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    高通量高效液相色譜法快速檢測(cè)西紅花中15 種非法添加色素

    2021-01-25 07:48:06曹雅靜劉叢叢賴宇紅
    化學(xué)分析計(jì)量 2021年1期
    關(guān)鍵詞:紅花色譜法色素

    曹雅靜,劉叢叢,賴宇紅

    (廣東省藥品檢驗(yàn)所,廣州 510663)

    西紅花是一種名貴的中藥材,為鳶尾科植物番紅花(Crocus Sativus L.)的干燥柱頭[1]。根據(jù)《中國(guó)藥典》2015 年版記載,該藥材具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神的功效。西紅花可用于經(jīng)閉癥癥瘕、產(chǎn)后淤阻腹痛等癥,為婦科和傷科重要用藥,但來(lái)源有限,產(chǎn)量較低,價(jià)格昂貴,因此受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下,出現(xiàn)很多偽品和摻偽品,如蓮須、黃花菜,甚至紙漿等通過(guò)染料加工而成的偽制品[2-3],僅僅依靠其形狀或者顯微檢測(cè)[4],其專屬性不強(qiáng),質(zhì)量控制難以把握。目前西紅花除了與其它物質(zhì)摻假以次充好外,非法染色也是很常見(jiàn)情況,盡管?chē)?guó)家2011 年曾頒布西紅花補(bǔ)充檢驗(yàn)方法[5],針對(duì)金胺O、新品紅、檸檬黃、胭脂紅四種色素進(jìn)行檢驗(yàn),但是色素種類(lèi)繁多,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)新染料,例如西紅花檢出酸性橙Ⅱ及808 猩紅[6],紅花中檢出日落黃[7],除此之外,很多中藥材也出現(xiàn)染色的現(xiàn)象[8-9],因此本實(shí)驗(yàn)根據(jù)目前中藥材檢出的染料情況,建立同時(shí)檢測(cè)西紅花中多成分非法染色物質(zhì)的分析方法。

    目前鑒別西紅花中非法添加色素的方法有薄層色譜法[10-11]、拉曼光譜法[12-14]、高效液相色譜 法[11,15]、超高效液相色譜法[16]、液質(zhì)聯(lián)用法[17]等。薄層色譜法和拉曼光譜法前處理簡(jiǎn)便,適合作為快速篩查方法,但薄層色譜法重現(xiàn)性與精密度容易受到干擾,檢驗(yàn)效率低,且定量分析不夠準(zhǔn)確;高效液相色譜法、超高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法定性定量分析準(zhǔn)確性高,能夠?qū)崿F(xiàn)絕大多數(shù)非揮發(fā)性非法添加物檢測(cè),適用性廣泛,但是超高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法費(fèi)用昂貴,不適合日??焖俸Y查檢測(cè),因此建立高通量快速檢測(cè)多成分方法是本實(shí)驗(yàn)研究 方向。

    文獻(xiàn)方法一般采用色譜柱填料粒徑為5 μm的高效液相色譜法,所以在短時(shí)間內(nèi)無(wú)法同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)多種成分快速檢測(cè),通過(guò)減小填料粒徑、改善填料類(lèi)型等方式可提高分析效率。筆者采用亞3 色譜技術(shù)開(kāi)展多成分通用的高通量快速檢測(cè)方法,以西紅花為研究對(duì)象,針對(duì)市場(chǎng)中藥材中已檢出的15 種色素,建立高通量的高效液相色譜方法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用確證法,有效提高對(duì)中藥材染色摻偽的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè),保護(hù)廣大消費(fèi)者的用藥安全。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 主要儀器與試劑

