Ni2+對(duì)鈍頂螺旋藻生長(zhǎng)及藻膽蛋白含量的影響

趙嶝科，劉 慧，張少斌，陳小杏，劉金洲，辛 橋

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866； 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 土地與環(huán)境學(xué)院， 遼寧 沈陽 110866 )

螺旋藻(Spirulina)是一種光合自養(yǎng)的原核生物——藍(lán)藻，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)干質(zhì)量的60%以上，必需氨基酸種類齊全，而且其比例符合人和動(dòng)物的需要，此外還富含多不飽和脂肪酸、各種維生素、必需微量元素以及葉綠素、類胡蘿卜素、葉黃素等天然色素，具有促進(jìn)生長(zhǎng)、抗氧化、增強(qiáng)抵抗力、改善觀賞魚體色等多種作用，廣泛應(yīng)用在功能保健食品、化妝品、水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料及飼料添加劑等領(lǐng)域[1-5]。

鎳廣泛存在于自然界，在土壤、水和空氣中都有微量鎳的存在，鎳是植物、動(dòng)物(包括人)和微生物等各種生物體的必需微量元素[6-7]。鎳作為脲酶、羧肽酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、葡萄糖變位酶等多種酶的輔助因子或激活劑，參與各種酶促反應(yīng)，具有多種生理功能，如促進(jìn)植物氮代謝，促進(jìn)動(dòng)物對(duì)鐵的吸收和利用；促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌等[8-9]。植物缺鎳，會(huì)影響氨基酸代謝，從而抑制營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)，難以完成生命周期[9-10]。畜、禽等動(dòng)物缺鎳，骨鈣下降，骨組織、皮膚以及肝臟異常，生長(zhǎng)速度下降，死亡率增加等[6-8]。補(bǔ)充適量的鎳，可顯著改善鎳缺乏癥，并促進(jìn)植物和動(dòng)物生長(zhǎng)[11-12]。然而，隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，鎳也成為污染環(huán)境的重金屬元素之一[13]。微藻不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，而且對(duì)重金屬具有吸附和富集作用，是一種新興的重金屬污染生物修復(fù)材料[14]。

微量鎳離子(Ni2+)促進(jìn)銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)等藻類的生長(zhǎng)，但高含量的Ni2+則抑制其生長(zhǎng)，出現(xiàn)中毒癥狀，不同藻類適宜生長(zhǎng)的Ni2+含量不同[15]。目前，有關(guān)Ni2+對(duì)螺旋藻生長(zhǎng)的影響未見相關(guān)報(bào)道。筆者研究了不同含量的Ni2+對(duì)螺旋藻生長(zhǎng)以及藻膽蛋白含量的影響，可為降低螺旋藻生產(chǎn)成本，促進(jìn)其作為功能保健食品及動(dòng)物飼料的開發(fā)應(yīng)用，及利用螺旋藻處理水體鎳污染提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

直線型鈍頂螺旋藻突變株(Spirulinaplatensis,SP-Dz)由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)饋贈(zèng)。原始藻株是江西農(nóng)科院引自印度，原產(chǎn)于墨西哥的藻株SP. D，經(jīng)多年培養(yǎng)后形成的直線型突變株。

1.2 螺旋藻培養(yǎng)及生長(zhǎng)曲線繪制

將鈍頂螺旋藻藻種接種于若干個(gè)50 mL三角瓶中，添加不同體積的Ni2+母液(NiSO4·6H2O配制)，配制成Ni2+質(zhì)量濃度分別為0、0.05、0.1、0.3、0.5、1.0 μg/mL的Zarrouk氏培養(yǎng)液[11]，每瓶藻液定容至30 mL，調(diào)整藻種接種密度，使藻液的560 nm光密度值(D560)為0.225，每個(gè)處理3個(gè)平行，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度(28±1) ℃，連續(xù)光照。使用722型分光光度計(jì)，每日相同時(shí)間測(cè)定藻液D560，繪制生長(zhǎng)曲線[16]。

1.3 藻細(xì)胞吸收光譜測(cè)定

培養(yǎng)6 d，藻細(xì)胞長(zhǎng)到D560為0.6～0.8時(shí)培養(yǎng)結(jié)束，對(duì)藻液適當(dāng)稀釋，使各個(gè)波長(zhǎng)的光密度值為0.6～0.8，使用722分光光度計(jì)，分別測(cè)定0 μg/mL和0.5 μg/mL Ni2+處理組藻細(xì)胞在400～750 nm間的吸收光譜[16]。

