NGAL和KIM-1檢測在兒童膿毒癥合并急性腎損傷中的診斷價值

徐佳音 朱海燕 徐 錦

（復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心 上海 201102）

膿毒癥（sepsis）是機(jī)體對感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致威脅生命的器官功能障礙［1］。急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）被認(rèn)為是與死亡率獨(dú)立相關(guān)的危重病并發(fā)癥［2-3］。膿毒癥兒童合并AKI發(fā)病迅速，死亡率高。目前，AKI診斷標(biāo)準(zhǔn)由2012年KDIGO（Kidney Disease Improving Global Outcomes）發(fā)布，通過尿量減少或血肌酐較其基礎(chǔ)值升高進(jìn)行診斷，但掌握肌酐基礎(chǔ)值后診斷AKI需要一定時間的觀察［4］。應(yīng)用KDIGO標(biāo)準(zhǔn)診斷AKI仍存在一定數(shù)量的漏診率［5］，特別對危重癥患者仍存在局限性。除了肌酐和尿量，胱抑素C（cystatin C，CysC）、視黃醇結(jié)合蛋白（retinol-binding protein，RBP）也是臨床上評價腎功能的常用指標(biāo)。中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）和 腎 損 傷 因 子 1（kidney injury molecule 1，KIM-1）是近年診斷AKI的新的生物標(biāo)志物。NGAL最早被報道于先天性心臟病患兒體外循環(huán)術(shù)后合并AKI時具有早期提示的作用，近年來的研究逐漸關(guān)注當(dāng)其他疾病合并AKI時它是否同樣具有良好的診斷價值；KIM-1被認(rèn)為是一種潛在的AKI標(biāo)志物，但總體報道少，并多集中在尿液中KIM-1的診斷價值上。兩個標(biāo)志物在危重癥兒童AKI中應(yīng)用的報道均不多?；贏KI是一種與原發(fā)疾病息息相關(guān)的綜合征，同時危重癥兒童往往病情復(fù)雜，發(fā)展迅速，本研究擬通過收集不同時點(diǎn)的樣本，對血NGAL和KIM-1指標(biāo)在膿毒癥患兒AKI早期診斷以及特殊治療過程中的臨床應(yīng)用價值進(jìn)行探討。

資料和方法

臨床資料連續(xù)納入2019年1—12月診斷膿毒癥、入住復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室的患兒82例。膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)按《兒童膿毒性休克（感染性休克）診治專家共識（2015版）》［6］。按照排（剔）除標(biāo)準(zhǔn)除去13例。排除標(biāo)準(zhǔn)為各類結(jié)締組織病（如類風(fēng)濕、皮肌炎）、慢性腎臟?。ㄈ缏阅I損傷）及腫瘤、免疫缺陷等基礎(chǔ)疾病的患兒。剔除標(biāo)準(zhǔn)為住院24 h內(nèi)死亡或自動出院者。最終納入膿毒癥的患兒69例。根據(jù)膿毒癥同期是否合并AKI分為膿毒癥AKI組和膿毒癥非AKI組。AKI的診斷標(biāo)準(zhǔn)按2012年KDIGO發(fā)布的48 h內(nèi)血肌酐升高＞26.5 μmol/L或大于基礎(chǔ)值的1.5倍（確認(rèn)或推測7天發(fā)生）或持續(xù) 6 h以上尿量少于 0.5 mL·kg-1·h-1。根據(jù)診斷膿毒癥24 h內(nèi)是否行連續(xù)性腎臟替代治療（continuous renal replacement therapy，CRRT），將膿毒癥AKI組進(jìn)一步分為膿毒癥AKI-CRRT組和膿毒癥AKI-非CRRT組。CRRT治療組均采用連續(xù)靜脈-靜脈血液濾過透析模式（continuous venovenous hemodiafiltration，CVVHDF）。超濾量根據(jù)臨床治療要求設(shè)定在 0.5～5 mL·kg-1·h-1，透析量及濾過液量均設(shè)定為 25 mL·kg-1·h-1［7-8］，將尿量及超濾量相加作為共同的觀察指標(biāo)。本研究獲復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批件號：復(fù)兒倫申〔2019〕315）。

