豬塞尼卡病毒VP2 ELISA 抗體檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

周而璇，范 慧，延君芳，姜 平，白 娟

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物細(xì)菌學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095）

塞尼卡病毒（Senecavirus A，SVA），最早稱為塞尼卡谷病毒（Seneca valley virus SVV）。中文名有塞內(nèi)卡病毒、塞內(nèi)加病毒和塞尼卡病毒。SVA 屬于小RNA 病毒科塞內(nèi)卡病毒屬成員，2002 年Hales 等首次發(fā)現(xiàn)于PER.C6（人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞）細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)該病毒具有溶解人類腫瘤作用[1]。2008 年以來(lái)，加拿大和美國(guó)等西方國(guó)家先后報(bào)道該病毒感染引起的豬臨床疾病，包括成年豬口腔和鼻腔潰瘍、厭食、爛足、仔豬嗜睡、虛弱、發(fā)熱和嘔吐等[2-5]。該病毒感染主要影響育肥豬和新生仔豬，1日齡～4日齡仔豬發(fā)病率可達(dá)到70%，死亡率15%～30%；母豬發(fā)病率可達(dá)到70%～90%，但死亡率僅0.2%[6-8]。2015 年，我國(guó)廣東省證實(shí)豬群存在該病，且SVVCH-01-2015 分離株與國(guó)外病毒株基因同源性為94.4%～97.1%[9]。此后，有學(xué)者相繼報(bào)道我國(guó)多地出現(xiàn)該病。本實(shí)驗(yàn)室從山東省某臨床發(fā)病豬群也分離獲得該病毒[10]。

該病毒抗體檢測(cè)方法主要有間接ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA、間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）和病毒中和試驗(yàn)等。ELISA 方法采用的包被抗原有VP1、VP2、VP3和3AB 蛋白等[10-13]。VP2-ELISA 方法的敏感性和特異性分別為94.2%和89.7%，優(yōu)于VP1 和VP3 抗原ELISA 方法，與IFA 符合率為89%[12]。病毒中和試驗(yàn)的特異性和敏感性分別為99.6%和98.2%[13]。本研究采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)獲得VP2 純化重組蛋白，通過(guò)條件優(yōu)化，建立了VP2 間接ELISA 抗體檢測(cè)方法，并用于規(guī)?；i場(chǎng)血清流行病學(xué)調(diào)查，表明2016 年～2019 年我國(guó)多個(gè)省份廣泛存在該病毒感染，為我國(guó)該病防控提供了重要流行病學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 病毒與血清SVA SVV-CH-SD 株由本實(shí)驗(yàn)室分離和保存；SVA VP2 單克隆抗體（MAb）和120 份SVA 陽(yáng)性血清（采自SVV-CH-SD 株攻毒豬，且中和試驗(yàn)鑒定為陽(yáng)性）由本實(shí)驗(yàn)室制備和保存；70 份SVA 陰性血清采自臨床健康豬，且中和試驗(yàn)鑒定為陰性；口蹄疫病毒（FMDV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）、豬瘟病毒（CSFV）和豬偽狂犬病毒（PRV）陽(yáng)性血清，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

2 182 份臨床豬血清，為2016 年～2019 年收集自江蘇、安徽、浙江、山東和江西等省份規(guī)?；i場(chǎng)臨床血清，-40 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑pET-32a（+）、E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；HRP 標(biāo)記的金黃色葡萄球菌A 蛋白（HRP-SPA）購(gòu)自博士德生物技術(shù)有限公司；TMB 顯色液、限制性內(nèi)切酶、T4 連接酶購(gòu)自TaKaRa 公司；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Pierce 公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Biomiga 公司；BSA 牛血清白蛋白購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司；96 孔酶標(biāo)板購(gòu)自Corning 生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)SVACH-02-2015 株VP2基因序列（KX173339.1）利用Primer5.0 軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為852 bp：SVA-VP2-F：5'- CGCGGATCCGATCACAATACCGAAGAAATGGAAA ACTCTGC-3'/SVA-VP2-R：5'-ATACTCGAGCTGTTC CTCGTCCGTCCCG-3'，下劃線分別為BamH I 和Xho I酶切位點(diǎn)。引物由金斯瑞生物技術(shù)有限公司委托合成。