1.4 藻膽蛋白含量測(cè)定

當(dāng)培養(yǎng)結(jié)束，離心收集藻體，加入10 mL藻膽蛋白提取緩沖液，使用超聲波細(xì)胞破碎儀，設(shè)定超聲功率300 W，超聲6 s，間隔6 s，重復(fù)10次，然后10 000 r/min離心10 min，取上清液，使用分光光度計(jì)，分別測(cè)定620 nm和650 nm的光密度(D620和D650)，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式[17]略有修改，分別計(jì)算藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度(ρ1)、別藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度(ρ2)以及藻膽蛋白總質(zhì)量濃度(ρ3)。

ρ1/mg·mL-1=(D620-0.474×D650)/5.34

ρ2/mg·mL-1=(D650-0.208×D620)/5.09

ρ3/mg·mL-1=ρ1+ρ2

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016和SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值均表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ni2+對(duì)螺旋藻生長(zhǎng)的影響

Ni2+對(duì)螺旋藻生長(zhǎng)的影響見圖1、圖2。由圖1可見，培養(yǎng)第1天，D560值沒有明顯增長(zhǎng)，螺旋藻需適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境，自培養(yǎng)的第2日開始，螺旋藻生長(zhǎng)逐漸加快，不同Ni2+質(zhì)量濃度處理之間，生長(zhǎng)趨勢(shì)基本相同，但質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL的Ni2+對(duì)螺旋藻生長(zhǎng)具有顯著的促進(jìn)作用。由圖2可見，螺旋藻培養(yǎng)6 d累積的生物量，當(dāng)Ni2+質(zhì)量濃度低于0.5 μg/mL時(shí)，隨質(zhì)量濃度的增加，螺旋藻累積的生物量逐漸增加，當(dāng)Ni2+質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL時(shí)，螺旋藻累積的生物量最多，與其他處理差異顯著(P<0.05)。而Ni2+質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL時(shí)，螺旋藻累積生物量雖然高于0 μg/mL，但略低于0.05 μg/mL(經(jīng)典Zarrouk培養(yǎng)基中的Ni2+質(zhì)量濃度)，表明過高質(zhì)量濃度的Ni2+不能顯著促進(jìn)螺旋藻生長(zhǎng)，還可能會(huì)產(chǎn)生抑制作用。

圖1 不同質(zhì)量濃度Ni2+對(duì)螺旋藻生長(zhǎng)曲線的影響Fig.1 Effect of different concentrations of Ni2+ on growth curve of Spirulina

圖2 不同質(zhì)量濃度Ni2+對(duì)螺旋藻累積生物量的影響Fig.2 Effects of different concentrations of Ni2+ on accumulated biomass of Spirulina 不同質(zhì)量濃度間，柱標(biāo)小寫字母不同，表示差異顯著(P<0.05). Means with different letters are significant differences (P<0.05) among different concentrations.

2.2 Ni2+對(duì)螺旋藻吸收光譜的影響

由于0.5 μg/mL Ni2+處理能顯著促進(jìn)螺旋藻生長(zhǎng)，為了分析鎳促進(jìn)螺旋藻生長(zhǎng)的原因，測(cè)定了該質(zhì)量濃度Ni2+對(duì)螺旋藻吸收光譜的影響(圖3)。由圖3可見，不添加Ni2+時(shí)，螺旋藻藻細(xì)胞的吸收光譜主要有3個(gè)吸收峰，分別位于438～442 nm(葉綠素a在藍(lán)紫光區(qū)的吸收峰)、610～630 nm(藻藍(lán)蛋白的吸收峰)、674～684 nm(別藻藍(lán)蛋白和葉綠素a在紅橙光區(qū)的吸收峰)。0.5 μg/mL Ni2+處理的藻細(xì)胞，葉綠素a在藍(lán)光區(qū)的吸收峰發(fā)生了顯著的變化，在440 nm的吸收峰消失，取而代之的是，在430 nm左右處出現(xiàn)一個(gè)小的吸收峰，在448 nm左右處出現(xiàn)一個(gè)大的吸收峰。藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白和葉綠素a在紅橙光區(qū)的吸收峰沒有明顯變化。以上結(jié)果說明，Ni2+通過改變?nèi)~綠素在藍(lán)紫光區(qū)域的吸收光譜，影響螺旋藻光合作用，進(jìn)而影響螺旋藻的生長(zhǎng)。