    高效液相色譜儀:Agilent 1260 Infinity 型,配G1315D 型二極管陣列檢測(cè)器,美國(guó)安捷倫科技有限公司。

    三重四級(jí)桿液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀:TripleQuad5500 型,美國(guó)AB SCIEX 公司。

    pH 計(jì):PB-10 型,德國(guó)Sartorius 公司。

    純水機(jī):Millipore Milli Q 型,美國(guó)Millipore 公司。

    電子天平:METTLER MS205DU/S204DU 型,美國(guó)Mettler Toledo 公司。

    超聲波清洗器:KQ-300DE 型,昆山市超聲儀器有限公司。

    高速離心機(jī):GT5-2 型,北京京立有限公司。

    甲醇、乙腈:色譜純,美國(guó)Honeywell 公司。

    氨水、冰乙酸:分析純,廣州化學(xué)試劑廠。

    乙酸銨:色譜純,美國(guó)ROE 公司。

    乙酸銨溶液:0.02 mol/L,取0.54 g 乙酸銨用去離子水溶解并定容至1 L,即得。

    檸檬黃:96%,批號(hào)為25743,北京曼哈格生物技術(shù)公司。

    莧菜紅:94.4%,批號(hào)為20213,北京曼哈格生物技術(shù)公司。

    胭脂紅:0.5 mg/mL,批號(hào)為6001,中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

    日落黃:0.5 mg/mL,批號(hào)為13001,中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

    橙黃G:96%,批號(hào)為O100205,阿拉丁試劑有限公司。

    誘惑紅:0.5 mg/mL,批號(hào)為10001,中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

    偶氮玉紅:92%,批號(hào)為20521,Dr. Ehrenstorfer GmbH。

    新品紅:100%,批號(hào)為201301,中國(guó)食品藥品檢定研究院。

    堿性嫩黃O:100%,批號(hào)為31203,德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司。

    酸性紅73:100%,批號(hào)為201602,中國(guó)食品藥品檢定研究院。

    酸性橙Ⅱ:98.3%,批號(hào)為170716,北京曼哈格生物技術(shù)公司。

    赤蘚紅:0.5 mg/mL,批號(hào)為30423,中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

    蘇丹紅I:90.5%,批號(hào)為71220,Dr.Ehrenstorfer GmbH。

    808 猩紅:99%,批號(hào)為160924,北京曼哈格生物技術(shù)公司。

    蘇丹紅Ⅳ:100%,批號(hào)為201602,中國(guó)食品藥品檢定研究院。

    實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)Millipore Milli Q 純水機(jī)(0.22μm)凈化后的去離子水。

    1.2 溶液配制

    色素對(duì)照品儲(chǔ)備液:分別精密稱取檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、橙黃G、誘惑紅、偶氮玉紅、新品紅、堿性嫩黃O、酸性紅73、酸性橙Ⅱ、赤蘚紅等12 種色素對(duì)照品10 mg,用甲醇溶解稀釋,配制成1 mg/mL 的儲(chǔ)備液。分別精密稱取蘇丹紅I、808 猩紅、蘇丹紅Ⅳ等3 種色素對(duì)照品10 mg,用乙腈配制成1 mg/mL 的儲(chǔ)備液。上述對(duì)照品儲(chǔ)備液保存于-20℃的避光環(huán)境中。

    15 種色素系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:分別精密吸取上述1 mg/mL 的色素對(duì)照品儲(chǔ)備液,用0.02 mol/L 乙酸銨溶液稀釋配制成濃度均分別為50、10、5、1、0.5、0.1、0.05 μg/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,搖勻,進(jìn)液相小瓶后注入液相色譜儀測(cè)定。

    樣品溶液:稱取樣品約1 g,置于50 mL 具塞聚丙烯離心管中,加入70%甲醇水溶液10 mL,稱量并記錄質(zhì)量,超聲提取20 min 后取出,放冷至室溫后再次稱量,并用70%甲醇水溶液補(bǔ)足質(zhì)量損失,取1 mL 上清液,加入0.5 mL 水溶液,搖勻,經(jīng)聚四氟乙烯濾膜(0.45 μm)過(guò)濾,待HPLC 檢測(cè)。檢出陽(yáng)性成分的樣品溶液,用LC-MS/MS 法初始比例流動(dòng)相稀釋至與對(duì)照品溶液相當(dāng)濃度。經(jīng)過(guò)聚四氟乙烯濾膜(0.22 μm)過(guò)濾,待LC-MS/MS 儀檢測(cè)。

    1.3 儀器工作條件

    1.3.1 高效液相色譜法

    色譜柱:Poroshell 120 EC C18柱(100 mm×4.6 mm,2.7 μm,美國(guó)安捷倫科技有限公司);流動(dòng)相流量:1.2 mL/min;柱溫:35 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):450 nm,500 nm;進(jìn)樣體積:20 μL;流動(dòng)相:A 為甲醇,B 為0.02 mol/L 乙酸銨溶液(pH 5.9),梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

