復方中藥制劑體外殺纖毛蟲及毒性試驗研究

秦志華，張林林，郭 沛，榮 榕，張 慧，張樂萃，單 虎

(1.青島農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，山東 青島 266109； 2.青島海鑫慧藥業(yè)有限公司，山東 青島 266109 )

大菱鲆(Scophthalmusmaximus)于1992年引入我國，具有生長速度快、易集約化養(yǎng)殖等優(yōu)點，迅速成為我國山東、遼寧等沿海地區(qū)的重要養(yǎng)殖品種[1]。盾纖毛蟲主要寄生在大菱鲆鰓部、體表潰瘍面、腦部及腸道內，具有發(fā)病率高、流行范圍廣且時間長、易與其他細菌性疾病并發(fā)的特點，是大菱鲆養(yǎng)殖過程中最重要的疾病之一[2-4]。在實際生產(chǎn)中，濫用抗生素等藥物的情況普遍存在，大菱鲆體內大量的藥物殘留，嚴重制約了大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，同時也導致了嚴重的食品安全問題，因此研究防治盾纖毛蟲病的高效、低毒、低殘留、無公害的中草藥迫在眉睫[1,5]。我國有廣闊的養(yǎng)殖市場以及豐富的中草藥資源，擁有得天獨厚的條件和悠久的中藥研究史，隨著科學技術的不斷進步，中藥治療大菱鲆的盾纖毛蟲病具有廣闊的應用前景。筆者旨在篩選合適的中藥組合物治療盾纖毛蟲病，同時可有效減少魚類食品中化學藥物的殘留，促進綠色環(huán)保養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，保障人類的健康安全，對發(fā)展我國綠色生態(tài)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

2種盾纖毛蟲水滴偽康纖蟲(Pseudocohnilemuspersalinus)和海洋尾絲蟲(Uronemamarinum)均由中國海洋大學提供；大菱鲆，體質量18～20 g，購自萊州永豐水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司。

1.2 試驗藥物

復方Ⅰ：十大功勞、黃柏、半枝蓮、苦參、百部、檳榔；復方Ⅱ：大黃、黃芩、野菊花、蛇床子、石榴皮、烏梅；復方Ⅲ：地丁、蒲公英、野菊花、地錦草、敗醬草、龍膽草、魚腥草、青蒿；以上中藥材均購自安國市北辰中藥材有限公司。

1.3 飼養(yǎng)管理

使用循環(huán)水箱飼養(yǎng)大菱鲆，試驗期間確保氧石正常工作，觀察魚的精神狀態(tài)和攝食情況。進行馴養(yǎng)試驗7 d后開始正式試驗，每日7:00和19:00投喂，殘餌和排泄物及時清理干凈，并做好各項試驗記錄。

1.4 試驗方法與指標檢測

1.4.1 中草藥的提取及盾纖毛蟲液的制備

分別將3個復方中藥材浸泡后用水煎煮，獲得中藥材的水煎煮濃縮液1 g/mL，冷卻后4 ℃冷藏備用。

以滅菌過濾海水(0.5 μm孔徑以下的過濾器過濾)為培養(yǎng)液，加入煮沸的新鮮大菱鲆魚肉汁數(shù)滴作為餌料，將2種盾纖毛蟲分別放入該培養(yǎng)液中進行常溫培養(yǎng)2～3 d，所培養(yǎng)的蟲體作為試驗觀察材料。

1.4.2 體外殺蟲試驗

試驗在96孔細胞培養(yǎng)板中進行，調整試驗初始各組蟲體密度均小于103個/mL，每孔加入90 μL藥液和10 μL離心后的蟲液，試驗共分為7組，每組3個平行，藥物劑量分別為0、5、10、15、20、25、30 mg/kg。在顯微鏡下觀察盾纖毛蟲的狀態(tài)，前16 h連續(xù)觀察，之后每12 h觀察1次至48 h，詳細記錄各組藥物發(fā)揮作用的時間，以篩選出最佳藥物及質量濃度。

1.4.3 大菱鲆毒性試驗

利用上述試驗篩選出的復方Ⅱ，進行大菱鲆毒性試驗。選取體質量相近且健康的大菱鲆144尾，隨機分為4組，即空白對照組(0 mg/kg)、推薦劑量組(20 mg/kg)、3倍劑量組(60 mg/kg)、5倍劑量組(100 mg/kg)，每組3個平行，每個平行12尾。每日藥浴2次，每次3～4 h，試驗期為7 d。試驗結束時，魚尾靜脈采集全血和血清，使用血液細胞分析儀和全自動生化分析儀，分別進行血常規(guī)和血液生化指標檢測。在藥浴試驗開始時停食24 h，測量大菱鲆體質量和體長，試驗結束時停食24 h。

1.4.4 病理切片的制作

試驗結束時剖檢大菱鲆，取大菱鲆腎臟、肝臟、胃、腸、鰓，立即放入固定液中固定，通過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、蘇木精—伊紅染色等步驟制作石蠟病理切片。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，Duncan′s法多重比較，結果均以平均值±標準差表示，以P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 體外殺蟲試驗

