豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌菌毛基因多重PCR 檢測方法的建立及初步應(yīng)用

劉國梅，李 培，左玉柱，李杰峰，張 寧，劉曼迪，劉迎迎，李 妍*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北 保定 071000）

大腸埃希氏菌病屬于國家三類傳染病，其中產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）在臨床上可引起仔豬、犢牛、羔羊以及其他經(jīng)濟(jì)動物的水樣腹瀉，也可引起發(fā)展中國家的嬰兒腹瀉和發(fā)達(dá)國家的旅游者腹瀉[1]。ETEC 感染對新生仔豬和斷奶仔豬的危害最為嚴(yán)重，可引起仔豬白痢、黃痢以及水腫病。臨床癥狀表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、排黃白色水樣稀糞、消瘦脫水，并伴隨其他疾病的繼發(fā)感染甚至死亡，對養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

ETEC 菌毛類型眾多，其中K88（F4）、K99（F5）、987P（F6）、F18 和F41 在我國乃至全世界流行較廣[3]。菌毛也被稱為黏附素，可通過結(jié)合動物小腸絨毛的特異性受體，幫助菌體定植于宿主腸道，繼而釋放多種腸道毒素，引起宿主水和電解質(zhì)失衡，導(dǎo)致腹瀉[4]。菌毛具有免疫原性和抗原性，為ETEC 疫苗研發(fā)的主要靶標(biāo)。由于ETEC 菌毛類型眾多且多為混合感染，患病動物攜帶菌毛種類不明確，給疾病防治帶來嚴(yán)峻考驗[5]。在我國南方地區(qū)發(fā)現(xiàn)F18 為ETEC 的優(yōu)勢菌毛，F(xiàn)18ab 與F18ac 兩種亞型菌毛的流行狀況差異很大[6-7]。而河北省缺少對該病的流行病學(xué)調(diào)查，多采用K88/K99/987p 三聯(lián)疫苗預(yù)防，效果不佳，極大影響了對該病的防控。因此準(zhǔn)確鑒定病畜所攜帶的ETEC 菌毛類型，有助于更好的研究其流行狀況，為疫苗的研發(fā)提供重要參考依據(jù)。

ETEC 菌毛類型的傳統(tǒng)鑒定方法包括細(xì)菌分離、革蘭氏染色鏡檢及生化培養(yǎng)等，過程復(fù)雜且靈敏度不高。由于PCR 技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)及試驗成本低等特點，常用于疾病的快速診斷。國內(nèi)外有檢測3、4 和5 種ETEC 菌毛基因的多重PCR 方法，均是針對K88、K99、F18、987p 和F41菌毛基因，缺乏同時對F18ab 和F18ac 菌毛分型鑒定的研究[8-10]?；诖?，本研究將建立一種可同時鑒定ETEC 中攜帶K88、K99、F18ab、F18ac 及F41 5 種菌毛類型的多重PCR 方法，并對河北省腹瀉仔豬進(jìn)行ETEC 菌毛基因的鑒定，為ETEC 菌毛類型的鑒別檢測提供技術(shù)手段，為仔豬腹瀉的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株及主要試劑分別攜帶K88、 K99、F18ab、F18ac 和F4 菌毛的5 株標(biāo)準(zhǔn)豬源ETEC、豬源霍亂沙門氏菌和豬源鏈球菌均購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。大腸桿菌DH5α 和2×Taq PCR MasterMix 購自天根生化科技（北京）有限公司。101 株大腸桿菌分離自河北省石家莊、滄州、保定、張家口及衡水地區(qū)10 個養(yǎng)殖場患腹瀉的仔豬臟器。其中，43 株來源于石家莊、滄州和張家口地區(qū)養(yǎng)殖場豬的肝臟樣品；31 株來源于石家莊、張家口和衡水地區(qū)養(yǎng)殖場豬的肺臟樣品；18 株來源于保定和石家莊地區(qū)養(yǎng)殖場豬的腎臟樣品；9 株來源于滄州和保定地區(qū)養(yǎng)殖場豬的脾臟樣品。伊紅美蘭、麥康凱和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基均購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；革蘭氏染色液購自康華生物技術(shù)有限公司；酵母浸出物、胰蛋白胨購自英國OXOID 公司；氯化鈉購自福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；DL1500 DNA Marker 購自北京康為世紀(jì)科技有限公司；瓊脂糖購自西班牙BIOWESTE 公司。