1.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化提取SVA SVVCH-SD 株RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，采用針對(duì)VP2 基因PCR 引物擴(kuò)增VP2 基因，PCR 產(chǎn)物純化回收后克隆至pET-32a（+）載體，獲得重組質(zhì)粒pET-32a-VP2，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定正確后轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。37 ℃震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，加入終濃度為1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)5 h。菌液離心后，收集菌體，用15 mL PBS 重懸，超聲裂解并離心后，分別收集上清和沉淀，采用SDSPAGE 分析蛋白表達(dá)形式。將獲得的重組蛋白用Ni柱純化處理，以SVA VP2 MAb（1∶200）為一抗，山羊抗鼠Ig-HRP（1∶1 000）為二抗，western blot 鑒定VP2 蛋白與SVA 血清的反應(yīng)原性。大量制備獲得純化重組VP2 蛋白，經(jīng)BCA 法測(cè)定蛋白濃度，-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 間接ELISA 反應(yīng)條件優(yōu)化采用方陣滴定法分別對(duì)間接ELISA 的VP2 蛋白抗原包被濃度（4 μg/mL、3 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL）、血清稀釋度（1∶50、1∶100、1∶200、1∶400）、包 被 時(shí) 間（4 ℃過(guò) 夜、37 ℃孵育2 h+4 ℃過(guò)夜、37 ℃孵育1 h+ 4 ℃過(guò)夜）、封閉試劑（5% BSA、1% BSA、5%脫脂乳）、封閉時(shí)間（3 h、2 h、1 h）、血清作用時(shí)間（30 min、45 min、60 min）、HRP-SPA 稀 釋 度（1∶5000、1∶10 000、1∶15 000）和反應(yīng)時(shí)間（30 min、45 min、60 min）、TMB顯色時(shí)間（4 min、6 min、8 min、10 min、12 min、14 min、16 min），進(jìn)行優(yōu)化，以P/N 值（陽(yáng)性血清OD450nm/陰性血清OD450nm）最大時(shí)的反應(yīng)條件為ELISA的最佳反應(yīng)條件。

1.6 ELISA 陰陽(yáng)性臨界值的確定采用上述優(yōu)化的ELISA 方法檢測(cè)70 份SVA 抗體陰性的臨床豬血清樣品，設(shè)定SVA 陰陽(yáng)性血清對(duì)照，測(cè)定各血清的OD450nm值。計(jì)算S/P 值，S/P=（樣品血清OD450nm值-陰性血清OD450nm值）/（陽(yáng)性血清OD450nm值-陰性血清OD450nm值）。計(jì)算S/P 值平均值和標(biāo)準(zhǔn)差（-X 和SD）。按照S/P 值≥-X +3SD 時(shí)為判定血清抗體陽(yáng)性，S/P 值<-X +2SD 時(shí)為陰性；介于兩者之間判為可疑。

1.7 特異性試驗(yàn)利用本實(shí)驗(yàn)已建立的ELISA 方法對(duì)FMDV、PRRSV、PCV2、CSFV、PRV 陽(yáng)性血清抗體進(jìn)行檢測(cè)，以SVA 陽(yáng)性血清為陽(yáng)性對(duì)照，SVA 陰性血清為陰性對(duì)照，檢測(cè)該方法的特異性。

1.8 敏感性試驗(yàn)選取120 份SVA 陽(yáng)性血清，用PBS 做1∶100 稀釋，采用優(yōu)化的VP2 間接ELISA 方法檢測(cè)，測(cè)定OD450nm，根據(jù)S/P 值判定血清抗體陰陽(yáng)性，計(jì)算陽(yáng)性血清檢出率，分析該方法敏感性。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)采用同批包被抗原的ELISA 酶標(biāo)板對(duì)5 份抗體水平不同的豬SVA 陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)3 次試驗(yàn)。批間重復(fù)試驗(yàn)采用3 批抗原包被的酶標(biāo)板，分別檢測(cè)5 份抗體水平不同的豬SVA 陽(yáng)性血清SVA 抗體，計(jì)算S/P 值及其變異系數(shù)。

