥角甾醇檢測波長為282 nm。

2.2.2流動相的選擇檢測麥角甾醇常用流動相有甲醇、甲醇-水等洗脫系統(tǒng)。本實驗考察了不同比例甲醇-水作為流動相的差別，結(jié)果顯示，在不同配比條件下隨著水比例的增加，麥角留醇峰形變低、變寬、保留時間變長，在100%甲醇的比例下，不但出峰時間提前，其響應(yīng)值也相對提高，麥角留醇峰形窄、對稱，可以與樣品中其他成分分開，而且實驗操作簡單、方便、快捷。故本研究選用100%甲醇作為流動相，麥角甾醇保留時間在14.421 min，柱效和峰形良好。

2.2.3色譜柱的選擇比較了幾種不同類型、不同品牌的C18反相色譜柱的色譜分離效果，實驗結(jié)果表明，麥角甾醇在以純甲醇為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫為37℃時，色譜柱上均有較好的分離效果。

2.3線性關(guān)系、方法檢出限及定量限

以對照品溶液為原液，依次配制成濃度為5、10、20、40、80、120、160μg/mL的系列對照品溶液。按照“1.3.1”色譜條件進行分析，測定對照品的峰面積。以峰面積為縱坐標，麥角甾醇濃度為橫坐標，繪制標準曲線，結(jié)果見表1。線性回歸方程如式（1）。結(jié)果表明，麥角甾醇在5～160μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

Y=14.054X+5.421 R2=0.9998………………（1）

2.4精密度試驗

在上述色譜條件下，以濃度為80μg/mL的對照品溶液為考察對象，依法連續(xù)測定6次，得麥角甾醇峰面積的RSD為0.059%，表明本方法精密度良好。

2.5穩(wěn)定性試驗

取靈芝孢子粉樣品，制備的供試品溶液室溫放置，放置1、2、3、4、6、12 h后各測定1次，共測定6次，得麥角甾醇峰面積的RSD為2.88%，表明供試品溶液中麥角甾醇在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6重復(fù)性試驗

精密稱取同一靈芝孢子粉試樣6份，按照“1.3.3”制備供試品，按照“1.3.1”方法進行測定。結(jié)果表明，麥角甾醇平均含量為1.24 mg/g，RSD為1.81%（n=6），本方法重復(fù)性較好。

2.7實測樣品及加標回收率

選取冬蟲夏草、蛹蟲草、赤靈芝子實體、紫芝子實體、猴頭菇、香菇、黑木耳、樺褐、豬苓、茯苓、破壁靈芝孢子粉、靈芝孢子油和螺旋藻、大豆油、玉米油、葵花籽油、花生油、菜籽油、橄欖油加入0.6 mg和0.8 mg標準品，制備樣品并進行測定，重復(fù)3次，結(jié)果見表2、圖1。冬蟲夏草加標回收率在86.38%～101.00%，RSD為4.00%；蛹蟲草加標回收率在88.62%～102.00%，RSD為2.09%；赤靈芝子實體加標回收率在88.00%～100.67%，RSD為0.88%；紫芝子實體加標回收率在86.33%～ 95.50%，RSD為4.82%；破壁靈芝孢子粉加標回收率在88.00%～99.63%，RSD為3.60%；豬苓加標回收率在88.12%～104.50%，RSD為1.14%；猴頭菇加標回收率在89.33%～105.33%，RSD為2.63%；香菇加標回收率在88.75%～107.50%，RSD為3.12%；樺褐加標回收率在86.00%～92.90%，RSD為3.51%；黑木耳加標回收率在90.75%～97.17%，RSD為2.07%；茯苓加標回收率在89.75%～95.32%，RSD為5.19%；靈芝孢子油加標回收率在86.00%～94.17%，RSD為0.53%；螺旋藻加標回收率在99.48%～101.40%；大豆油加標回收率在91.76%～ 98.58%；玉米油加標回收率在89.99%～96.27%；葵花籽油加標回收率在90.75%～97.52%；花生油加標回收率在88.03%～101.25%；菜籽油加標回收率在93.93%～ 98.60%；橄欖油加標回收率在91.92%～93.70%；各試樣中加回標收率在86.38%～105.33%，可滿足含量測定的需求。

3討論

本研究采用NaOH-甲醇溶液皂化提取麥角甾醇，相對于傳統(tǒng)的皂化回流，操作更為簡便，而且比超聲法提取的麥角甾醇含量多，究其原因，真菌中含有游離麥角甾醇及酯化麥角甾醇[27-28]，真菌中的酯化麥角甾醇在NaOH-甲醇溶液中發(fā)生水解產(chǎn)生游離麥角甾醇，最終提取的是總的麥角甾醇，采用超聲法只能提取游離的麥角甾醇，故選取NaOH-甲醇溶液皂化提取麥角甾醇。有文獻報道用紫外分光光度法測定靈芝制品中的麥角甾醇含量[29]，但該法所測結(jié)果受三氯甲烷的紫外吸收及樣品中其他雜質(zhì)的干擾[30]，重復(fù)性差，同時測得含量還較高，故本研究應(yīng)用高效液相色譜法，可以有效排除干擾，不僅特異性強，而且結(jié)果準確度也高，能比較真實地反映其實際水平。

4結(jié)論

本研究建立了真菌及其制品中麥角甾醇含量測定的高效液相色譜法（HPLC），麥角甾醇在5～160μg/mL范圍內(nèi)具有較好的線性，線性相關(guān)系數(shù)大于0.999，檢出限為0.1μg/mL，平均回收率為86.32%～105.24%，該方法操作簡便、靈敏，且具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，可應(yīng)用于真菌及其制品中麥角甾醇含量的定量分析。利用建立的HPLC法對冬蟲夏草、破壁靈芝孢子粉等真菌及其制品以及螺旋藻、大豆油等6種植物油樣品進行麥角甾醇含量的測定，螺旋藻以及大豆油等6種植物油中均未檢出麥角甾醇；真菌類及其制品中均含有麥角甾醇。由此可見，麥角甾醇具有專屬性，可作為真菌及其制品的特征指標，用于質(zhì)量評價、摻偽鑒別等。

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