1.2 多重PCR 引物的設(shè)計與合成根據(jù)GenBank登錄的大腸桿菌基因組序列，利用Primer Premier5軟件和NCBI 線上Primer-BLAST 功能（https://www.nc?bi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設(shè)計引物。分別針對大腸桿菌uidA 基因，ETEC 菌毛基因K88、K99、F18ab、F18ac 和F41 保守區(qū)域設(shè)計特異性引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR 引物信息Table 1 PCR Primers used in this study

1.3 細(xì)菌基因組DNA 的提取采用煮沸法提取攜帶5 種菌毛基因的豬源ETEC 基因組DNA。通過核酸蛋白檢測儀檢測OD260nm確定DNA 濃度。根據(jù)Gen?Bank 中登錄的大腸桿菌基因組大小，計算基因組DNA 的拷貝數(shù)。

1.4uidA基因的PCR 擴(kuò)增以提取的1 株標(biāo)準(zhǔn)豬源大腸桿菌基因組DNA 為模板，并以豬源霍亂沙門氏菌基因組DNA 及滅菌水作為對照，采用uidA-F/uidA-R PCR 擴(kuò)增細(xì)菌的uidA 基因，用以鑒定大腸桿菌。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃3 min；94 ℃30 s、60 ℃30 s、72 ℃1 min，30 個循環(huán)；72 ℃5 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 菌毛基因的單一PCR 擴(kuò)增以1.3 提取的5 種標(biāo)準(zhǔn)ETEC DNA 為模板，使用表1 中的引物分別對其K88、K99、F18ab、F18ac和F41菌毛基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為25 μL：上下游引物各2 μL，終濃度 為3.2 μmol/L；DNA 模板1 μL，終濃 度為5.7×106拷 貝/μL；2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL；ddH2O 補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)程 序：94 ℃3 min；94 ℃30 s、57 ℃30 s、72 ℃1 min，30 個 循 環(huán)；72 ℃5 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 菌毛基因的多重PCR 擴(kuò)增及優(yōu)化將表1 中的各菌毛基因上下游引物均稀釋至20 μmol/L，并且等比例混合，各DNA 模板稀釋至1.4×108拷貝/μL 等比例混合備用。以5種標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA為模板，分別對引物終濃度（1.6 μmol/L～6.4 μmol/L）、DNA 混合模板終濃度（4 ng/μL～32 ng/μL，3.5×106拷貝/μL～2.5×107拷貝/μL）和退火溫度（55 ℃～62 ℃）進(jìn)行優(yōu)化。PCR反應(yīng)體系為25 μL：混合引物4 μL，混合模板1 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃3 min；94 ℃30 s、55 ℃～62 ℃30 s、72 ℃1 min，30 個循環(huán)；72 ℃5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 多重PCR 的特異性試驗以分別攜帶K88、K99、F18ab、F18ac、F41菌毛基因的標(biāo)準(zhǔn)ETEC、5株標(biāo)準(zhǔn)菌株混合基因組DNA，提取的大腸桿菌DH5α、豬源霍亂沙門氏菌和豬源鏈球菌的基因組DNA 為模板，按照優(yōu)化后的多重PCR 擴(kuò)增，檢測該方法的特異性。

1.8 多重PCR 的敏感性試驗10 倍倍比稀釋攜帶各菌毛基因的豬源ETEC混合DNA模板，使模板濃度為2.5×107拷貝/μL～2.5×103拷貝/μL，按照優(yōu)化后的多重PCR 擴(kuò)增，檢測該方法的敏感性。

1.9 臨床樣品的檢測采用煮沸法提取臨床樣品分離的101 株大腸桿菌的基因組DNA，以其為模板，采用uidA 基因的PCR 擴(kuò)增，進(jìn)一步鑒定分離的大腸桿菌，隨機(jī)選取PCR 產(chǎn)物測序。以上述豬大腸桿菌DNA 作為模板，采用本研究建立的多重PCR 方法檢測101 株大腸桿菌的菌毛基因類型。實驗重復(fù)兩次，并統(tǒng)計河北省豬大腸桿菌菌毛基因類型的流行情況。根據(jù)1.5 所述試驗方法，使用表1 中的引物對這101 株大腸桿菌5 種菌毛基因類型進(jìn)行單一PCR鑒定，比較兩種PCR 方法的檢測結(jié)果，并計算二者的陽性符合率。

2 結(jié) 果

2.1 大腸桿菌uidA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果使用表1所列的uidA 基因引物對1 株標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，豬源大腸桿菌基因組DNA PCR 擴(kuò)增結(jié)果為陽性，長度約為647 bp，與預(yù)期相符，而豬源霍亂沙門氏菌的基因組無擴(kuò)增（圖1）。表明該P(yáng)CR 方法特異性較強(qiáng)，可用于鑒別大腸桿菌屬。