1.10 符合率比較試驗(yàn)選取112 份臨床豬血清樣本（從SVA 豬場(chǎng)隨機(jī)采集），參照FMDV 微量血清中和試驗(yàn)（SN/T 1181.2-2003）進(jìn)行血清SVA 中和試驗(yàn)（SN），中和抗體效價(jià)<1∶4 判定為陰性，≥1∶4 為陽(yáng)性，同時(shí)利用建立的SVA 間接ELISA 方法檢測(cè)這112 份豬血清。結(jié)果判定以SN 試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)，分析兩種方法符合率。符合率（%）=[（陽(yáng)性數(shù)+陰性數(shù)）/檢測(cè)總數(shù)]×100%。

1.11 華東地區(qū)豬SVA 流行病學(xué)調(diào)查利用本實(shí)驗(yàn)建立的VP2 間接ELISA 檢測(cè)方法對(duì)2016 年～2019 年度我國(guó)華東地區(qū)江蘇、浙江、山東、安徽、江西等地2 070 份血清進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)3 次，取其OD450nm平均值，分析華東地區(qū)SVA 的流行狀況。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因克隆、表達(dá)與純化以SVA 反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增獲得大小為852 bp的VP2 基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-VP2，目的基因測(cè)序正確。轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 感受態(tài)細(xì)胞，IPTG 誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE 檢測(cè)，重組菌pET-32a-VP2/DE3 經(jīng)誘導(dǎo)后在55 ku 出現(xiàn)目的條帶（圖1A）。表明目的蛋白獲得了表達(dá)，且主要以包涵體的形式存在，制備獲得純化重組蛋白大小約55 ku，west?ern blot 結(jié)果顯示在55 ku 處出現(xiàn)特異條帶（圖1B），表明重組VP2 蛋白具有反應(yīng)原性。

圖1 SVA VP2 重組蛋白SDS-PAGE（A）和western blot（B）鑒定Fig. 1 SDS-PAGE(A) and western blot(B) identification of SVA VP2 recombinant protein

2.2 間接ELISA 反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果采用方陣滴定法確定了重組VP1 蛋白包被濃度和待檢血清稀釋倍數(shù)，在此基礎(chǔ)上對(duì)其他各個(gè)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示最佳反應(yīng)條件為：抗原最佳包被濃度為1 μg/mL，37 ℃孵育2 h 后4°過(guò)夜；5%脫脂乳溶液37 ℃封閉3 h；待檢血清1∶100 稀釋，37 ℃反應(yīng)30 min，HRP-SPA 1∶15 000 稀釋，37 ℃作用30 min，加入TMB 顯色液，37 ℃避光顯色10 min，最后測(cè)定OD450nm值。

2.3 臨界值的確定利用該方法檢測(cè)70 份陰性豬血清，平均OD450nm值為0.228，陽(yáng)性對(duì)照平均OD450nm為1.034。S/P 平均值和標(biāo)準(zhǔn)差分別為-X=0.053，SD=0.059。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，S/P（樣本）≥-X+3SD=0.227時(shí)為陽(yáng)性，S/P（樣本）<-X+2SD=0.171 時(shí)為陰性，介于兩者之間時(shí)判為可疑（圖2）。

圖2 SVA VP2 ELISA 抗體陰性血清正態(tài)分布分析Fig. 2 Analysis of the negative serums against SVA VP2 with ELISA

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果利用該方法檢測(cè)5 種豬病原抗體陽(yáng)性血清，結(jié)果均為陰性（表1），表明該蛋白與FMDV、PRRSV、PCV2、CSFV 和PRV 陽(yáng)性血清抗體均無(wú)交叉反應(yīng)，SVA 陰陽(yáng)性對(duì)照均成立。表明該方法特異性較強(qiáng)。

表1 SVA VP2 間接ELISA 方法特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 SVA VP2 indirect ELISA method specific test results

2.5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果取120 份SVA 人工感染豬SVA 抗體陽(yáng)性血清，采用本研究建立的ELISA 方法檢測(cè)，結(jié)果有110 份血清抗體陽(yáng)性，陽(yáng)性血清檢出率為91.6%。表明該方法敏感性較高。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果選擇5 份豬血清分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)檢測(cè)3 次，結(jié)果顯示，批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)為3.12%～11.1%，批間變異系數(shù)為2.98%～9.67 %，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于12%（表2），表明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.7 符合率試驗(yàn)結(jié)果利用本研究建立的間接ELI?SA 和SN 試驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)112 份臨床豬血清樣本，結(jié)果顯示，兩種方法的符合率為91.9%（表3）。表明該方法與SN 試驗(yàn)符合率較高。

圖3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig. 3 Sensitivity test results