復方Ⅰ的藥物劑量在0～30 mg/kg時均對海洋尾絲蟲無殺害作用；復方Ⅲ僅在藥物劑量為30 mg/kg時對海洋尾絲蟲有殺害作用，在其他劑量時無效；復方Ⅱ的藥物劑量在10 mg/kg時即發(fā)揮藥效，隨著藥物劑量的增加，海洋尾絲蟲全部死亡所用的時間越來越短，且在劑量為20 mg/kg時達到最佳效果(表1)。顯微鏡下觀察，水滴偽康纖蟲毒性試驗結果發(fā)現(xiàn)，復方Ⅱ 20、25、30 mg/kg組1 h全部死亡；而其他各試驗組在加入藥液22 h后，均繁殖出新的幼蟲且運動活躍。

表1 中藥復方對海洋尾絲蟲的影響

復方Ⅰ的藥物劑量在0～30 mg/kg時均對水滴偽康纖蟲無殺害作用；復方Ⅲ在藥物劑量為20 mg/kg時對蟲體有殺害作用，且隨著藥物劑量的增加殺蟲效果沒有變化；復方Ⅱ的藥物劑量在20 mg/kg時即發(fā)揮藥效，且隨著藥物質量濃度增加殺蟲效果并無變化，藥物效果穩(wěn)定，即在劑量為20 mg/kg時達到最佳效果(表2)。

2.2 大菱鲆毒性試驗

2.2.1 復方Ⅱ對大菱鲆血常規(guī)指標的影響

白細胞、紅細胞、嗜酸性細胞等指標均與對照組差異不顯著；但是血紅蛋白指標中，20 mg/kg組顯著低于空白對照組(P<0.05)；在血小板指標中，20 mg/kg組顯著低于100 mg/kg組(P<0.05)(表3)。

表2 中藥復方對水滴偽康纖蟲的影響

表3 藥浴對大菱鲆血常規(guī)指標的影響

2.2.2 復方Ⅱ對大菱鲆血液生化指標的影響

甘油三脂、葡萄糖、球蛋白等指標均與對照組差異不顯著；但谷草轉氨酶指標中，60 mg/kg組顯著低于其他3組(P<0.05)。在尿素指標中，20 mg/kg組顯著低于其他3組(P<0.05)(表4)。

表4 藥浴對大菱鲆血液生化指標的影響

2.2.3 復方Ⅱ對大菱鲆主要臟器病理變化的影響

與空白對照組相比，各試驗組大菱鲆的鰓、腸道、胃、肝臟和脾臟均無明顯的病理變化(圖1～圖5)，表明復方Ⅱ對大菱鲆的臟器無毒性。

3 討 論

纖毛蟲營自生生活，屬兼性寄生蟲，但在一定的環(huán)境下，纖毛蟲營寄生生活，可吞噬甲殼類、魚類的細胞和組織殘渣，并在其體內寄生生活，其中盾纖毛蟲病成為大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)中常見的寄生蟲性疾病[6-7]。引發(fā)大菱鲆盾纖毛蟲病的盾纖毛蟲種類較多，本試驗所用的水滴偽康纖蟲和海洋尾絲蟲，均為嚴重危害海水養(yǎng)殖魚類的兼性寄生盾纖毛蟲。海洋尾絲蟲屬盾纖目、尾絲蟲屬，水滴偽康纖蟲屬盾纖目、偽康纖蟲屬，其最適生存溫度為20 ℃，寄生在魚體的表面、血液、心臟等組織器官內，可通過口、鰓、皮膚、腹腔等途徑感染大菱鲆，在富營養(yǎng)化水體中極易繁殖，一旦暴發(fā)，死亡率超過60%[8-11]。

圖1 大菱鲆鰓部組織切片(×400) Tab.1 The pathological section of gill in turbot S. maximus a.空白對照組； b.20 mg/kg； c.60 mg/kg； d.100 mg/kg;標尺=50 μm;下同. a.control group； b.20 mg/kg； c.60 mg/kg； d.100 mg/kg; bar=50 μm; et sequentia.

圖2 大菱鲆腸道組織切片(×400) Tab.2 The pathological section of intestine in turbot S. maximus

