肝細胞肝癌中Piwil2表達與臨床病理特征及預后的關系

王申濤，葉冬雪，陳云慶，李 宏，時維平，周 璇，項鋒鋼,

肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是多因素引起的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，病死率高[1]。近年雖對HCC的診療取得一定的進展，但多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，預后較差，且對其癌變與侵襲的分子機制尚不清楚。因此，探索HCC侵襲、轉(zhuǎn)移及預后的臨床標志物具有重要的現(xiàn)實意義。Piwil2屬于Argonaute蛋白家族PIWI亞家族成員[2]。Argonaute蛋白是RNA誘導沉默復合物(RISC)的主要部件，在RNA沉默、干細胞的繁殖更新及轉(zhuǎn)錄調(diào)控中均發(fā)揮重要作用[3]。有研究證實Piwil2在甲狀腺癌、結(jié)腸癌、子宮頸癌、肺癌等多種癌癥和癌細胞系中表達異常，且其表達與腫瘤轉(zhuǎn)移復發(fā)均有關聯(lián)[4]。但是尚未見其在HCC中的表達及與患者預后的相關性報道。本文采用免疫組化PV 6000法檢測Piwil2在HCC組織及對應癌旁非瘤組織中的表達，分析其表達與HCC臨床病理特征的關系及對患者預后的影響，探討Piwil2表達在HCC發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移和預后中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2015年8月～2016年10月青島大學附屬醫(yī)院存檔的手術切除并經(jīng)病理證實的HCC標本163例，包括HCC組織及對應癌旁非瘤組織(距癌組織≥5 cm，鏡下排除HCC及瘤變)。入組HCC病例臨床病理資料均完整，且術前均未實施其他方案治療。其中男性135例，女性28例；年齡32～83歲，中位年齡57.6歲；HCC依據(jù)Edmondson標準進行分級：Ⅰ+Ⅱ級88例，Ⅲ+Ⅳ級75例；有包膜侵犯91例，無包膜侵犯72例；有脈管侵犯69例，無脈管侵犯94例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期138例，Ⅲ+Ⅳ期25例；HBsAg陽性128例，陰性35例。所有患者術后隨訪3年以上，目前持續(xù)隨訪中，以電話隨訪為主，患者復診為輔。隨訪過程中163例HCC患者有26例失訪，有完整隨訪信息者137例。本實驗獲得青島大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

1.2 試劑兔抗人多克隆抗體Piwil2購自美國Proteintech公司；通用型免疫組化PV 6000檢測試劑盒購于北京中杉金橋公司；組織芯片由上海芯超公司制作并提供技術支持。

1.3 方法

1.3.1設計與制備組織芯片 將符合入選標準的HCC組織及對應癌旁非瘤組織蠟塊行HE染色，采用雙盲法由經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師對石蠟標本(包括HCC組織及對應癌旁非瘤組織)中有代表性的部位進行標記。根據(jù)收集的標本例數(shù)(每例患者兩個組織芯，包括HCC組織和癌旁非瘤組織)設計為5個組織陣列，用細針打孔(直徑1.5 mm)，將供體蠟塊中標記好的組織芯取出并整齊排列到受體蠟塊上，制成組織芯片蠟塊。置于55 ℃溫箱中10 min，待陣列融合完全后取出，4 μm厚連續(xù)切片，冷水漂片，45 ℃溫水中展片2 min，撈片，拷片備用。將制備好的組織芯片進行HE染色，復檢以確認芯片質(zhì)量。

1.3.2免疫組化 將制備好的組織芯片行免疫組化PV 6000法染色，Piwil2抗體工作濃度為1 ∶50。先將切片脫蠟和水化，抗原修復，添加一、二抗，DAB顯色，復染，中性樹膠封固。具體操作步驟嚴格按抗體和試劑盒說明書進行，用試劑盒附帶的已知陽性切片作為陽性對照，用PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷Piwil2蛋白表達主要定位于細胞質(zhì)，未著色為陰性，淡黃色為弱陽性，棕黃色為中度陽性，棕褐色為強陽性。顯微鏡下每個組織芯中隨機選取5個高倍視野(400×)，每個視野計數(shù)100個癌細胞，取平均數(shù)。按陽性細胞百分率計分：陽性細胞數(shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。按細胞染色強度計分：陰性為0分，弱陽性為1分，中度陽性為2分，強陽性為3分。將兩項評分標準所得分值相加所得總分進行結(jié)果判定：0～3分為低表達，4～7分為高表達。

