表達(dá)重癥急性呼吸綜合征病毒刺突蛋白重組新城疫病毒的構(gòu)建及其免疫原性研究

湯筱艷，劉任強(qiáng)，山 丹，潘 丹，王喜軍，葛金英，溫志遠(yuǎn)，步志高

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

重癥急性呼吸綜合征（Severe acute respiratory syndrome，SARS）是由重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARSCoV）引起的一種急性、發(fā)熱并伴有呼吸系統(tǒng)感染等嚴(yán)重并發(fā)癥的人獸共患病。2002 年11 月首例SARS病例出現(xiàn)于我國(guó)廣東省，然后迅速蔓延全國(guó)并擴(kuò)散到加拿大、越南、新加坡、泰國(guó)等26 個(gè)國(guó)家。SARS 的病原體SARS-CoV 是一種有囊膜，不分節(jié)段的單股正鏈RNA 病毒，屬于巢氏病毒目（Nido?virales）、冠狀病毒科（Coronaviridae）、β-冠狀病毒屬（β-Coronavirus）成員[1]。刺突蛋白（Spike protein，S）是SARS-CoV 的跨膜糖蛋白，可以介導(dǎo)病毒與細(xì)胞受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）結(jié)合[2]，是病毒刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體最重要的蛋白[3]。2017 年Shi 等人研究推測(cè)蝙蝠是SARS-CoV 的自然宿主[4]，說明SARS-CoV的感染依然存在重新暴發(fā)的可能性。2019 年12 月我國(guó)湖北省武漢市爆發(fā)了嚴(yán)重的COVID-19 疫情，研究表明該新型冠狀病毒SARS-CoV-2 可能來源于SARS-CoV 前體蝙蝠冠狀病毒HKU9-1[5]。因此研發(fā)SARS-CoV疫苗對(duì)我國(guó)的公共衛(wèi)生安全具有重要意義。

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）是一種不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA 病毒，屬于單分子負(fù)鏈RNA 病毒目（Mononegavirales）、副黏病毒科（Para?myxoviridae）、禽副黏病毒屬（Avulavirus）成員[6]。現(xiàn)在將重組NDV 作為載體的疫苗研究已較為成熟，NDV 作為活病毒疫苗載體有很多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：NDV可以同時(shí)誘導(dǎo)多種免疫應(yīng)答，包括體液免疫、細(xì)胞免疫和黏膜免疫；NDV 只有一個(gè)血清型，遺傳性相對(duì)穩(wěn)定；重組NDV 疫苗對(duì)多種動(dòng)物免疫后均可以產(chǎn)生較好的免疫效果，可以通過接種中間宿主切斷病毒的傳播途徑；NDV 的易感動(dòng)物主要是禽類，對(duì)人體致病力極低，這是NDV 成為疫苗載體的首要條件。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功構(gòu)建多種人獸共患病的重組NDV 病毒，例如表達(dá)中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle east respiratory syndrome coronavirus，MERSCoV）S 蛋白的rLa-MERS-S[7]，表達(dá)水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）G 蛋白的rLa-VSVG[8]，表達(dá)馬爾堡病毒（Marburg virus，MARV）G 蛋白的rLa-MARVGP[9]等，這為本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建以重組NDV為載體的SARS-CoV 疫苗提供理論基礎(chǔ)。