研究方法留取膿毒癥AKI和非AKI患兒3個時點(diǎn)（入院后0 h、24 h、72 h）和正常對照組體檢時（所用標(biāo)本為生化檢測剩余血清，≤0.5 mL）的靜脈血，3 350×g離心5 min，吸取血清放置-70℃冰箱保存?zhèn)溆?，并檢測 NGAL、KIM-1、肌酐、CysC、RBP。NGAL和KIM-1檢測：采用ELISA方法，試劑為美國R&D公司的Human Lipocalin-2/NGAL Immunoassay和Human Serum TIM-1/KIM-1/HAVCR Immunoassay檢測試劑盒。肌酐、CysC、RBP檢測：使用美國貝克曼庫爾特有限公司AU5800全自動生化儀檢測。肌酐檢測原理為酶法，CysC和RBP檢測原理為免疫濁度法。檢測試劑、定標(biāo)品、質(zhì)控品均與儀器配套。尿量計(jì)量：記錄24 h時及之后每個研究觀察時點(diǎn)為起點(diǎn)的24 h尿量（mL），以患兒每公斤（kg）每小時（h）的尿量報告（mL·kg-1·h-1）；記錄膿毒癥AKI-CRRT治療組患兒超濾量（mL），以患兒每公斤（kg）每小時（h）的形式報告（mL·kg-1·h-1），并將兩者相加。小樣本量方法驗(yàn)證NGAL、KIM-1試劑盒提供的參考區(qū)間，納入正常兒童均為“建立中國兒童臨床常規(guī)檢驗(yàn)指標(biāo)參考區(qū)間”課題招募的正常體檢兒童，符合倫理要求［9］。檢測納入研究的22例正常兒童的血NGAL、KIM-1水平，如檢測數(shù)據(jù)有離群值，剔除后補(bǔ)齊驗(yàn)證樣本量。檢測數(shù)據(jù)≤2個結(jié)果超出待驗(yàn)證區(qū)間，驗(yàn)證通過；檢測數(shù)據(jù)＞3個結(jié)果超出待驗(yàn)證區(qū)間，則需要檢查分析程序，根據(jù)參考人群差異自建參考區(qū)間［10］。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析正態(tài)分布的計(jì)量資料用表示，非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)和四分位間距M（P25，P75）表示。分類資料統(tǒng)計(jì)使用χ2檢驗(yàn)，組間比較用非參數(shù)檢驗(yàn)k個獨(dú)立樣本Kruskal-Wallis H比較，膿毒癥AKI-CRRT組各時點(diǎn)間的比較用Friedman非參數(shù)檢驗(yàn)。使用受試者工作特征（ROC）曲線評價肌酐、尿量、NGAL、KIM-1、CysC和RBP對AKI患兒的診斷價值，取約登指數(shù)最大時的靈敏度和特異性。以雙側(cè)檢驗(yàn)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 22.0軟件分析，Graphad Prism8軟件繪制箱式圖。

結(jié) 果

臨床資料膿毒癥AKI組28例，住院天數(shù)9～175天（M=23天）。膿毒癥非AKI組41例，住院天數(shù)7～66天（M=25.5天）。膿毒癥AKI組中進(jìn)行CRRT治療者18例，膿毒癥AKI與非AKI患兒的臨床信息見表1。正常對照組：選取同期體檢的健康兒童共22例（男性12例，女性10例），其中＜1歲9例，1～4歲4例，5～9歲3例，≥10歲6例。正常對照組年齡和性別與病例組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 膿毒癥AKI和膿毒癥非AKI組患者的一般臨床資料Tab 1 General clinical data of patientsin sepsis AKI and sepsis non-AKI group ［n（%）］

血NGAL、KIM-1參考區(qū)間驗(yàn)證NGAL試劑盒參考區(qū)間42～177 ng/mL，檢測數(shù)據(jù)41.18～57.98 ng/mL，均值（49.5±4.44）ng/mL，1例超出待驗(yàn)證區(qū)間，驗(yàn)證通過。KIM-1試劑盒參考區(qū)間0～56.9 pg/mL，檢 測 數(shù) 據(jù) 14.04～52.39 pg/mL，均 值（31.43±9.86）pg/mL，均未超出待驗(yàn)證區(qū)間，驗(yàn)證通過。采用驗(yàn)證通過的區(qū)間作為本研究的正常參考區(qū)間。