表2 SVA VP2 間接ELISA 方法重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 SVA VP2 indirect ELISA method repeatability test

表3 SVA VP2 間接ELISA 抗體檢測(cè)方法與SN 試驗(yàn)結(jié)果比較Table 3 Comparison of SVA VP2 indirect ELISA antibody detection method and SN test results

2.8 華東五省份血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果采集2016年～2019 年華東地區(qū)5 省份規(guī)模豬場(chǎng)血清2 070 份，采用本研究建立的VP2 ELISA 方法檢測(cè)。結(jié)果顯示，2016 年～2019 年華東地區(qū)豬場(chǎng)SVA 抗體陽(yáng)性率為70.8%，各省抗體陽(yáng)性率均達(dá)67%以上。而且，2017 年～2019 年血清抗體陽(yáng)性率變化趨勢(shì)基本一致（表4），表明本實(shí)驗(yàn)建立的ELISA 方法可以用于臨床血清學(xué)檢測(cè)，同時(shí)表明SVA 于2016 年前已經(jīng)在我國(guó)多地感染并流行。

表4 2016 年～2019 年5 個(gè)省份規(guī)?；i場(chǎng)豬血清SVA ELISA 抗體檢測(cè)結(jié)果Table 4 ELISA results of anti-SVA antibody of pig serum from large scale pig farms in 5 provinces in 2016 to 2019

3 討 論

SVA 基因組約為7.2 kb，包含一個(gè)開放閱讀框（ORF），編碼2 181 個(gè)氨基酸（aa）多蛋白，一個(gè)668核苷酸（nt）5'非翻譯區(qū)（UTR）和一個(gè)71-nt 3'UTR。其中編碼2 181 個(gè)氨基酸的開放閱讀框，由12 個(gè)蛋白（LPRO、VP1、VP2、VP3、VP4、2A、2B、2C、3A、3B、3C 和3D）構(gòu)成[1-2,4]。SVA 的B 細(xì)胞表位主要存在于VP1、VP2 和VP3 蛋白。SVA 感染早期即可產(chǎn)生較強(qiáng)病毒中和抗體反應(yīng)。VP2 特異性IgM 抗體反應(yīng)與SVA 感染后的早期中和抗體水平相關(guān)。由于VP2 包含SVA 的免疫顯性T 細(xì)胞表位，VP2 誘導(dǎo)的CD4+T 細(xì)胞數(shù)量和CD4+T、CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)均高于VP1[14-15]。Dvorak 等在進(jìn)行大量血清樣品檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)包被VP2 抗原ELISA 板的敏感性和特異性均高于VP1 和VP3[13]。本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)并制備獲得反應(yīng)性較好的VP2 重組蛋白，建立了VP2 蛋白間接ELISA 抗體檢測(cè)方法。該方法與CSFV、PRRSV和PCV2抗體均無(wú)交叉反應(yīng)性，敏感性達(dá)91.6%，與中和抗體試驗(yàn)符合率達(dá)91.9%。

血清學(xué)回顧性研究有助于全面了解地區(qū)病毒的感染情況，如Saporiti 等利用中和試驗(yàn)對(duì)2007 年～2016年巴西不同豬場(chǎng)進(jìn)行了血清學(xué)回顧性研究，發(fā)現(xiàn)2014 年前巴西主要豬場(chǎng)不存在SVA 感染，2014 年～2016 年 間SVA 抗 體 陽(yáng) 性 率 為36.4%[16]。2015 年 以來(lái)，我國(guó)廣東、湖北、河南和遼寧等多省份已確診多例SVA 感染豬群[9-10]。本研究采用該方法對(duì)2016年～2019 年華東地區(qū)江蘇、山東、浙江、安徽和山西5 個(gè)省市規(guī)?；i場(chǎng)臨床血清進(jìn)行了回顧性血清抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示，2016 年～2019 年各省份SVA抗體陽(yáng)性率達(dá)70.8%以上，證明我國(guó)多個(gè)省份規(guī)模化豬場(chǎng)均已存在SVA 感染，與范慧等報(bào)道的結(jié)果基本一致[12]。目前我國(guó)該病尚未列入官方動(dòng)物疫病監(jiān)控計(jì)劃，也缺少商品化ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒和免疫防控方法。本研究為我國(guó)塞內(nèi)卡病的診斷和防控提供參考。