本研究利用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的NDV LaSota 弱毒疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)，拯救表達(dá)了SARS-CoV S蛋白的重組病毒rLa-SARS-CoV-S，并通過BALB/c小鼠初步評(píng)價(jià)該重組病毒的安全性和免疫原性，為后續(xù)利用非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物（Non-human primates，NHPs）進(jìn)一步鑒定重組病毒的免疫原性奠定基礎(chǔ)。本研究證明rLa-SARS-CoV-S 不僅具有成為SARS-CoV 儲(chǔ)備性疫苗的潛在價(jià)值，同時(shí)也為研發(fā)SARS-CoV-2 疫苗提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料表達(dá)T7 聚合酶的重組痘病毒vTF7-3 由NIH 的Moss 博士惠贈(zèng)；重組NDV LaSota 弱毒疫苗株、NDV 感染克隆pBRN-FL-PmeⅠ以及輔助核蛋白（pBS-NP）、磷蛋白（pBS-P）和大聚合酶蛋白（pBS-L）重組質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[10]；BHK-21 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存，用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)；鼠抗SARS-CoV S 蛋白高免血清由本實(shí)驗(yàn)室制備：將本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的重組病毒VSVΔG-SARS-S以1×106TCID50/0.1 mL 的劑量通過肌肉注射途徑接種BALB/c 小鼠，免疫21 d 后對(duì)小鼠采血獲得高免血清；雞抗NDV 高免血清由本實(shí)驗(yàn)室制備：將NDV LaSota 弱毒株以2×106EID50/0.1 mL 的劑量通過滴鼻點(diǎn)眼的途徑接種SPF 雛雞，免疫14 d 后對(duì)雛雞采血獲得高免血清；pCAGG-SARS-CoV-S 克隆質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室制備：將SARS-CoV S 蛋白基因片段克隆至pCAGG 載體獲得克隆質(zhì)粒；10 日齡的SPF 雞胚由本研究所SPF 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；6 周齡雌性BALB/c小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑T4 DNA 連接酶和Pme I 限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自NEB 公司；Prime Star DNA Polymerase 購(gòu)自TaKaRa 公司；山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗鼠IgGFITC 和兔抗NDV F1 蛋白抗體均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；山羊抗鼠IgG-HRP 購(gòu)自Genscript公司；小鼠IgG 標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Southern Biotech 公司；PBS 購(gòu) 自HyClone 公 司；Alexa Fluor 568 標(biāo) 記 的 山 羊抗雞IgG 抗體、TRIzol 試劑、鼠源反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（M-MLV）和磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒均購(gòu)自Invitrogen 公司；預(yù)染蛋白Marker 購(gòu)自Fermentas 公司；DL5000 DNA Marker 和膠回收試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司。

1.3 SARS-CoV S 蛋白基因的擴(kuò)增和序列分析根據(jù)GenBank 中登錄的SARS-CoV S 蛋白基因序列（AAP13441.1），設(shè)計(jì)上下游引物（rLa-SARS-PF: 5'-GACTGTTTAAACTTAGAAAAAATACGGGTAGAAGCG CCACCATGTTTATTTTCTTATTATTTCTTACTC-3'/rLa-SARS-PR: 5'-GCGCGTTTAAACTCATTATGTGTAATG TAATTTGACACCC-3'），并且在SARS-CoV S 蛋白基因起始密碼子ATG 前引入PmeⅠ限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列、基因起始序列、基因間隔序列、基因終止序列以及Kozak 序列；在下游引物中引入PmeⅠ限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列。以重組質(zhì)粒pCAGG-SARSCoV-S 為模板，擴(kuò)增預(yù)期全長(zhǎng)3 768 bp 的SARS-CoV S 蛋白基因。將PCR 產(chǎn)物膠回收后克隆至pBlueScrip II KS（+）載體的EcoR Ⅴ位點(diǎn)，通過酶切和測(cè)序鑒定后將該重組質(zhì)粒命名為pBS-SARS-CoV-S。

1.4 表達(dá)SARS-CoV S 蛋白的病毒基因組全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建重組質(zhì)粒pBS-SARS-CoV-S經(jīng)PmeⅠ酶切處理后，膠回收SARS-CoV S 蛋白基因片段，再連接到同樣經(jīng)過PmeⅠ酶切處理、并已做去磷酸化處理的NDV 感染性克隆pBRN-FL-PmeⅠ，通過測(cè)序鑒定后將表達(dá)SARS-CoV S 蛋白的全長(zhǎng)cDNA 克隆命名為pBRN-FL-SARS-CoV-S。