膿毒癥AKI患兒各指標(biāo)的檢測結(jié)果NGAL在膿毒癥AKI組和膿毒癥非AKI組各時點(diǎn)的檢測水平均高于正常對照組，膿毒癥AKI組顯著高于膿毒癥非 AKI組（P均＜0.05）。24 h、72 h時膿毒癥AKI和非AKI患兒的KIM-1均高于正常對照組，這2個時點(diǎn)膿毒癥AKI患兒的KIM-1顯著高于膿毒癥非AKI患兒（P均＜0.05）。肌酐在3個時點(diǎn)、CysC和RBP在后2個時點(diǎn)時，膿毒癥AKI組均明顯高于非AKI組（P均＜0.05，表2）。

表2 膿毒癥AKI和非AKI患兒與正常對照組各指標(biāo)檢測結(jié)果比較Tab 2 Comparison of various biomarkers at different timepoints among sepsis AKI group，sepsis non-AKIgroup and normal control group ［M（P25，P75）］

膿毒癥AKI-CRRT組、膿毒癥AKI-非CRRT組和膿毒癥非AKI組各指標(biāo)檢測結(jié)果比較0 h及之后各觀察時點(diǎn)，NGAL、肌酐在膿毒癥AKI-CRRT組和膿毒癥AKI非CRRT組的檢測水平均高于膿毒癥非AKI組（P均＜0.05）。KIM-1、CysC、RBP在24 h和72 h時，膿毒癥AKI-CRRT組及非CRRT組患兒均高于膿毒癥非AKI組（P均＜0.05）。膿毒癥AKI患者無論是否進(jìn)行CRRT治療，尿量均低于膿毒癥非AKI組，CRRT治療組24 h時點(diǎn)的尿量+超濾量高于非CRRT組（P均＜0.05）。進(jìn)行CRRT治療的膿毒癥AKI患兒，與0 h時點(diǎn)相比，肌酐在24 h顯著升高，72 h較24 h明顯下降（P均＜0.05），NGAL、KIM-1、CysC在24 h顯著升高后保持平穩(wěn)（P均＜0.05），尿量、RBP在各時點(diǎn)均無顯著變化（圖1A～G）。

圖1 膿毒癥AKI-CRRT組和非CRRT組及膿毒癥非AKI組各檢測指標(biāo)的比較Fig 1 Comparison of various biomarkers among sepsis AKI-CRRT group，sepsis AKI-non-CRRT group and sepsis non-AKI group

經(jīng)CRRT治療的膿毒癥-AKI患兒各指標(biāo)診斷價值比較NGAL在0 h時的AUC面積最大（0.907），敏感度最高（92%），特異性最強(qiáng)（78.6%）。24 h時NGAL、KIM-1、肌酐和CysC均顯示良好的診斷效能，NGAL仍顯示了最高的敏感性（96%）和特異性（98.6%）。72 h時NGAL和KIM-1的診斷效能優(yōu)于其他指標(biāo)，兩指標(biāo)的AUC面積均＞0.9，敏感度＞90%，特異性87.1%，肌酐在72 h的的診斷敏感度降低至88%，特異性降至77.1%（P＜0.05）。RBP各時點(diǎn)的AUC面積均＜0.8，敏感度≤60%（表3）。

表3 CRRT治療組各指標(biāo)診斷AKI的ROC曲線比較Tab 3 Comparison of ROC curves in the diagnosis of sepsis AKI-CRRT group

未經(jīng)CRRT治療的膿毒癥AKI患兒各指標(biāo)的診斷價值比較比較膿毒癥AKI-非CRRT治療組ROC曲線，NGAL在0 h時AUC面積最大（0.951），敏感度最高（100%），特異性87.1%，肌酐在該時點(diǎn)的 AUC面積較?。?.751），敏感度最低（42.9%）。24 h時NGAL、KIM-1、肌酐和CysC均顯示良好的診斷效能，NGAL仍顯示了最高的敏感度（100%）和特異性（98.6%）。72 h時除尿量外，其余各檢測指標(biāo)的AUC均＞0.9（表4）。

