通關(guān)藤藥材中通關(guān)藤苷G含量的HPLC測(cè)定

王聰瑋，殷 丹*

（1.梅河口市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，吉林 梅河口 135000；2.通化市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 通化 134001）

通關(guān)藤的干燥藤莖是臨床常用的中藥藥材。通關(guān)藤在我國(guó)主要生長(zhǎng)于云南及貴州等地，以野生為主，其味苦，微寒，中醫(yī)研究顯示其有止咳、祛痰、平喘、清熱、解毒的功效，此外，它對(duì)于胃癌、肺癌等惡性腫瘤細(xì)胞也有一定的抑制作用[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，通關(guān)藤中富含皂苷類、多糖類、酚酸類以及生物堿等多種成分，其中通關(guān)藤苷G、通關(guān)藤苷A、通關(guān)藤苷I、通關(guān)藤苷H等C21甾體類化合物是其中主要的活性物質(zhì)之一[2]。目前關(guān)于通關(guān)藤苷G的測(cè)定比較少。本次研究建立了高效液相色譜（HPLC）測(cè)定通關(guān)藤藥材中通關(guān)藤苷G含量的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

選擇Agilent的1100型高效液相色譜儀，梅特勒托利多的AB135s電子天平，G1314A的自動(dòng)進(jìn)樣器，昆山超聲儀器的KQ3200DB型超聲清洗器以及WATERS 的2695型HPLC色譜工作軟件。

1.2 試藥

通關(guān)藤藥材(已經(jīng)相關(guān)中醫(yī)藥專家鑒定為通關(guān)藤，產(chǎn)自云南麗江，批號(hào)190312，190524，190704）。通關(guān)藤苷G對(duì)照品由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供（CAS：191729-43-8，純度: 98%，批號(hào):20170422）。乙腈和甲醇皆為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

選用Symmetry的 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動(dòng)相選用乙腈-0.1%磷酸溶液(43:57)，柱溫30℃，進(jìn)樣量20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為230 nm。流速設(shè)定1 ml/min。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液制備

精密稱取1.006 g的通關(guān)藤藥材粉末，置入錐形瓶中，加入40 ml的甲醇溶液，經(jīng)超聲振蕩處理20 min，待其冷卻后稱重并再加入適量的甲醇溶液定容至50ml并搖勻。最后采用0.45μm的過(guò)濾膜進(jìn)行過(guò)濾濃縮，即得最終的供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

精密稱取13.40mg的通關(guān)藤苷G標(biāo)準(zhǔn)品，置入量瓶中,加入甲醇溶液定容至10ml,振蕩搖勻即得1.32mg/mL的通關(guān)藤苷G對(duì)照品儲(chǔ)備液。

3 方法學(xué)考察

3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性考察

分別取20μL的甲醇溶液、通關(guān)藤苷G對(duì)照品溶液以及通關(guān)藤供試品溶液，按照上述2.1的條件注入色譜柱，經(jīng)對(duì)三者的色譜圖進(jìn)行比對(duì)分析，可見(jiàn)通關(guān)藤苷G與通關(guān)藤供試品溶液的其它組分能很好的分離，而甲醇溶液中在通關(guān)藤苷G保留時(shí)間的相應(yīng)位置無(wú)干擾的色譜峰，見(jiàn)圖1。

圖1 色譜圖

3.2 線性關(guān)系考察

精密量取0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL的通關(guān)藤苷G對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別加入10ml的量瓶中，加入適量甲醇溶液進(jìn)行稀釋定容。按2.1條件，依次量取20 μL注入色譜儀測(cè)定。以峰面積(Y)、濃度（Z）分別作為縱坐標(biāo)、橫坐標(biāo),繪制通關(guān)藤苷G標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性回歸方程為：Y=272.45Z+3.48071，可見(jiàn)通關(guān)藤苷G在4.5～79.4 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r=0.99445）。

3.3 精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取1.0mL的通關(guān)藤苷G對(duì)照品儲(chǔ)備液，加入10ml量瓶經(jīng)甲醇稀釋定容后，量取20μL按上述色譜條件進(jìn)行重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，計(jì)算其含量。結(jié)果顯示6次測(cè)定的通關(guān)藤苷G峰面積相近（RSD=1.35%）。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)稱取6份190312批號(hào)的通關(guān)藤供試品粉末1.006g，按照2.2.1方法制成6份通關(guān)藤供試品溶液，依次量取20μL進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定通關(guān)藤苷G的峰面積，計(jì)算顯示6次重復(fù)測(cè)得的通關(guān)藤苷G的峰面積相近（RSD=1.32%），重復(fù)性良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取190312批號(hào)的通關(guān)藤供試品粉末1.006g制備成通關(guān)藤供試品溶液，制備完成后在室溫下放置0、2、4、6、8、12 h時(shí)，分別量取20μL進(jìn)行加樣測(cè)定，計(jì)算通關(guān)藤苷G峰面積。結(jié)果可見(jiàn)通關(guān)藤苷G的峰面積無(wú)顯著變化（RSD=1.29%），提示通關(guān)藤供試品能在12 h內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定。

3.6 加樣回收實(shí)驗(yàn)

稱取190312批號(hào)的通關(guān)藤供試品粉末3份，1.0g//份，分別加入供試品中通關(guān)藤苷G含量的0.5、1.0、1.5倍的通關(guān)藤苷G對(duì)照品，按同樣方法制備成加樣回收供試品溶液。分別進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定計(jì)算通關(guān)藤苷G的加樣回收率，結(jié)果顯示通關(guān)藤苷G的加樣回收率為98.78%（RSD=0.929%）。

表1 加樣回收實(shí)驗(yàn)

3.7 樣品含量測(cè)定

對(duì)于190312，190524，190704三個(gè)不同批號(hào)的通關(guān)藤供試品粉末分別按2.2.1法制備供試品溶液，依次取樣進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果可見(jiàn)三批的通關(guān)藤苷G含量分別為1.54 mg/g、1.59 mg/g、1.56mg/g。

3 討 論

本次研究建立了HPLC測(cè)定通關(guān)藤藥材中通關(guān)藤苷G含量的方法。在檢測(cè)波長(zhǎng)確定時(shí)，對(duì)其進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描顯示，在230 nm時(shí)，通關(guān)藤苷G出現(xiàn)了最大吸收峰值，故選取230nm為其檢測(cè)波長(zhǎng)，與徐凱等的研究一致。在流動(dòng)相的選擇中，原根據(jù)以往文獻(xiàn)選取乙腈：水（45:55）溶液，但是在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)通關(guān)藤苷G與通關(guān)藤中的其他C21甾體類化合物不能很好的分離，繼而嘗試了乙腈-0.1%磷酸溶液(43:57)，結(jié)果顯示通關(guān)藤苷G的色譜峰分離良好，因此確定了乙腈-0.1%磷酸溶液(43:57)作為最終的流動(dòng)相。對(duì)于HPLC法測(cè)定通關(guān)藤藥材中通關(guān)藤苷G含量的穩(wěn)定性、精確度、重復(fù)性等進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示HPLC法測(cè)定通關(guān)藤藥材中通關(guān)藤苷G含量的穩(wěn)定性、精確度、重復(fù)性均比較好，最終通關(guān)藤苷G加樣回收率的平均為98.78%，提示HPLC法通關(guān)藤藥材中通關(guān)藤苷G含量的準(zhǔn)確性高，且HPLC法操作簡(jiǎn)便易行，可作為其質(zhì)量控制的方法。