圖1 大腸桿菌uidA 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 PCR amplification of E. coli uidA gene

2.2 菌毛基因的單一PCR擴(kuò)增結(jié)果使用表1中的引物分別對5 種攜帶不同菌毛基因的標(biāo)準(zhǔn)ETEC 基因組DNA 進(jìn)行單一PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示，5 種標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA 均擴(kuò)增出了目的條帶，且均與預(yù)期相符（菌毛基因K88、K99、F18ab、F18ac和F41產(chǎn)物長度分別為343 bp、157 bp、282 bp、494 bp 和580 bp）（圖2）。表明，各引物均能有效擴(kuò)增各大腸桿菌菌毛基因。

圖2 各菌毛基因的單一PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 Single PCR amplification result of each fimbriae gene

2.3 多重PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果將5 種標(biāo)準(zhǔn)ETEC 基因組DNA 混合進(jìn)行多重PCR 擴(kuò)增，分別優(yōu)化引物濃度、模板濃度和退火溫度。結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)體系中各菌毛基因的引物終濃度為3.2 μmol/L，DNA 模 板 終 濃 度 為2.5×107拷 貝/μL，退 火 溫 度58 ℃。圖3 結(jié)果顯示，當(dāng)退火溫度為55 ℃、56 ℃和58 ℃時，5 條PCR 產(chǎn)物條帶均比較清晰，且各產(chǎn)物大小均與預(yù)期相符，無非特異性擴(kuò)增。為了避免在實際應(yīng)用中出現(xiàn)非特異性條帶干擾，選擇較高的58 ℃作為退火溫度。

2.4 多重PCR 的特異性試驗結(jié)果分別以各標(biāo)準(zhǔn)ETEC 混合或者單獨(dú)基因組DNA 為模板，利用優(yōu)化的多重PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，多重PCR 可從攜帶K88、K99、F18ab、F18ac 和F41 菌毛的大腸桿菌混合或者單獨(dú)基因組DNA 擴(kuò)增出相應(yīng)目的條帶，但大腸桿菌DH5α、豬源霍亂沙門氏菌和豬源鏈球菌基因組DNA 無擴(kuò)增（圖4），表明該方法特異性較強(qiáng)。

圖3 多重PCR 退火溫度的優(yōu)化結(jié)果Fig. 3 Optimization of multiplex PCR annealing temperature

圖4 多重PCR 的特異性試驗結(jié)果Fig. 4 Specificity tests of multiplex PCR

2.5 多重PCR 的敏感性試驗結(jié)果以等量混合的攜帶5 種菌毛的ETEC 基因組DNA（2.5×107拷貝/μL～2.5×103拷貝/μL）為模板，采用本研究建立的多重PCR 方法擴(kuò)增。結(jié)果顯示，當(dāng)5 種混合大腸桿菌基因組DNA 濃度為2.5×104拷貝/μL 時仍然可以有效擴(kuò)增（圖5）。因此，多重PCR 各菌株DNA 的最低檢測量均為2.5×104拷貝/μL，表明該方法的敏感性較高。

2.6 臨床樣品的檢測結(jié)果采用uidA 基因的PCR 方法檢測101 株分離的大腸桿菌，結(jié)果表明均為大腸桿菌。隨機(jī)選取的11 個PCR 產(chǎn)物的測序結(jié)果顯示，均與大腸桿菌uidA 基因序列完全吻合，進(jìn)一步說明了該鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過多重PCR 方法對101株大腸桿菌進(jìn)行兩次鑒定，結(jié)果顯示河北省仔豬腹瀉普遍存在攜帶多菌毛類型的ETEC（表2）。其中，攜帶K88、K99、F18ab 和F41 ETEC 的檢出率最高為37.6%（38/101）；其 次，攜 帶K88、K99 和F18ab ETEC 的檢出率為19.8%（20/101）；攜帶K88、F18ab和F18ac ETEC 的檢出率為16.8%（17/101）；而攜帶5種菌毛K88、K99、F18ab、F18ac 和F41 ETEC 的檢出率為9.9%（10/101）；攜帶其它類型菌毛ETEC 的檢出率均在10%以下。因此，河北省仔豬腹瀉絕大多數(shù)為攜帶3 種及3 種以上菌毛的ETEC 混合感染，未發(fā)現(xiàn)單一菌毛感染。對分離菌進(jìn)行的5 種菌毛的單一PCR 結(jié)果與多重PCR 檢測結(jié)果一致，二者對5種菌毛檢測結(jié)果的符合率為100%（表3）。表明多重PCR 方法準(zhǔn)確性較高，可以用于臨床樣品的檢測。