    表1 梯度洗脫程序

    1.3.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用確證方法

    (1)液相色譜條件。色譜柱Agilent Poroshell 120 EC C18(100 mm×2.1 mm,1.9μm,Agilent公司),進(jìn)樣體積:5 μL,柱溫:40 ℃;流量:0.3 mL/min;流動(dòng)相:A 為5 mmol/L 乙酸銨溶液(pH 5.9),B 為甲醇,梯度洗脫程序見(jiàn)表2。

    表2 梯度洗脫程序

    (2)質(zhì)譜條件。電噴霧離子源正負(fù)離子模式(ESI);檢測(cè)方式:MS2 全掃描;碰撞氣:62 kPa;氣簾氣:276 kPa;離子噴射電壓:正離子模式為5 500 V、負(fù)離子模式為-4 500 V;離子源溫度:550 ℃;離子氣1:379 kPa;離子氣2:379 kPa。15 種色素的質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表3。

    表3 15 種色素質(zhì)譜分析參數(shù)

    2 結(jié)果與討論

    2.1 色譜柱的選擇

    分別考察了5 種不同鍵合相的色譜柱:Agilent Poroshell 120 Phenyl Hexyl 柱(100 mm×4.6 mm,2.7 μm)、Agilent Poroshell 120 SB-C18柱(100 mm×4.6 mm,2.7 μm)、Thermo Accucore C18柱(100 mm×4.6 mm,2.6 μm)、Thermo Accucore PFP 柱(150 mm×2.1 mm,2.6 μm)、Agilent Poroshell 120 EC-C18柱(100 mm×4.6 mm,2.7 μm)對(duì)15 種色素的分離效果。發(fā)現(xiàn)Phenyl Hexyl、SB-C18、Accucore C18、PFP 色譜柱均不能分離日落黃與橙黃G 色譜峰,且Phenyl Hexyl、SB-C18、Accucore C18色譜柱對(duì)新品紅、堿性嫩黃O 與酸性紅73 色譜峰分離度較差,均無(wú)法滿足15 種色素的同時(shí)分離。Agilent Poroshell 120 EC-C18柱對(duì)15 種色素均分離效果較好,色譜峰形尖銳,因此選擇Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱。

    2.2 流動(dòng)相選擇與優(yōu)化

    選擇低毒的甲醇和配制方便的乙酸銨作為流動(dòng)相系統(tǒng),采用冰乙酸和氨水調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH 值??疾靝H 值在4.9~6.6 之間時(shí),色素的色譜峰形及分離情況。當(dāng)流動(dòng)相pH 值小于5.9 時(shí),堿性嫩黃O與酸性紅73 分離度較差,不能實(shí)現(xiàn)二者完全分離。當(dāng)pH 值為5.9 時(shí),色譜峰形尖銳對(duì)稱,能實(shí)現(xiàn)15 種色素的完全分離。因?yàn)榱鲃?dòng)相pH 5.9~6.6 均能滿足色譜分離的需求,但流動(dòng)相pH 越近中性色譜柱越容易被細(xì)菌污染,對(duì)色譜柱產(chǎn)生不良影響,故選擇流動(dòng)相pH 值為5.9。

    2.3 流動(dòng)相流量的選擇與優(yōu)化

    對(duì)色譜柱中流動(dòng)相流量為1.0、1.2、1.5 mL/min進(jìn)行考察。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)設(shè)為常規(guī)流量1.0 mL/min時(shí),色素的相近峰分離度較差,隨著流量升高,色素色譜峰分離度增大,而系統(tǒng)壓力也增大,當(dāng)流量達(dá)到1.5 mL/min 時(shí),則系統(tǒng)壓力達(dá)到最大耐受壓,影響色譜柱柱效。綜合考慮色譜柱分離度和柱效等因素,選擇色譜柱中流動(dòng)相流量為1.2 mL/min。

    2.4 柱溫的選擇與優(yōu)化

    對(duì)柱溫25、30、35、40 ℃進(jìn)行考察。發(fā)現(xiàn)柱溫越高,堿性嫩黃O 與酸性紅73 分離度增大,但是當(dāng)柱溫升高到40 ℃時(shí),新品紅與堿性嫩黃O 分離度減小。當(dāng)柱溫為35 ℃時(shí),15 種色素均分離,色譜峰型良好,因此選擇色譜柱溫度為35 ℃。