1.5 重組病毒的拯救和RT-PCR 鑒定當(dāng)BHK-21細(xì)胞在六孔板內(nèi)生長(zhǎng)密度為80%～90%時(shí)，將MOI 0.01 的表達(dá)T7 聚合酶的重組痘病毒vTF7-3 預(yù)先感染細(xì)胞1 h 后利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法，將pBRN-FL-SARSCoV-S 及輔助質(zhì)粒pBS-NP、pBS-P 和pBS-L 分別以每孔5 μg、2.5 μg、1.25 μg、1.25 μg 共轉(zhuǎn)染BHK-21 細(xì)胞，具體的轉(zhuǎn)染方法參考文獻(xiàn)[10]。當(dāng)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變（CPE）并達(dá)到90 %以上時(shí)，收集細(xì)胞及上清液過濾后接種于10 日齡的SPF 雞胚內(nèi)，接種5 d 后收集50 μL 尿囊液并按照常規(guī)方法進(jìn)行血凝（Hemagglutination，HA）實(shí)驗(yàn)，收獲HA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性的尿囊液即為拯救病毒，將拯救的重組病毒命名為rLa-SARS-CoV-S。

將rLa-SARS-CoV-S 接種10 日齡的SPF 雞胚并連續(xù)傳3 代后，收集HA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性的尿囊液，利用TRIzol 試劑提取尿囊液中的總RNA。以SARS-CoV-SF/SARS-CoV-SR 為特異性引物進(jìn)行RTPCR 擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。

1.6 重組病毒的western blot 鑒定將rLa-SARSCoV-S 和NDV LaSota 以MOI 0.01 的劑量分別感染BHK-21 細(xì)胞，36 h 后收集細(xì)胞，利用細(xì)胞裂解液裂解后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳并將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，5%脫脂乳室溫封閉1 h。分別以鼠抗SARS-CoV S蛋白高免血清（1∶200）和兔抗NDV F1 蛋白抗體（1∶200）為一抗，山羊抗鼠IgG-HRP（1∶5 000）和山羊抗兔IgGHRP（1∶5 000）為二抗，進(jìn)行western blot 鑒定。

1.7 SARS-CoV S 蛋白在感染細(xì)胞中表達(dá)和定位的檢測(cè)將rLa-SARS-CoV-S 和NDV LaSota 以MOI 0.01 的劑量分別感染BHK-21 細(xì)胞36 h 后，用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞20 min；以雞抗NDV 高免血清（1∶50）和鼠抗SARS-CoV S 蛋白高免血清（1∶50）為一抗，以Alexa Fluor 568 標(biāo)記的山羊抗雞IgG（1∶200）和山羊抗鼠IgG-FITC（1∶200）為二抗，采用DAPI 對(duì)細(xì)胞核染色。利用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.8 重組病毒的體外生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)測(cè)定將100 μL rLa-SARS-CoV-S 和NDV LaSota 以1×104EID50的劑量分別接種SPF 雞胚，分別在接種12 h、24 h、48 h、72 h 和96 h 收集尿囊液，測(cè)定雞胚半數(shù)感染量（EID50），并繪制病毒生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線。

1.9 重組病毒的雞胚平均致死時(shí)間（MDT）測(cè)定將rLa-SARS-CoV-S 和NDV LaSota 分 別 用PBS 做10 倍倍比稀釋（10-5～10-9）。每個(gè)稀釋度共接種5 個(gè)10 日齡的SPF 雞胚，每個(gè)雞胚分別接種100 μL 病毒稀釋液；8 h 后每個(gè)稀釋度再接種5 個(gè)10 日齡的SPF雞胚，每個(gè)雞胚分別接種100 μL 病毒稀釋液。所有接種病毒的SPF 雞胚每隔12 h 觀察一次，連續(xù)觀察7 d，并分別記錄每個(gè)雞胚的死亡時(shí)間，按病毒最高稀釋度引起雞胚的死亡時(shí)間計(jì)算rLa-SARS-CoV-S和NDV LaSota 的雞胚M(jìn)DT。

1.10 重組病毒的小鼠安全性實(shí)驗(yàn)將rLa-SARSCoV-S 和NDV LaSota 分別以5×106EID50的劑量通過肌肉注射途徑接種8 只6 周齡雌性BALB/c 小鼠，同時(shí)把等體積的PBS 以相同的方式接種另外8 只6 周齡雌性BALB/c 小鼠作為對(duì)照組。接種后每日觀察小鼠的狀況并測(cè)量體質(zhì)量，連續(xù)觀察14 d。

