印跡基因PHLDA2在孕婦子癇前期胎盤中的差異表達(dá)和甲基化狀態(tài)

朱 好 胡 蓉 顧蔚蓉

（復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院產(chǎn)科 上海 200011）

PLHLDA2（Pleckstrin homology-like domain，family A，member 2）是位于染色體11p15的母源性印跡基因，主要在胎盤中表達(dá)，既往研究發(fā)現(xiàn)PHLDA2與子代出生體重呈負(fù)相關(guān)［1-2］，通過促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡、抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲，在妊娠并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用［3］。本研究采用Realtime PCR和焦磷酸甲基化測(cè)序方法檢測(cè)子癇前期孕婦胎盤組織中印跡基因PHLDA2的表達(dá)改變和甲基化差異，初步了解PHLDA2與子癇前期的關(guān)系。

資料和方法

研究對(duì)象 早發(fā)型子癇前期4例、晚發(fā)型子癇前期16例及正常對(duì)照組30例子代胎盤組織均來(lái)源于復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院2017年6月—2018年12月分娩的產(chǎn)婦。各組孕婦知情同意將組織進(jìn)行科學(xué)研究，本研究獲得復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：Kyy2016-42）。

納入標(biāo)準(zhǔn) 子癇前期組為根據(jù)《婦產(chǎn)科學(xué)》（第九版）［4］教材，符合子癇前期及慢性高血壓并發(fā)子癇前期，系自然妊娠且無(wú)其他妊娠合并癥者的胎盤組織；其中發(fā)病孕周＜34周者為早發(fā)型子癇前期，發(fā)病孕周≥34周者為晚發(fā)型子癇前期。正常對(duì)照組為自然妊娠且無(wú)妊娠合并癥者的胎盤組織。

排除標(biāo)準(zhǔn) 合并內(nèi)科或外科的合并癥，包括糖尿病、腎炎、心臟病、貧血、肝炎、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥、性傳播性疾病，以及其他孕婦內(nèi)外科疾病。合并妊娠期或分娩期的并發(fā)癥，如前置胎盤、胎盤早剝、產(chǎn)時(shí)發(fā)熱、胎兒窘迫、羊水量異常、胎兒畸形、巨大兒、胎兒貧血、胎兒先天性疾病等。

妊娠結(jié)局及新生兒情況 記錄各組一般信息、分娩方式、孕齡和新生兒出生體重、Apgar評(píng)分等。

標(biāo)本采集 胎盤娩出后立即無(wú)菌下留取母體面中央?yún)^(qū)胎盤組織（避開鈣化區(qū)），剪去表面蛻膜組織后，留取約200 mg組織塊，置凍存管中后置液氮罐中，30 min后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱儲(chǔ)存。

Real-time PCR取約直徑5 mm凍存胎盤組織加入1 mL Trizol，充分研磨后抽提總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定RNA純度并計(jì)算其濃度。1%瓊脂糖凝膠電泳分析其產(chǎn)物，確定RNA完整性。采用20 μL反轉(zhuǎn)錄體系，試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司。NCBI查詢mRNA序列，primer3軟件篩選出一對(duì)cDNA引物（蘇州金唯智公司合成）。PHLDA 2上游引物序列5’-GCTTCCACTCCATCCTCAAG-3’，下游引物5’-GGTTCTGG-AAATCGATGAGC-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)159 bp；GAPDH上游引物序列5’-GCGAGATCCCTCCAAAATCAA-3’，下游引物序列 5’-GTTCA-CACCCATGACGAACAT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)172 bp。使用7500 Fast Real-time PCR System，采用10μL反應(yīng)體系，95℃預(yù)變性2 min，95℃變性5 s，60℃退火10 s，45個(gè)循環(huán)后反應(yīng)結(jié)束，確認(rèn)Realtime PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線，進(jìn)行PCR相對(duì)定量。目的基因mRNA的表達(dá)水平根據(jù)PCR擴(kuò)增曲線所得CT值，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，比較內(nèi)參基因與目的基因的CT值，得出各標(biāo)本之間目的基因 表 達(dá) 量 的 多 少 。 計(jì) 算 公 式 ：ΔCT=CT目的基因-CT管家基因；相對(duì)含量（%）=2-ΔΔCT×100%，其中ΔΔCT=（CT目的基因-CT管家基因）實(shí)驗(yàn)組-（CT目的基因-CT管家基因）對(duì)照組。

焦磷酸甲基化測(cè)序 啟動(dòng)子區(qū)Cp G島引物由PyroMark Assay Design 2.0設(shè)計(jì)，由生工基因合成，所選擇Cp G島區(qū)域設(shè)計(jì)焦磷酸測(cè)序模板制備引物和測(cè)序引物。PHLDA 2上游引物序列5’-GTAATGGGTATAGTGATGTAAAAATAAGAT-3’，下游引物序列3’-CACAACTC-TCTAACCCAATCCTTTC-5’，測(cè)序引物序列 5’-ATTAGATAGTTTAATAATTTAAGG-3’。使用QIAGEN基因組DNA抽提試劑盒，從凍存胎盤組織中提取基因組DNA，計(jì)算所提取DNA含量并保存，對(duì)基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理。應(yīng)用PyroMark Q48軟件對(duì)焦磷酸測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 分析采用SPSS l7.0軟件包，計(jì)數(shù)資料采用χ2及Fisher精確檢驗(yàn)；計(jì)量資料比較采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)，結(jié)果用表示。