2.3 Ni2+對(duì)螺旋藻藻膽蛋白含量的影響

不同質(zhì)量濃度Ni2+對(duì)螺旋藻藻膽蛋白含量的影響見表1。由表1可見，在Ni2+質(zhì)量濃度為0.05～0.5 μg/mL時(shí)，隨著Ni2+質(zhì)量濃度的增加，藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白及藻膽蛋白總質(zhì)量濃度增加，當(dāng)Ni2+質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 μg/mL時(shí)，藻膽蛋白質(zhì)量濃度開始明顯下降，但略高于空白對(duì)照。

圖3 Ni2+對(duì)螺旋藻細(xì)胞吸收光譜的影響Fig.3 Effect of different concentrations of Ni2+ on the absorption spectra of Spirulina cells

表1 不同質(zhì)量濃度Ni2+對(duì)螺旋藻藻膽蛋白質(zhì)量濃度的影響

3 討 論

3.1 鎳對(duì)藻類生長(zhǎng)的影響

適當(dāng)含量的鎳不僅促進(jìn)大麥等高等陸生植物生長(zhǎng)[18]，而且能促進(jìn)水生植物水鱉(Hydrocharisdubia)[19]、大型褐藻海帶(Saccharinajaponica)[20]以及多種微藻的生長(zhǎng)[21]。已有研究表明，0.05 μg/mL的Ni2+可促進(jìn)綠色巴夫藻(Pavlovaviridis)的生長(zhǎng)[22]，促進(jìn)銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)的生長(zhǎng)的Ni2+質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL[23]，促進(jìn)斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)生長(zhǎng)的Ni2+質(zhì)量濃度為0.1～0.5 μg/mL，鐮形纖維藻(Ankistrodesmusfalcatus)和綠球藻(Chlorococcumsp.)生長(zhǎng)的最佳Ni2+質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL[21]。本試驗(yàn)表明，Ni2+質(zhì)量濃度為0.05～1.0 μg/mL時(shí)，均能促進(jìn)螺旋藻生長(zhǎng)，提高螺旋藻生物累積量，其中以0.5 μg/mL的促進(jìn)效果最顯著，這一結(jié)果與鎳對(duì)其他微藻生長(zhǎng)的影響相似。

3.2 鎳對(duì)藻類色素及藻細(xì)胞光吸收的影響

鎳通過影響藻類色素含量以及藻細(xì)胞的吸收光譜，影響光合作用，進(jìn)而影響藻類的生長(zhǎng)。0.05 μg/mL的Ni2+提高綠色巴夫藻葉綠素a的含量，從而促進(jìn)其生長(zhǎng)，當(dāng)Ni2+高于此質(zhì)量濃度時(shí)，葉綠素a含量下降，生長(zhǎng)受到抑制[22]。銅綠微囊藻藻細(xì)胞有3個(gè)吸收峰，分別為葉綠素a在藍(lán)紫光區(qū)的吸收峰為438 nm，藻藍(lán)蛋白的吸收峰在616 nm，別藻藍(lán)蛋白和葉綠素a在紅橙光區(qū)的吸收峰為673 nm，不同質(zhì)量濃度(0.1～1.0 μg/mL)的Ni2+處理，導(dǎo)致藻細(xì)胞所有吸收峰均發(fā)生不同程度的紅移，別藻藍(lán)蛋白含量下降，導(dǎo)致光吸收強(qiáng)度下降[15]。0.1～0.3 μg/mL的Ni2+提高藻藍(lán)蛋白含量，并提高藻膽蛋白光吸收強(qiáng)度，以0.1 μg/mL Ni2+處理效果最佳，與促進(jìn)生長(zhǎng)的最佳質(zhì)量濃度相同[15]。當(dāng)Ni2+質(zhì)量濃度高于5.0 μg/mL時(shí)，處理48 h以上，銅綠微囊藻和集胞藻(Synechocystissp.)葉綠素a含量均下降，藻細(xì)胞光吸收強(qiáng)度下降，因而抑制其生長(zhǎng)[23]。螺旋藻與銅綠微囊藻同屬藍(lán)藻，因而螺旋藻藻細(xì)胞的各吸收峰位置與銅綠微囊藻相似，0.5 μg/mL的Ni2+處理，導(dǎo)致葉綠素a的吸收峰發(fā)生較大紅移。葉綠素a中含有Mg2+，體外試驗(yàn)表明，脫鎂葉綠素可以與Ni2+、Cu2+、Co2+等結(jié)合，生成葉綠素衍生物[24]，因此在生物體內(nèi)，Ni2+可能通過離子競(jìng)爭(zhēng)作用，影響或替代葉綠素a中的Mg2+，從而影響葉綠素a的吸收光譜，進(jìn)而影響螺旋藻的生長(zhǎng)。