1.5 統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)應用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗；用Kaplan-Meier曲線評估Piwil2表達與生存期的關系，并進行Log-rank檢驗?？偵嫫诙x為手術日期與患者死亡日期之間的間隔；無瘤生存期定義為手術日期和復發(fā)日期之間的間隔。使用Cox比例風險模型評估Piwil2表達和HCC各臨床病理變量的風險比和95%CI，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC及癌旁非瘤組織中Piwil2的表達163例HCC組織中Piwil2低表達85例(52.15%)，高表達78例(47.85%)；Piwil2在對應的癌旁非瘤組織中均呈低表達，149例(91.41%)為陰性，14例(8.59%)為弱陽性(圖1～4)。Piwil2在HCC組織中的表達顯著高于癌旁非瘤組織(χ2=102.532，P<0.001，表1)。

①②③④

表1 肝細胞肝癌組織和癌旁非瘤組織中Piwil2的表達[n(%)]

2.2 HCC中Piwil2表達與臨床病理特征的關系Piwil2表達與腫瘤病理分級、TNM分期、包膜侵犯、脈管侵犯有關(P均<0.05)。TNM分期Ⅲ+Ⅳ期患者的高表達率為68%，高于Ⅰ+Ⅱ期(44.2%)(P=0.028)；病理分級Ⅲ+Ⅳ級高表達率為73.33%，高于Ⅰ+Ⅱ級(26.14%)(P<0.001)。有包膜侵犯、有脈管侵犯患者的高表達率也高于無包膜和脈管侵犯者(54.95%vs38.89%，P=0.042；63.77%vs36.17%，P<0.001)；Piwil2表達與患者年齡、性別、腫瘤直徑、HBsAg無關(P均>0.05，表2)。

表2 肝細胞肝癌中Pwil2表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3 Piwil2表達與HCC患者預后的關系本組患者有26例失訪，將有完整隨訪信息的137例患者進行Kaplan-Meier預后生存分析，結(jié)果顯示，Piwil2高表達組患者的總生存期(P<0.001，圖5A)和無瘤生存期(P<0.001，圖5B)較低表達組短。Piwil2高表達組和低表達組的總生存時間分別為(31.74±1.90)個月和(42.14±0.43)個月；無瘤生存時間分別為(26.67±2.25)個月和(40.63±0.52)個月。另外，TNM分期Ⅲ+Ⅳ期患者Piwil2高表達組總生存時間(P=0.004，圖5C)和無瘤生存時間(P=0.010，圖5D)比低表達組短；病理分級Ⅲ+Ⅳ級患者Piwil2高表達組總生存時間(P=0.018，圖5E)和無瘤生存時間(P=0.001，圖5F)比低表達組縮短。

發(fā)生包膜侵犯和脈管侵犯者Piwil2高表達組總生存時間(P=0.003，圖5G)和無瘤生存時間(P=0.001，圖5H)亦比低表達組短。

圖5 Piwil2表達與肝細胞肝癌患者生存期的關系：A.總生存期；B.無瘤生存期；C.TNM Ⅲ+Ⅳ期患者總生存期；D.TNM Ⅲ+Ⅳ期患者無瘤生存期；E.病理分級Ⅲ+Ⅳ級患者總生存期；F.病理分級Ⅲ+Ⅳ級患者無瘤生存期；G.有包膜和脈管侵犯患者總生存期；H.有包膜和脈管侵犯患者無瘤生存期

2.4 HCC患者預后的Cox單因素和多因素分析將各臨床因素進行Cox單因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，HBsAg(P=0.035)、腫瘤直徑(P=0.030)、病理分級(P=0.002)、TNM分期(P=0.001)、包膜侵犯(P=0.015)、脈管侵犯(P=0.008)、Piwil2表達(P<0.001)是影響患者術后總生存期的危險因素；TNM分期(P<0.001)、脈管侵犯(P=0.020)、Piwil2表達(P<0.001)是影響患者術后無瘤生存期的危險因素。Cox多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，TNM分期(P=0.007)、Piwil2表達(P<0.001)是影響HCC患者術后總生存期的獨立風險因素；同時TNM分期(P=0.005)、Piwil2表達(P<0.001)也是術后無瘤生存期的獨立風險因素(表3、4)。