    2.5 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

    實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),15 種色素在波長(zhǎng)250 nm 左右均有響應(yīng),但檢測(cè)的靈敏度易受基質(zhì)成分的干擾,且檸檬黃在此波段不易與基質(zhì)成分區(qū)分,同時(shí)極性相似色素之間的分離度也受到影響。當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)大于400 nm 時(shí),各成分吸收信號(hào)較強(qiáng)且不易受雜質(zhì)成分的干擾,因此選擇450、500 nm 檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)檸檬黃在500 nm 處未有響應(yīng),但一般紅色色素在波長(zhǎng)為500 nm 時(shí)吸收較強(qiáng),黃色色素在450 nm 時(shí)吸收較強(qiáng),因此選擇450 nm,500 nm 雙波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng),兩個(gè)波長(zhǎng)下均基線平穩(wěn),各對(duì)照試劑均有響應(yīng),均能滿足各成分完全分離。依據(jù)能達(dá)到較低檢測(cè)限的原則,酸性紅73、酸性橙Ⅱ、赤蘚紅、808 猩紅4 種色素選取450 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng),其余11 種色素選取500 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。15 種色素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖見(jiàn)1。

    圖1 15 種色素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

    2.6 線性關(guān)系與檢出限

    按1.3.1 色譜條件測(cè)定1.2 中配制的15 種色素系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,以各色素的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)色素的色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo),進(jìn)行回歸處理,得15 種色素的線性方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表4。結(jié)果表明,15 種合成色素在0.05~50.0 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),相關(guān)系數(shù)均大于0.998,線性關(guān)系良好。分別以3 倍和10 倍信噪比計(jì)算檢出限及定量限,相關(guān)結(jié)果列于表4。15 種色素的檢出限為0.01~0.05 mg/kg,定量限為0.03~0.15 mg/kg。

    表4 15 種色素的線性方程及相關(guān)系數(shù)

    2.7 回收試驗(yàn)與精密度試驗(yàn)

    取未檢出15 種色素的陰性樣品約1 g,分別制成高中低三個(gè)質(zhì)量濃度水平,加入一定量的15 種色素對(duì)照品溶液各6 份,按“1.3.1”項(xiàng)方法進(jìn)行檢測(cè),記錄各成分峰面積,外標(biāo)法計(jì)算,各色素的回收率結(jié)果見(jiàn)表5。由表5 可見(jiàn),15 種色素成分的回收率為70.1%~93.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%~6.6%,表明所建立的分析方法能保證15 種成分均具有較好的精密度與準(zhǔn)確度。

    2.8 樣品分析

    2.8.1 高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果

    利用互聯(lián)網(wǎng)收集20 批樣品,取各批次樣品按照“1.2 溶液的配制”樣品溶液處理方法處理,采用“1.3.1”高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)一批樣品存在非法添加現(xiàn)象,檢出胭脂紅色素。

    2.8.2 液質(zhì)聯(lián)用法確證結(jié)果

    對(duì)高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的樣品,采用“1.3.2”液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行進(jìn)一步定性確證。樣品二級(jí)質(zhì)譜圖中的選擇分子離子峰m/z268.1 及特征碎片離子峰m/z205.9、m/z302 與胭脂紅對(duì)照品均一致,表明LC-MS/MS 法確證結(jié)果與HPLC 法檢測(cè)結(jié)果一致,該非法添加合成色素為胭脂紅。

    表5 方法回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

    3 結(jié)論

    本實(shí)驗(yàn)所選取的15 種色素專門(mén)針對(duì)西紅花中易被染色的染料品種,建立的高通量高效液相色譜法可實(shí)現(xiàn)15 種色素同時(shí)快速篩查,彌補(bǔ)了現(xiàn)有方法的局限性。該方法有針對(duì)性的對(duì)西紅花易被非法染色的染料建立的快速篩查方法,操作簡(jiǎn)單,效率高,實(shí)用性強(qiáng),為快速打擊中藥材中非法添加色素行為提供技術(shù)參考。

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