討 論

目前，有文獻(xiàn)報道膿毒癥合并AKI的機(jī)制是中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生復(fù)雜交錯的免疫反應(yīng)，腎小管在炎癥細(xì)胞的浸潤下，細(xì)胞發(fā)生自噬、凋亡以及壞死，最終造成腎小管受損而引發(fā)AKI［11-13］。在眾多新的生物標(biāo)志物中，研究最多且最有臨床應(yīng)用前景的是NGAL和KIM-1。NGAL主要來源于中性粒細(xì)胞，少量表達(dá)于腎、脾、肝，與明膠酶 B 相關(guān)，相對分子質(zhì)量為 25 000［14］。KIM-1是來源于腎臟近曲小管上皮細(xì)胞的I型膜糖蛋白，相對分子質(zhì)量39 000［15］。研究顯示NGAL、KIM-1可對先天性心臟病患兒體外循環(huán)（cardiopulmonary bypass，CPB）術(shù)后誘發(fā)的 AKI進(jìn)行預(yù)測和診斷［16-17］。近年來的研究認(rèn)為這2個生物大分子標(biāo)志物對膿毒癥、接受冠狀動脈造影的急性冠脈綜合征或心力衰竭患者、泌尿系統(tǒng)疾病所致AKI有較好的早期診斷價值［18-21］。

在0 h、24 h、72 h的動態(tài)監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)：膿毒癥AKI組的NGAL、KIM-1水平均明顯高于非AKI患兒和正常對照組。當(dāng)機(jī)體發(fā)生膿毒癥時，在細(xì)菌內(nèi)毒素的刺激下釋放出大量內(nèi)源性的炎癥介質(zhì)，不僅對腎小管造成不同程度的損傷，從而導(dǎo)致AKI的發(fā)生，還會促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生NGAL，因此膿毒癥引發(fā)AKI時NGAL明顯升高［22-24］。KIM-1來源于腎小管上皮細(xì)胞，在上皮細(xì)胞損傷時表達(dá)增強(qiáng)，且持續(xù)至上皮細(xì)胞修復(fù)［25］。研究認(rèn)為AKI引發(fā)了ERK1/2、STAT 3磷酸化，STAT 3與KIM-1啟動子結(jié)合，增加其mRNA和蛋白質(zhì)水平，KIM-1細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的脫落導(dǎo)致血液或尿液中KIM-1水平大大增加［26］。國外有研究顯示，檢測尿NGAL易受尿液中白細(xì)胞的干擾影響，因此本研究采用血液標(biāo)本替代尿液標(biāo)本。

表4 膿毒癥AKI-非CRRT治療組各指標(biāo)診斷AKI的ROC曲線比較Tab 4 Comparison of ROC curves in the diagnosis of sepsis AKI-non CRRT group

本研究中有18例膿毒癥AKI組患兒在診斷AKI后進(jìn)行了CRRT。0 h時膿毒癥AKI-CRRT組和膿毒癥AKI-非CRRT組的NGAL和肌酐水平都明顯高于膿毒癥非AKI組；兩組膿毒癥AKI患兒中，NGAL的AUC面積均最大（分別為0.907和0.951），敏感度最高（分別為92%和100%），特異性強(qiáng)（分別為78.6%和87.1%），對膿毒癥AKI的診斷效能優(yōu)于其他指標(biāo)。國內(nèi)研究報道，成人膿毒癥患者 NGAL 預(yù)測 AKI較肌酐可至少提前 6 h［27-29］，在兒童中 NGAL 預(yù)測 AKI的時間可提早 24 h［30-31］。張輝等［32］對92例兒童AKI標(biāo)志物的研究顯示，雖在達(dá)到AKI診斷標(biāo)準(zhǔn)時肌酐的診斷特異性最好，但血肌酐的變化往往滯后于腎功能的改變，當(dāng)肌酐升高程度達(dá)到診斷標(biāo)準(zhǔn)時，患兒病情已較為嚴(yán)重，因此肌酐的變化對AKI的早期診斷缺乏高敏感性。由于0 h時無法計(jì)算尿量，借助尿量診斷AKI需要一定的觀察時間，所以依靠尿量對AKI的診斷存在滯后。0 h時CysC、RBP水平在膿毒癥AKI-CRRT組、膿毒癥AKI-非CRRT組和膿毒癥非AKI組3組間比較均沒有顯著差異，提示CysC與RBP無法在早期有效區(qū)分膿毒癥是否合并AKI。NGAL在疾病早期顯著增高，因此臨床檢測NGAL可以更早地幫助預(yù)警AKI的發(fā)生，從而達(dá)到盡早干預(yù)的目的。

