冬凌草黃酮分散片含量測定方法研究

李 港 張 季 王新利 王亞男 石宗楊

1 河北大學(xué)藥學(xué)院，保定，071000，中國

2 河北北方學(xué)院藥學(xué)系，張家口，075000，中國

冬凌草（Herba Rabdosiae），也稱冰凌草，藥性偏寒，味道偏苦，有效藥物成分種類非常多，達數(shù)十種，具有解表通里，清熱解毒及預(yù)防細胞癌變的功能。冬凌草可與多種藥用植物經(jīng)科學(xué)的配方制成冬凌茶，由于此保健茶具有很好的保護嗓子的功效和一定的阻止消化道細菌繁殖的作用，所以它可以起到清咽潤肺、保護消化道的作用。

冬凌草中含有大量的黃酮，而黃酮顯示明顯的抗腫瘤、抗癌細胞、抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、抗肺動脈高壓以及防治糖尿病的作用。前期通過文獻的閱讀發(fā)現(xiàn)冬凌草制劑比較少，以冬凌草的黃酮提取液制備冬凌草黃酮分散片，為測定冬凌草黃酮分散片中黃酮含量建立紫外分光光度法對冬凌草黃酮分散片的質(zhì)量進行控制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

移液槍（1～10 μL、10～100 μL、100～1 000 μL）；電子天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；紫外分光光度儀UV-5500PC，上海元析儀器有限公司。

1.1.2 試劑

冬凌草黃酮分散片，自制；蘆丁對照品，批號：100080-200718，購自中國藥品生物制品檢定所；純水；乙醇（ethanol），購自成都科龍化工試劑廠；三氯化鋁（chloride），購自成都科龍化工試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 配置儲備液

精密稱取20.00 mg蘆丁對照品，用75%乙醇，攪拌溶解，移至100 mL容量瓶中，超聲15 min，靜置10 min，然后定容至刻度，即可獲得0.2 mg·mL-1的蘆丁儲備液。

1.2.2 配置AlCl3溶液

精密稱取AlCl3粉末2.5 g，溶解后倒入250 mL容量瓶中，定容至刻度，得到1%AlCl3溶液。

1.2.3 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別精密吸取0.20 mg·mL-1的蘆丁儲備液0.05、0.10、0.30、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL置 于8個10 mL容量瓶中，依次精密加入0.4 mL 1%的AlCl3溶液。混勻靜置6 min，每個容量瓶中都加入75%乙醇至刻度，充分震蕩，反復(fù)上下顛倒混勻，靜置20 min，將每個容量瓶取樣依次于410 nm處測吸光度，用計算機軟件做回歸直線，計算回歸方程及R2［1-2］。

1.2.4 精密度實驗

取同一樣品溶液用紫外分光光度計在410 nm處測吸光度，測5次，得到吸光度后，把吸光度帶入回歸方程，得到樣品濃度然后計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）［3-5］。

1.2.5 重復(fù)性實驗

取同一批次的冬凌草黃酮分散片，制備5份相同的樣品，用410 nm波長的光測定這5份樣品的吸光度，取均值，得到吸光度后，把吸光度帶入回歸方程，得到樣品濃度然后計算RSD。

1.2.6 穩(wěn)定性實驗

取待測樣品溶液依次于0、1、2、4、8、24 h用410 nm波長的光測其吸光度，得到吸光度后，把吸光度帶入回歸方程，得到樣品濃度然后計算RSD。

1.2.7 加樣回收率實驗

取蘆丁對照品，作為對照液，精密稱取樣品片劑粉末三份（含量分別為0.20、0.30、0.40 mg），分別加入盛有0.20 mg的蘆丁對照品溶液和0.4 mL 1%AlCl3溶液的10 mL容量瓶中，用75%乙醇定容，混勻，靜置20 min，吸取溶液用410 nm的光測其測吸光度，通過回歸方程計算樣品中黃酮濃度，計算平均回收率與RSD。

1.2.8 樣品測定

取三批樣品各10片，分別精密稱重，計算平均片重，用研缽研細，精密稱取相當(dāng)于平均片重的藥物細粉，加少量75%乙醇溶解后置于100 mL容量瓶中，加入1%的AlCl30.4 mL，混勻靜置6 min，加75%乙醇至刻度定容，充分震蕩，反復(fù)上下顛倒混勻，靜置20 min，在410 nm處測吸光度，通過回歸方程得到冬凌草黃酮分散片中蘆丁的量，從而計算冬凌草黃酮分散片中蘆丁的標(biāo)示量百分含量。