表3 單因素和多因素Cox回歸分析肝細胞肝癌患者術后總生存期的影響因素

表4 單因素和多因素Cox回歸分析肝細胞肝癌患者術后無瘤生存期的影響因素

3 討論

HCC在我國的發(fā)生率較高，占原發(fā)性肝癌組織學類型的90%，且晚期患者占比較高。近年HCC的診斷與治療雖取得進展，但由于其高惡性程度、高轉(zhuǎn)移率、高復發(fā)率，患者預后仍不能令人滿意[5]。Piwi蛋白首先在果蠅的生殖細胞中被人們發(fā)現(xiàn)。Piwil2屬于Piwi蛋白的一個亞型，有PAZ和Piwi兩個保守的結(jié)構(gòu)域，在生殖細胞的維持中發(fā)揮作用，且在癌癥干細胞中顯著表達[6]，并可通過RNA干擾和miRNA對目標mRNA的降解作用參與染色質(zhì)修飾和抑制相關基因的表達，在腫瘤進程中發(fā)揮癌基因的作用，還可促進腫瘤細胞的細胞周期和增殖，通過調(diào)節(jié)參與細胞生長、代謝、凋亡和致癌作用的眾多基因的表達來促進惡性轉(zhuǎn)化和癌癥進展[7-8]。已有研究證明Piwil2在多種腫瘤組織中表達異常[4]，且其表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、復發(fā)預后密切相關。但是Piwil2在HCC中的表達情況研究較少，尚未見Piwil2表達與HCC臨床病理特征及預后之間的研究報道。

Wang等[9]發(fā)現(xiàn)Piwil2在癌旁非瘤組織、結(jié)腸腺瘤、結(jié)腸癌中的陽性率呈上升趨勢。Feng等[10]研究發(fā)現(xiàn)Piwil2在子宮頸癌組織中的陽性率明顯高于正常子宮頸上皮組織，并且證實Piwil2在誘導體細胞惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用。本實驗采用組織芯片技術和免疫組化法檢測163例HCC組織和對應癌旁非瘤組織中Piwil2的表達，發(fā)現(xiàn)Piwil2在HCC組織中的表達水平明顯高于癌旁非瘤組織，提示Piwil2可能參與早期HCC的惡性轉(zhuǎn)化過程。Sarvestani等[11]發(fā)現(xiàn)Piwil2在乳腺癌中高表達，且其表達與腫瘤浸潤深度、TNM分期、病理分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關。Yang等[12]的研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中Piwil2高表達，敲低PC-3細胞中Piwil2的表達，顯著降低了PC-3細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。本組實驗發(fā)現(xiàn)異常表達的Piwil2主要定位于細胞質(zhì)，在分化程度低、TNM分期晚的患者中Piwil2表達增高；有包膜侵犯和脈管侵犯的患者中Piwil2表達水平高于無侵犯者。提示Piwil2高表達促進腫瘤細胞的增殖與浸潤，參與HCC的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。

有研究發(fā)現(xiàn)Piwil2表達與多種腫瘤預后相關，Piwil2高表達是神經(jīng)膠質(zhì)瘤[13]和膀胱尿路上皮癌[14]患者預后不良的重要決定因素，但是Li等[15]在胰腺癌中的研究發(fā)現(xiàn)Piwil2高表達患者的總體生存期較長，其高表達反而提示患者預后良好。由此可見，Piwil2對不同類型癌癥患者預后的影響存在差異。本組Kaplan-Meier生存分析顯示，Piwil2高表達HCC患者的總生存時間和無瘤生存時間比低表達者短，提示Piwil2高表達預示患者預后不良。此外，本組還對病理分級Ⅲ+Ⅳ級、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、有包膜侵犯和脈管侵犯的患者進行了生存分析，發(fā)現(xiàn)Piwil2高表達患者的總生存時間和無瘤生存時間均短于低表達患者。進一步提示Piwil2表達是影響HCC患者預后的重要因素。鄧鑫[16]研究發(fā)現(xiàn)Piwil2高表達可激活PI3K/AKT通路，促進癌細胞增殖；還可激活TGF-β/Smad通路，促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，這或許導致了HCC患者術后的高復發(fā)與較差的預后。通過Cox回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，Piwil2表達、TNM分期是影響HCC患者術后總生存期和無瘤生存期的獨立影響因素。以上結(jié)果表明，Piwil2與HCC患者預后顯著相關，其高表達提示患者預后不良。因此檢測其表達對HCC患者的診療有重要臨床意義。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)Piwil2在HCC中的表達明顯增高，表明Piwil2與HCC的發(fā)生、發(fā)展有一定關聯(lián)；其表達與臨床病理特征和患者預后之間的關系，表明其在HCC的侵襲、轉(zhuǎn)移機制中發(fā)揮作用并可能由此影響患者預后。在以后的工作中，作者將采用細胞系及荷瘤動物繼續(xù)深入探討Piwil2在HCC發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機制，為HCC的臨床治療和預后判斷提供新指標。