0.5 μg/mL的Ni2+處理，顯著提高了藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白和藻膽蛋白的含量，但對(duì)藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白吸收峰的位置沒有顯著影響。鎳作為脲酶的組分，與氮代謝密切相關(guān)，而氮代謝則與蛋白質(zhì)代謝密切相關(guān)[9]，因此，鎳可能促進(jìn)了藻膽蛋白的合成，或者減少了其降解，從而提高了藻膽蛋白含量。當(dāng)Ni2+質(zhì)量濃度低時(shí)，主要與檸檬酸、蘋果酸等有機(jī)酸結(jié)合，當(dāng)質(zhì)量濃度增加時(shí)，才會(huì)與蛋白質(zhì)多肽鏈相結(jié)合，因而，低質(zhì)量濃度Ni2+對(duì)藻膽蛋白的吸收光譜沒有顯著影響。藻膽蛋白作為螺旋藻的光合作用蛋白，其含量變化趨勢(shì)與螺旋藻累積生物量的測(cè)定結(jié)果基本一致，藻膽蛋白含量越高，光合作用越強(qiáng)，因而螺旋藻生長(zhǎng)越快。

3.3 藻類在水體鎳污染修復(fù)中的應(yīng)用

雖然鎳是很多生物體的必需微量元素，但超過一定量，同樣會(huì)造成重金屬中毒[13]。根據(jù)我國(guó)生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB 5749—2006)，飲用水鎳的極限值為0.02 μg/mL，漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(GB 11607—1989)規(guī)定的漁業(yè)用水鎳極限值為0.05 μg/mL。根據(jù)銅、鈷、鎳工業(yè)污染源排放標(biāo)準(zhǔn)(GB 25467—2010)，工業(yè)排污廢水中鎳質(zhì)量濃度極限值為1 μg/mL，工業(yè)廢水排污以及化肥在農(nóng)業(yè)上的大量應(yīng)用，會(huì)造成局部水域鎳超標(biāo)。水生生物能夠耐受一定含量的鎳污染，Ni2+質(zhì)量濃度為0.1～10.0 μg/mL，斜生柵藻、鐮形纖維藻以及綠球藻均能生長(zhǎng)[21]，大黃魚(Pseudosciaenacrocea)在Ni2+質(zhì)量濃度為0.46 μg/mL[25]，唐魚(Tanichthysalbonubes)在Ni2+質(zhì)量濃度為0.927 μg/mL時(shí)都能安全生長(zhǎng)[26]，但鎳可能在這些水體生物中富集和積累，并通過食物鏈逐級(jí)傳導(dǎo)，最終可能會(huì)威脅人類健康[27]。

利用藻類吸附、吸收水體重金屬，不僅可以修復(fù)水環(huán)境，而且還能回收重金屬，節(jié)約能源[28]。不同藻類對(duì)Ni2+的耐受劑量不同。當(dāng)Ni2+質(zhì)量濃度高于0.1 μg/mL時(shí)即抑制綠色巴夫藻生長(zhǎng)[22]。0.5 μg/mL的Ni2+顯著抑制羊角月牙藻(Selenastrumcapricornutum)生物量的積累[29]。1 μg/mL的Ni2+顯著抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)[15]。5.8 μg/mL的Ni2+對(duì)橢圓小球藻(Chlorellaellipsoidea)的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用,橢圓小球藻24 h對(duì)Ni2+的清除率超過95%[30]。在Ni2+質(zhì)量濃度為0.2～3.2 μg/mL時(shí)，鐮形纖維藻對(duì)鎳的吸附和吸收具有質(zhì)量濃度依賴性，3.2 μg/mL時(shí)達(dá)到最大值，累積系數(shù)達(dá)382倍[31]。由此可見，不同藻類可以耐受一定劑量的Ni2+污染，并對(duì)Ni2+具有吸附和富集作用。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)表明，不同藻類生長(zhǎng)所需要的Ni2+最適質(zhì)量濃度不同，利用低質(zhì)量濃度Ni2+可提高螺旋藻生物量，降低螺旋藻生產(chǎn)成本，從而促進(jìn)其在飼料、食品等領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用。而高達(dá)1.0 μg/mL的Ni2+對(duì)螺旋藻生長(zhǎng)沒有抑制作用，說明螺旋藻可以耐受一定劑量的Ni2+，可能應(yīng)用于Ni2+污染水體的治理等環(huán)保領(lǐng)域。