在行CRRT治療的AKI患兒各時點(diǎn)的動態(tài)監(jiān)測中觀察到：72 h與24 h肌酐水平相比呈現(xiàn)下降趨勢，并且72 h較24 h肌酐的AUC面積減小、敏感度和特異性均降低；而NGAL、KIM-1分別在24 h顯著升高后，至72 h仍維持在較高水平，且NGAL在3個時點(diǎn)和KIM-1在后2個時點(diǎn)均維持良好的診斷效能。而膿毒癥AKI組中未行CRRT治療的患兒，各指標(biāo)在72 h與24 h相比，AUC面積、敏感度和特異性均沒有明顯的變化。分析認(rèn)為：目前臨床應(yīng)用的CRRT濾器均采用高通量濾器，其對溶質(zhì)清除截點(diǎn)（cut off）為20 000～250 000，這5個生物標(biāo)志物的相對分子質(zhì)量（Mr）從小到大依次為：肌酐（113）＜CysC（13 000）＜RBP（21 000）＜NGAL（25 000）＜KIM-1（39 000）［33］?？梢娫?CRRT 治療過程中，“金標(biāo)準(zhǔn)”肌酐易被濾過，從而不能反映腎功能真實(shí)情況。而NGAL和KIM-1的相對分子質(zhì)量均＞20 000，理論上在CRRT治療進(jìn)程中不易被清除，從而繼續(xù)維持相對穩(wěn)定的高水平表達(dá)。CysC和RBP的相對分子質(zhì)量與清除截點(diǎn)接近，也可能受到一定的影響。尿量在膿毒癥AKI-CRRT治療組和非CRRT治療組比較結(jié)果沒有顯著差異，但當(dāng)將尿量加上CRRT治療過程中濾出體內(nèi)的超濾量，24 h時膿毒癥AKICRRT組則高于非CRRT組。可見，CRRT治療期間由于應(yīng)用了超濾模式替代腎臟排尿功能，患兒實(shí)際產(chǎn)生的尿量與其真實(shí)的腎功能不相符，所以無法在行CRRT過程中應(yīng)用尿量反映腎功能真實(shí)情況。如需通過尿量反映AKI病情的進(jìn)展，則要等待治療間隙觀察后再作評估，顯然尿量無法與治療保持同步的測量。與此同時，膿毒癥采用集束化治療，臨床應(yīng)用藥物（如利尿劑）、透析等方式均有可能干擾診斷的效率。從膿毒癥AKI-CRRT組ROC曲線比較結(jié)果來看，NGAL在3個時點(diǎn)、KIM-1在后2個時點(diǎn)均保持較高敏感性及特異性，驗(yàn)證了大分子標(biāo)志物NAGL和KIM-1能夠更有效地反映CRRT治療后腎功能的真實(shí)情況［34-36］。

本研究的不足之處是兒童膿毒癥病例數(shù)較少，僅為小樣本量研究，得到的是初步結(jié)果，后續(xù)擬增大樣本量進(jìn)一步研究NGAL和KIM-1的診斷價值。

綜上所述，重癥患兒且同時診斷膿毒癥和AKI時病情復(fù)雜并發(fā)展迅速，病程中多個生物標(biāo)志物的動態(tài)監(jiān)測顯示NGAL靈敏度高，對AKI的發(fā)生可能起到早期提示作用，而在血液凈化的治療過程中NGAL和KIM-1受干擾因素較少，可對這些患兒腎功能真實(shí)水平的評估提供更多的診斷指標(biāo)。

作者貢獻(xiàn)聲明徐佳音 論文構(gòu)思，執(zhí)行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)采集，統(tǒng)計(jì)分析，撰寫和修訂論文。朱海燕 文獻(xiàn)調(diào)研和整理，執(zhí)行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)采集。徐錦 研究指導(dǎo)，論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。