1.11 小鼠的免疫實(shí)驗(yàn)和免疫后血清抗體的檢測(cè)將rLa-SARS-CoV-S 和NDV LaSota 分別以5×106EID50通過肌肉注射接種8 只6 周齡雌性BALB/c 小鼠，同時(shí)把另外8 只6 周齡雌性BALB/c 小鼠作為PBS 對(duì)照組；在免疫后第21 d 采用相同的辦法加強(qiáng)免疫。分別在首免后21 d 和42 d 對(duì)小鼠眼眶后靜脈叢采血制備血清；血清56 ℃滅活30 min，-80 ℃保存?zhèn)溆?。以純化后的S 蛋白作為抗原包被ELISA 板，待檢血清稀釋液為一抗，山羊抗鼠IgG-HRP（1∶5 000）為二抗，通過ELISA 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠血清中針對(duì)SARSCoV S 蛋白的特異性IgG 抗體水平。同時(shí)用已知濃度的小鼠IgG 標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算小鼠血清中針對(duì)SARS-CoV S 蛋白的IgG抗體濃度。

2 結(jié) 果

2.1 表達(dá)SARS-CoV S 蛋白基因的重組病毒的構(gòu)建與重組病毒拯救利用本實(shí)驗(yàn)室建立的NDV La?Sota 弱毒疫苗株反向遺傳系統(tǒng)，利用PCR 方法將SARS-CoV S 蛋白基因插入經(jīng)過PmeⅠ酶切、去磷酸化處理的NDV 感染性克隆pBRN-FL-PmeⅠ，通過酶切和測(cè)序鑒定后，將表達(dá)SARS-CoV S 蛋白基因的全長(zhǎng)cDNA克隆命名為pBRN-FL-SARS-CoV-S（圖1）。

圖1 表達(dá)SARS-CoV S蛋白的重組NDV基因組全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建Fig. 1 Construction of genomic cDNA of recombinant NDV expressing SARS-CoV spike protein

將pBRN-FL-SARS-CoV-S 和輔助質(zhì)粒pBSNP、pBS-P 和pBS-L 共 轉(zhuǎn) 染BHK-21 細(xì) 胞，當(dāng) 細(xì) 胞產(chǎn)生CPE 并達(dá)到90%以上時(shí)收集細(xì)胞及上清液，過濾后接種10 日齡的SPF 雞胚中。接種5 d 后采集尿囊液進(jìn)行HA 實(shí)驗(yàn)，HA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示為陽(yáng)性并且病毒尿囊液的血凝效價(jià)達(dá)到28。收獲尿囊液，將拯救的重組病毒命名為rLa-SARS-CoV-S。

2.2 rLa-SARS-CoV-S 的RT-PCR 鑒定將rLa-SARS-CoV-S 在10 日 齡 的SPF 雞 胚 中 連 續(xù) 傳3 代后，利用TRIzol 試劑提取尿囊液中的總RNA。利用SARS-CoV-SF/SARS-CoV-SR 作為特異性引物進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，獲得約3 800 bp 的片段（圖2），同時(shí)測(cè)序結(jié)果顯示該P(yáng)CR 產(chǎn)物的基因序列與已知SARSCoV S 蛋白基因序列一致。結(jié)果表明SARS-CoV S 蛋白已經(jīng)插入NDV LaSota 基因組中，初步證明已拯救重組病毒。

2.3 SARS-CoV S 蛋白表達(dá)的western blot 鑒定將rLa-SARS-CoV-S 和NDV LaSota 分別感染BHK-21細(xì)胞，感染36 h 后進(jìn)行western blot 檢測(cè)。結(jié)果顯示，在rLa-SARS-CoV-S 感染的細(xì)胞中出現(xiàn)一條約為250 ku 的特異性條帶（圖3A）；同時(shí)利用兔抗NDV F1蛋白抗體，在rLa-SARS-CoV-S 和NDV LaSota 分別感染的細(xì)胞中均可以檢測(cè)到一條55 ku 的NDV F 蛋白（圖3B）。結(jié)果表明SARS-CoV S 蛋白在重組病毒感染的細(xì)胞中可以正確表達(dá)。