圖3 大菱鲆胃組織切片(×400) Tab.3 The pathological section of stomach in turbot S. maximus

圖4 大菱鲆肝臟組織切片(×400) Tab.4 The pathological section of liver in turbot S. maximus

圖5 大菱鲆脾臟組織切片(×400) Tab.5 The pathological section of spleen in turbot S. maximus

3.1 中藥復方體外殺蟲試驗

在中藥復方篩選試驗中，將由3個不同復方制成的藥液分別作用于海洋尾絲蟲和水滴偽康纖蟲，雖然2種盾纖毛蟲的結構略有不同，但是在復方Ⅱ的10～60 mg/kg 6個試驗組用藥后，顯微鏡下觀察，均出現(xiàn)纖毛停止擺動、結構模糊、蟲體結構完全被破壞、胞質流出并凝固、死亡的現(xiàn)象，說明復方Ⅱ對2種盾纖毛蟲有很好的驅蟲效果。而復方Ⅰ、Ⅲ對2種盾纖毛蟲均無效，顯微鏡下觀察蟲體，發(fā)現(xiàn)其結構完整，運動活躍。即使藥物劑量提高后，蟲體全部被殺死的時間也比復方Ⅱ所用的時間要長。復方Ⅱ的20 mg/kg試驗組，海洋尾絲蟲和水滴偽康纖蟲在用藥1 h時全部死亡，達到用藥效果的最佳；復方Ⅰ、Ⅲ在低劑量時，幾乎無效，即使隨著藥物劑量的提高，蟲體全部死亡所用的時間也會有波動和反復，不具有一般規(guī)律性。復方Ⅱ中含有大黃、苦參等中草藥。大黃歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng)，內服外用皆宜；具有調節(jié)胃腸功能、清熱瀉火、解毒、抗炎和抗病原微生物等藥理作用?？鄥⒅泻邪被犷?、糖類、甾醇類、生物堿類、黃酮類等成分，在中藥中按功效分類屬于清熱藥中的清熱燥濕藥。有試驗證明，苦參對鞭毛蟲、陰道滴蟲等有一定的抑制效果[12]。倪小毅等[13]通過體外試驗證明，青蒿素能使侵入細胞的蟲體膜系結構廣泛性損傷，造成核膜斷裂、線粒體膨脹、空泡樣變性、內質網(wǎng)擴張甚至出現(xiàn)核碎裂、核溶解現(xiàn)象。雖然復方Ⅰ、Ⅲ中的中藥成分都具有殺菌、抗病毒、增強機體免疫的功效，但是多種中藥成分組成的復方藥的殺盾纖毛蟲效果卻不及復方Ⅱ的效果好，這可能與每個機體對藥物的耐受能力不同有關，也可能與給藥時間、給藥次數(shù)、配伍禁忌、藥動學相互作用等方面有關[14]，具體原因，還需通過試驗進一步的探究。

3.2 大菱鲆毒性試驗

中草藥中富含糖類、脂肪、蛋白質、維生素、礦物質以及多種必需氨基酸，可以提高消化酶的活力，增強機體消化吸收營養(yǎng)物質的能力，提高大菱鲆的生長速度[15]。血液是動物體內循環(huán)系統(tǒng)的重要組成部分，對于維持魚體內環(huán)境的穩(wěn)定具有重要意義，并且起著物質運輸、生理調節(jié)及生理防御等重要功能[16]。血液生化指標是動物體內蛋白質、糖類和脂類等物質代謝過程的直接體現(xiàn)，能夠反映機體生理和健康狀況的變化[17]。同時，各種酶類和激素等水平也可以用來指示機體的免疫、營養(yǎng)、病理和藥理等狀況，也經(jīng)常作為考察機體健康程度的重要參考指標，是動物品種選育和養(yǎng)殖監(jiān)測等工作中的必要輔助措施。本試驗結果顯示，20 mg/kg組血紅蛋白指標顯著低于空白對照組(P<0.05)，這可能與每個水循環(huán)系統(tǒng)的溫度差異有關，但是引起血紅蛋白偏低的原因較多，還需要試驗更深入的探究。100 mg/kg組谷草轉氨酶的數(shù)量與其他3組相比，差異顯著(P<0.05)，數(shù)量低于其他組。谷草轉氨酶是動物體內重要的轉氨酶，在各個組織中廣泛存在，以心肌含量最高，肝臟次之。其數(shù)量偏低，提示肝功能有輕微的變化，但是數(shù)值在正常的范圍內。引起生化指標變化的因素多且復雜，如個體差異、采血時生理狀態(tài)等因素[18]，往往是幾個因素共同作用的結果，還需進行大量的藥理試驗確定是由哪些因素所致。同時，顯微鏡下觀察大菱鲆的肝臟、腎臟、脾臟、胃、腸和鰓部的組織切片，細胞組織結構正常，未見明顯異常現(xiàn)象，這表明復方Ⅱ對于大菱鲆無明顯的毒性作用。

4 結 論

試驗結果表明，復方Ⅱ能顯著地殺滅海洋尾絲蟲和水滴偽康纖蟲，藥物劑量為20 mg/kg時具有良好的驅蟲效果；同時通過大菱鲆毒性試驗，復方Ⅱ對大菱鲆無明顯的毒害作用。

預防大菱鲆盾纖毛蟲病不僅需要使用中草藥預防治療，同時需要加強大菱鲆的飼養(yǎng)管理，如降低飼養(yǎng)密度，魚池及時消毒，魚餌料和排泄物及時清理，多投喂顆粒料少投喂冰鮮魚等。做好預防工作，多方面同時管理，提高魚的生長性能，綠色養(yǎng)殖、科學養(yǎng)殖，將大菱鲆養(yǎng)殖行業(yè)帶入一個新的發(fā)展階段。