結(jié)果

臨床資料 與正常對(duì)照組比較，早發(fā)型子癇前期組分娩孕周?。≒＜0.000）、手術(shù)助產(chǎn)率高（P=0.015）、新生兒出生體重低（P＜0.000）、1 min低Apgar評(píng)分率高（P＜0.000）；晚發(fā)型子癇前期組手術(shù)助產(chǎn)率高（P=0.012），如表1所示。進(jìn)一步比較早發(fā)型子癇前期在分娩孕周（P＜0.000）、出生體重（P＜0.000）、1 min低 Apgar評(píng)分發(fā)生率（P=0.003）較晚發(fā)型病情更早更重。本研究中有2例SGA均為早發(fā)型子癇前期，出生體重分別為1 650 g（35+2周）、1 720 g（36+4周），3組均無(wú)新生兒死亡。

子癇前期PHLDA2 mRNA的表達(dá)改變 用SYBR GreenⅠ熒光Real-time PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，晚發(fā)型子癇前期組胎盤PHLDA2的mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯降低（P=0.019），而早發(fā)型子癇前期與晚發(fā)型、正常對(duì)照組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如表2所示。

表1 早發(fā)型、晚發(fā)型子癇前期組與正常對(duì)照組臨床資料的比較Tab 1 Clinical features and obstetrical outcomes among the three groups

表2 3組胎盤印跡基因PHLDA2表達(dá)差異比較Tab 2 The expression of PHLDA2 in placenta among the three groups

子癇前期PHLDA2啟動(dòng)子甲基化的表達(dá)改變用焦磷酸甲基化測(cè)序的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，各組之間的胎盤組織中PHLDA2啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000），由高到低依次為早發(fā)型、晚發(fā)型、對(duì)照組（表3）。

討論本研究檢測(cè)了子癇前期組和正常對(duì)照組胎盤組織中PHLDA2基因表達(dá)和啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況，結(jié)果顯示子癇前期組胎盤組織中PHLDA2 mRNA表達(dá)降低，而啟動(dòng)子區(qū)呈高甲基化表達(dá)狀態(tài)。這一結(jié)果在子癇前期的研究中為首次報(bào)道。

子癇前期的發(fā)病率約為7%～10%［5-6］，占孕產(chǎn)婦死亡的 9.2%［5，7］，影響圍產(chǎn)兒結(jié)局和遠(yuǎn)期預(yù)后［8］，其中早發(fā)型子癇前期發(fā)生胎盤組織病變比晚發(fā)型更常見，易導(dǎo)致更嚴(yán)重的母體及胎兒并發(fā)癥［9-10］，因此需要更積極的臨床干預(yù)。本研究中早發(fā)型患者分娩孕周較晚發(fā)型和正常對(duì)照產(chǎn)婦平均提前了約3周，且均接受了剖宮產(chǎn)終止妊娠，分娩孕周的提前導(dǎo)致了新生兒出生體重較低，發(fā)生1 min低Apgar評(píng)分較多，這些結(jié)局與早發(fā)型子癇前期的病情出現(xiàn)更早、母兒并發(fā)癥更嚴(yán)重相關(guān)。

表3 3組中PHLDA2啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況比較Tab 3 The methylation statue in promoter region of PHLDA2 among three groups

子癇前期胎盤娩出后臨床癥狀和體征可自然消退，因此被認(rèn)為是與胎盤密切相關(guān)的疾病，并且可能是一種與母系表達(dá)的印跡基因異常的疾病［11］。從表觀遺傳學(xué)角度探討印跡基因?qū)ψ甜B(yǎng)細(xì)胞侵襲行為的調(diào)控分子機(jī)制與印跡基因中胞嘧啶甲基化尤其是Cp G島的甲基化密切相關(guān)［12］。本研究中子癇前期孕婦PHLDA2啟動(dòng)子區(qū)呈高甲基化表達(dá)，提示表觀遺傳的改變可能是導(dǎo)致胎盤內(nèi)PHLDA2 mRNA的表達(dá)抑制的原因，從而導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生和發(fā)展。印跡基因異常表達(dá)所導(dǎo)致的妊娠期并發(fā)癥往往還與胎盤功能異常有關(guān)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PHLDA2基因表達(dá)與胎兒及胎盤重量呈負(fù)相關(guān)［13-14］，限制胎盤糖原累積［14］。對(duì)人類胎盤的研究中發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)PHLDA2可導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞功能下降，使胎盤功能受限，進(jìn)一步導(dǎo)致FGR、早產(chǎn)、流產(chǎn)等妊娠并發(fā)癥［1，3］。低表達(dá)PHLDA2 可導(dǎo)致出生體重增加和胎盤肥大［15］。本研究結(jié)果中PHLDA2 mRNA在胎盤內(nèi)的表達(dá)減少與既往FGR的研究結(jié)果相反，提示晚發(fā)型子癇前期胎盤PHLDA2表達(dá)較少，也可能是缺氧導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力降低后的反向保護(hù)作用。

綜上，本研究觀察到印跡基因PHLDA2在子癇前期胎盤內(nèi)的表達(dá)差異和表觀遺傳學(xué)改變，初步了解基因的低表達(dá)和啟動(dòng)子區(qū)Cp G島高甲基化與子癇前期的關(guān)系，為子癇前期分子機(jī)制提供了依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)聲明朱好 論文設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計(jì)分析，論文撰寫和修訂。胡蓉 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，修訂論文。顧蔚蓉 論文構(gòu)思和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。