圖2 RT-PCR 鑒定rLa-SARS-CoV-SFig. 2 Identification of rLa-SARS-CoV-S by RT-PCR

圖3 Western blot 檢測(cè)SARS-CoV S 蛋白在感染細(xì)胞中的表達(dá)Fig. 3 Detection of the expression of spike protein in rLa-SARS-CoV-S infected cells by western blot

2.4 SARS-CoV S 蛋白在感染細(xì)胞中表達(dá)和定位的檢測(cè)將rLa-SARS-CoV-S 和NDV LaSota 分別感染BHK-21 細(xì)胞后利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，rLa-SARS-CoV-S 感染的細(xì)胞中存在S 蛋白和NDV 蛋白，兩種蛋白共定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上；而在NDV LaSota 感染的細(xì)胞中，未觀察到S蛋白的特異性熒光（圖4）。結(jié)果表明SARS-CoV S蛋白在重組病毒感染的細(xì)胞中可以正確表達(dá)并準(zhǔn)確定位。

2.5 rLa-SARS-CoV-S 的生長(zhǎng)曲線將rLa-SARSCoV-S 和NDV LaSota 分別接種10 日齡的SPF 雞胚后在不同時(shí)間點(diǎn)收集尿囊液并分別測(cè)定EID50。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示rLa-SARS-CoV-S 的生長(zhǎng)趨勢(shì)與親本病毒NDV LaSota 基本保持一致，rLa-SARS-CoV-S 和NDV LaSota 的病毒滴度均在感染后48 h 達(dá)到峰值（圖5）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明了重組病毒滿足免疫滴度的要求，為后續(xù)利用小鼠鑒定重組病毒安全性和免疫原性提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖4 激光共聚焦觀察SARS-CoV S 蛋白在感染細(xì)胞中的表達(dá)和定位Fig. 4 Identification of SARS-CoV spike protein expression and localization in the infected cells by using confocal fluorescent microscopy

2.6 重組病毒的雞胚M(jìn)DT 測(cè)定將rLa-SARSCoV-S 和NDV LaSota 分別做10 倍倍比稀釋后接種SPF 雞胚，并記錄每個(gè)雞胚的死亡時(shí)間，按病毒最高稀釋度引起雞胚的死亡時(shí)間計(jì)算MDT。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NDV LaSota 引起兩組雞胚全部死亡的最高稀釋度均為10-8，rLa-SARS-CoV-S 引起兩組雞胚全部死亡的最高稀釋度均為10-7，進(jìn)一步通過計(jì)算可以得知NDV LaSota 的MDT 為96 h，rLa-SARS-CoV-S 的MDT 為112.8 h。結(jié)果表明重組病毒仍然保持親本病毒NDV LaSota 的低致病力特性。

圖5 重組病毒rLa-SARS-CoV-S 和NDV LaSota 的生長(zhǎng)曲線Fig. 5 Growth curves of rLa-SARS-CoV-S and NDV LaSota in chicken embryo

2.7 rLa-SARS-CoV-S 對(duì)小鼠的安全性實(shí)驗(yàn)將rLa-SARS-CoV-S 和NDV LaSota 分別接種BALB/c 小鼠，接種后連續(xù)14 d 觀察小鼠的健康狀況并測(cè)量體質(zhì)量。結(jié)果顯示感染組和對(duì)照組的小鼠全部存活，均沒有表現(xiàn)出任何臨床癥狀，并且兩組小鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)趨勢(shì)一致（圖6）。結(jié)果表明重組病毒對(duì)小鼠具有較好的安全性，對(duì)小鼠不具有致病性。

2.8 rLa-SARS-CoV-S 免疫小鼠后抗體水平檢測(cè)將rLa-SARS-CoV-S 和NDV LaSota 分別兩次免疫BALB/c 小鼠，采集初次免疫后21 d 和42 d 血清進(jìn)行ELISA 檢測(cè)。結(jié)果顯示rLa-SARS-CoV-S 在一免和加強(qiáng)免疫后均可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的IgG 抗體，并且抗體水平可以維持較長(zhǎng)一段時(shí)間；而接種NDV LaSota 和PBS 對(duì)照組無(wú)針對(duì)SARS-CoV S 蛋白的IgG 特異性抗體（圖7）。結(jié)果表明重組病毒可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的IgG 抗體，對(duì)小鼠具有良好的免疫原性。