1.2.9 溶出度實驗

小杯法適用于小規(guī)格固體制劑，故采用此法測定此冬凌草黃酮分散片。在各溶出杯內(nèi)加入150 mL蒸餾水作為溶出介質(zhì)，待溶出杯內(nèi)蒸餾水溫度穩(wěn)定在37℃后，各個溶出杯內(nèi)分別放入供試品，迅速啟動儀器，然后在第5、10、20、30、45 min，吸取溶出液5 mL，同時迅速補充5 mL 37℃的蒸餾水，此過程不能超過30 s。取澄清濾液，待所有取完，在410 nm處測其吸光度，通過回歸方程計算樣品中黃酮濃度及藥物累計溶出百分比［6-7］。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系

吸光度作為Y軸，蘆丁對照品濃度作為X軸，得到回歸方程，回歸方程為Y=28.388X+0.017 6，計算其R2，R2=0.999 4。得到的這些實驗數(shù)據(jù)說明此蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光度在0.001～0.080 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（Fig.1）。

Fig.1 Standard Curve of Rutin

2.2 精密度實驗

以精密度的實驗方法得其RSD，RSD=0.45%（Tab.1）。

Tab.1 Table of precision experimental data

2.3 重復(fù)性實驗

以重復(fù)性的實驗方法得其RSD，RSD=1.90%（Tab.2）。

2.4 穩(wěn)定性實驗

以穩(wěn)定性的實驗方法得其RSD，RSD=2.30%（Tab.3）。

2.5 加樣回收率實驗

取蘆丁對照品，作為對照液，精密稱取樣品片劑粉末三份（含量分別為0.20、0.30、0.40 mg），分別加入10 mL容量瓶中，分別加入0.20 mg的蘆丁對照品溶液，分別加入1%AlCl3溶液0.4 mL，混勻靜置6 min，加入75%乙醇定容至刻度，混勻，靜置20 min，于410 nm處測吸光度，得到吸光度后，把吸光度帶入回歸方程，得到樣品濃度，平均回收率為101.78%，100.27%，99.60%；RSD分別為1.83%，1.41%，2.84%；實驗數(shù)據(jù)說明加樣回收率良好（Tab.4）。

Tab.2 Table of repeatable experimental data

Tab.3 Table of stability test data

2.6 樣品測定

利用紫外分光光度法測定冬凌草黃酮分散片中的黃酮含量，每片含量為2 mg，計算得到三批樣品中黃酮的標(biāo)示量百分含量分別為101.35%、99.10%、99.33%，平均含量為99.93%，三批間平均含量的RSD值為1.24%，表明三批間含量差異較小，本實驗所建立的冬凌草黃酮分散片中黃酮的含量測定方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性強（Tab.5）。

2.7 溶出度實驗

冬凌草黃酮分散片的溶出速度很快，在5 min時溶出藥量的百分比達到76.7%，最終累計溶出86.20%。冬凌草黃酮分散片屬于速釋制劑（Fig.2）。

3 討論

冬凌草具有很多的藥理作用，但是由于冬凌草的味道不好，限制了它的臨床應(yīng)用，因為冬凌草的主要成分是黃酮，所以我們制備了冬凌草黃酮分散片，根據(jù)黃酮的結(jié)構(gòu)特點，可以得出黃酮在紫外下的最大吸收波長為410 nm，而輔料在410 nm處幾乎無吸收，所以選擇410 nm作為黃酮的測定紫外吸收波長，通過回歸方程計算樣品中黃酮濃度，從而對冬凌草黃酮分散片進行含量測定。

Tab.4 Recovery data sheet of added samples

Tab.5 Table of sample determination test data

Fig.2 Dissolution of dispersible tablets of Herba Rabdosiae

黃酮的顯色方法有亞硝酸鈉法、三氯化鋁法等，實驗過程中亞硝酸鈉法與三氯化鋁法分別應(yīng)用，但是亞硝酸鈉法顯色效果不好，標(biāo)準(zhǔn)曲線難以繪制，測量藥品含量時，吸光度不穩(wěn)定，最終決定用三氯化鋁顯色法，三氯化鋁顯色法顯色效果好，穩(wěn)定性和精密度符合要求，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。

運用朗伯-比爾定律測定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，繼而測定冬凌草黃酮分散片中黃酮的總含量，此方法簡便易行、靈敏度與準(zhǔn)確度都較高，但專屬性稍差，適合基層實驗室普及使用。

分散片是一種速釋制劑，速釋制劑與普通的固體制劑相比其他的崩解速度、溶出速度、起效速度都要快；而且生物利用度比普通片劑更高，吸收比普通片劑更充分；腸道殘留相對來說也更少，不良反應(yīng)出現(xiàn)的也更少，近些年也越來越受到患者與醫(yī)務(wù)人員的青睞。