圖5 多重PCR 的敏感性檢測結(jié)果Fig. 5 Sensitivity detection of multiplex PCR

表2 多重PCR 對臨床樣品的檢測結(jié)果Table 2 Detection of clinical samples by multiplex PCR

表3 兩種方法對臨床樣品檢測結(jié)果的符合率Table 3 The coincidence rate of the two methods in testing the clinical samples

3 討 論

臨床上引發(fā)仔豬腹瀉的病原種類很多，其中ETEC 是造成仔豬斷奶后腹瀉（PWD）的主要病原[11]。由于ETEC 菌毛類型較多，在臨床上多為各菌毛大腸桿菌的混合感染，因此準(zhǔn)確鑒定腹瀉仔豬所攜帶的ETEC 菌毛類型可為該病的防治提供依據(jù)[12]。單一PCR 方法鑒定多種菌毛過程繁瑣，費(fèi)時費(fèi)力。本實驗設(shè)計的多重PCR 方法能夠快速鑒定大腸桿菌以及ETEC 的菌毛類型，為疾病診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了有效手段。

由于仔豬腹瀉病常伴隨多種病原混合感染，因此鑒定病原是否為大腸桿菌是首要步驟[13]。本研究根據(jù)國內(nèi)外學(xué)者建立的大腸桿菌PCR 鑒定方法，通過比較并篩選后，選擇uidA 基因作為鑒定大腸桿菌的特異性基因，其特異性高于16S rDNA 基因的PCR方法[14-15]。本研究針對各大腸桿菌攜帶的菌毛基因保守區(qū)域設(shè)計了引物，通過BLAST 排除了引物與基因組其他序列之間的非特異性結(jié)合，通過序列分析還排除了引物形成二聚體的可能。為了提高該多重PCR 方法的檢測效率，本實驗對該P(yáng)CR 方法進(jìn)行了一系列優(yōu)化。包括退火溫度、引物濃度和模板濃度的優(yōu)化，當(dāng)退火溫度為58 ℃，引物終濃度為3.2 μmol/L，混合模板終濃度為2.5×107拷貝/μL 時，該多重PCR 擴(kuò)增效果最佳。特異性檢測結(jié)果顯示，該多重PCR 可鑒定攜帶多個菌毛基因的ETEC，但未能擴(kuò)增其他致病菌及大腸桿菌DH5α，表明引物特異性較強(qiáng)。多重PCR 的敏感性結(jié)果顯示，該方法對每種ETEC 基因組DNA 的最低檢測量均為2.5×104拷貝/μL，敏感性較高。近年來，國內(nèi)外報道的多種ETEC 多重PCR 鑒定方法均不能對其F18ab 和F18ac菌毛進(jìn)行分型鑒別[8-9]?？设b定F18ab 和F18ac 菌毛的雙重PCR 方法又未能覆蓋ETEC 的其他菌毛類型[7]。因此，本研究建立的多重PCR 方法完善了目前的檢測技術(shù)，提高了檢測效率。

為了評估該多重PCR 方法的準(zhǔn)確性及可行性，本研究對分離的101 株大腸桿菌進(jìn)行了兩次該多重PCR 的檢測，以及一次單一PCR 驗證，結(jié)果完全一致，表明該多重PCR 方法可靠，可用于臨床檢測。從流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果來看，河北地區(qū)大多數(shù)仔豬腹瀉是由攜帶3 種及3 種以上菌毛ETEC 的混合感染所致。F18ab 在河北省ETEC 中的檢出率最高，達(dá)到了99.0%，而F18ac 的檢出率僅有34.6%。K88 和K99 的陽性率分別為89.1%和82.1%，F(xiàn)41的陽性率為50.4%。近幾年，有多項研究對我國各地區(qū)ETEC 菌毛類型的流行情況進(jìn)行了報道。例如，廣西地區(qū)ETEC 的菌毛類型以F41 和K88 為主[16]；河北承德地區(qū)K88 和F18 菌毛類型在臨床分離的大腸桿菌中檢出率均為25%左右[17]；在上海臨港地區(qū)240 份豬的樣品中分離得到3 株ETEC，均為F18ac 菌毛[6]。上述結(jié)果充分表明了我國各地區(qū)ETEC 的優(yōu)勢菌毛類型有所不同。綜上所述，本研究建立的多重PCR 方法可用于快速鑒定腹瀉仔豬所攜帶的ETEC 菌毛類型，適用于大批量樣本的檢測，特異性強(qiáng)，靈敏度高。為ETEC 菌毛的鑒別檢測和其感染的流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)手段。