圖6 感染后小鼠的體重增長(zhǎng)趨勢(shì)Fig. 6 The weight gain trend of inoculated mice

圖7 rLa-SARS-CoV-S 免疫小鼠后IgG 抗體水平分析Fig. 7 ELISA analysis of mouse serum against rLa-SARS-CoV-S

3 討 論

SARS 是一種流行范圍廣泛、傳染性強(qiáng)、死亡率高的人獸共患病，研發(fā)SARS-CoV 疫苗是建立有效防控該病措施的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前正在研發(fā)的SARSCoV 疫苗種類很多，包括滅活病毒疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗、DNA 疫苗等。但是這些疫苗均存在部分缺點(diǎn)，例如滅活病毒疫苗需要多次免疫才能產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)作用；減毒活疫苗存在疫苗毒力返祖或交叉感染可能性；DNA 疫苗具有將外源DNA 整合到宿主基因組的風(fēng)險(xiǎn)；亞單位疫苗的免疫原性較低，需要適當(dāng)佐劑才可以產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)作用。NDV 作為一種活病毒疫苗載體，具有免疫效果良好、誘導(dǎo)免疫途徑廣泛、遺傳性穩(wěn)定、安全性高等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，因此NDV 反向遺傳操作技術(shù)已經(jīng)廣泛用于新型疫苗的研發(fā)中。針對(duì)復(fù)雜的國(guó)際環(huán)境以及SARS 傳播速度快、感染率高和死亡率高的特點(diǎn)，研制一種快速、有效、安全的SARS-CoV 疫苗是SARS 防控工作重點(diǎn)，而研發(fā)以重組NDV 為載體的SARS-CoV 疫苗可以滿足人們的需求。

本研究利用實(shí)驗(yàn)室建立的NDV LaSota 弱毒疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)，拯救出表達(dá)SARS-CoV S 蛋白的重組病毒rLa-SARS-CoV-S。RT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明外源基因S 蛋白插入NDV 基因組，初步證明重組病毒被成功拯救；Western blot 與激光共聚焦實(shí)驗(yàn)表明S 蛋白在感染細(xì)胞中可以正確表達(dá)與定位，進(jìn)一步證明重組病毒構(gòu)建成功；MDT 實(shí)驗(yàn)表明rLa-SARS-CoV-S 仍然保持親本病毒NDV LaSota 疫苗株的低致病力特性，說明在NDV 基因組中插入外源蛋白基因S 不會(huì)改變重組病毒的遺傳穩(wěn)定性；病毒的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線結(jié)果表明rLa-SARS-CoV-S 與NDV LaSota 的生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，均可在雞胚中產(chǎn)生較高的病毒滴度，滿足動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)的滴度需要。BALB/c 小鼠安全性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明rLa-SARS-CoV-S對(duì)小鼠不具有致病性；將rLa-SARS-CoV-S 免疫小鼠后檢測(cè)小鼠血清中的抗體水平，ELISA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明初次免疫該病毒就能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的特異性IgG 抗體，加強(qiáng)免疫后抗體水平顯著提高，并且能維持較長(zhǎng)一段時(shí)間。雖然中和抗體效價(jià)檢測(cè)是評(píng)估疫苗免疫原性的重要環(huán)節(jié)之一，但由于SARS-CoV 必須在生物安全防護(hù)三級(jí)實(shí)驗(yàn)室（Biologi?cal safety protection third-level laboratory，BSL-3）中操作，以及按照國(guó)家相關(guān)SARS 的法律規(guī)定，因此無(wú)法使用活毒對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)與中和實(shí)驗(yàn)。

本研究表明重組病毒rLa-SARS-CoV-S 對(duì)小鼠有較高的安全性和良好的免疫原性，具有作為SARS-CoV 儲(chǔ)備性候選疫苗的潛在價(jià)值，同時(shí)也為研發(fā)SARS-CoV-2 疫苗提供新思路。