自噬在沙門菌抗感染免疫中的作用

王 苗，杜萬年，張志強(qiáng)

（河北科技師范學(xué)院，河北 秦皇島 066000）

自噬是一種細(xì)胞“自食現(xiàn)象”，通過自噬，細(xì)胞能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)變性、衰老和失去功能的蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子降解，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的再循環(huán)。其最大的特點(diǎn)是形成一個(gè)雙層膜泡結(jié)構(gòu)，將待降解的細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)包裹起來的，這個(gè)結(jié)構(gòu)稱之為自噬體。除了生理性的自噬現(xiàn)象，病理性自噬也被證實(shí)存在于多種疾病模型中，尤其是病原感染性疾病。已有研究表明，多種病原微生物均可造成細(xì)胞自噬，通過調(diào)控宿主細(xì)胞自噬過程，病原能夠完成逃避宿主免疫殺傷建立感染。

沙門菌可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生自噬以應(yīng)對(duì)宿主免疫系統(tǒng)，因此經(jīng)常被用作研究細(xì)菌觸發(fā)細(xì)胞自噬以及自噬介導(dǎo)的宿主防御的生物模型。沙門菌在侵入動(dòng)物機(jī)體后主要在單核巨噬細(xì)胞內(nèi)生長增殖，為避免過度增殖引發(fā)宿主適應(yīng)性免疫的清除，沙門菌會(huì)通過觸發(fā)細(xì)胞的自噬限制其在細(xì)胞內(nèi)的增殖，減少對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的刺激。沙門菌通常位于含沙門菌的液泡（Salmonella-containing vacuole，SCV）中，并利用兩種類型的免疫系統(tǒng)對(duì)SCV 產(chǎn)生影響，因此沙門菌感染與細(xì)胞的自噬免疫途徑存在著密不可分的關(guān)系。

1 沙門菌感染引發(fā)細(xì)胞自噬機(jī)制

沙門菌屬成員宿主范圍廣泛，相當(dāng)多的沙門菌屬于人獸共患病原菌。在動(dòng)物上，沙門主要感染幼齡動(dòng)物，3 周齡以內(nèi)的雛雞、5 月齡以下的仔豬、1月齡以后的犢牛、斷乳羔羊、6 月齡以內(nèi)的幼駒最易感，臨床癥狀多表現(xiàn)為敗血癥和腸炎；在人上，沙門菌主要通過食源途徑感染，引發(fā)食物中毒和敗血癥，是一類重要的人畜共患病原體[1]。沙門菌屬成員眾多，有鼠傷寒沙門菌、傷寒沙門菌、腸炎沙門菌等多種血清型，其致病相關(guān)的毒力基因主要位于染色體和質(zhì)粒中，這些毒力相關(guān)基因和調(diào)控因子聚集在染色體的特定區(qū)域，稱為沙門菌毒力島[2]（Salmonella pathogenicity islands，SPIs）。沙門菌毒力島1（SPI-1）和毒力島2（SPI-2）能夠編碼兩種三型分泌系統(tǒng)（Type III secretion system，T3SS）完成，在沙門菌感染宿主細(xì)胞以及觸發(fā)細(xì)胞自噬逃避免疫殺傷過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3-4]。

1.1 沙門菌感染過程沙門菌通過SPI-1 T3SS 介導(dǎo)的方式觸發(fā)細(xì)胞自身內(nèi)化侵入宿主細(xì)胞[5]。內(nèi)化之后，沙門菌會(huì)在宿主細(xì)胞內(nèi)形成含菌小泡，SCV 不同于吞噬溶酶體，對(duì)沙門菌友好，適合沙門菌的存活和增殖。SCV 的生成和成熟依賴于SPI-1 T3SS 和SPI-2 T3SS 效應(yīng)蛋白的參與，二者相互作用調(diào)控內(nèi)吞途徑，以避免溶酶體的融合和SCV 的降解[6]。沙門菌成功侵入宿主細(xì)胞后初期引起炎癥反應(yīng)，但隨著其在細(xì)胞內(nèi)感染程度的加深，會(huì)通過一系列機(jī)制抑制宿主炎癥反應(yīng)[7]。

沙門菌通過T3SS 效應(yīng)蛋白調(diào)控宿主免疫系統(tǒng)的機(jī)制如圖1 所示。沙門菌鞭毛蛋白表達(dá)量的下降可顯著抑制炎癥小體NLRC4 的促炎作用，調(diào)控三羧酸（TCA）循環(huán)代謝物檸檬酸的產(chǎn)生，削弱NLRP3 活化炎癥巨噬細(xì)胞反應(yīng)[8]。此外，許多T3SS 效應(yīng)蛋白具有抗炎作用。SPI-1 T3SS 效應(yīng)蛋白AvrA 和SPI-2 T3SS 效應(yīng)蛋白SseL 可以抑制NF-Kb 信號(hào)通路重要分子IκBα 降解，通過NF-Kb 信號(hào)通路調(diào)控下游炎癥因子表達(dá)，AvrA 還可通過抑制p38 和JNK 信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞炎癥反應(yīng)[9]。SPI-2 T3SS 效應(yīng)蛋白GogA、GtgA 和PipA 是同一蛋白酶家族的成員，它們共同作用使NF-κB 家族的特定成員RelA 和RelB 表達(dá)量下降，進(jìn)而調(diào)控炎癥反應(yīng)。沙門菌T3SS 效應(yīng)蛋白SspH1 可直接抵達(dá)宿主細(xì)胞核內(nèi)，通過與蛋白激酶1（Protein kinase，PKN1）的相互作用抑制NF-κB 介導(dǎo)的基因表達(dá)[10]。效應(yīng)蛋白SptP 由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，N-末端結(jié)構(gòu)域處于Cdc42 和Rac1 的間隙，其作用是介導(dǎo)SopE 對(duì)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重構(gòu)；C-末端結(jié)構(gòu)域具有酪氨酸磷酸酶活性，能夠調(diào)控沙門菌感染細(xì)胞MAPK-ERK 信號(hào)通路的激活。SptP 主要通過調(diào)控Raf1 的表達(dá)來抑制MAPK 途徑[11]。SptP 和SspH1通過抑制ERK 激活表達(dá)降低了腸上皮細(xì)胞的IL-8 生成量，SpvC 可通過去磷酸化滅活ERK 從而減少促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[12]。GogB 通過靶向宿主SCF E3 泛素連接酶抑制IκBα 的降解，限制激活NF-κB 途徑達(dá)到抗炎目的[13]。SseK1 是SPI-1 T3SS 和SPI-2 T3SS均能夠分泌的一種效應(yīng)蛋白，具有n-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶活性，可修飾TNF-α 受體TNFR1 和接頭分子TRADD，抑制TNF-α 介導(dǎo)的NF-κB 活化[14]。血紅素加氧酶1（HO-1）是沙門菌對(duì)抗炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，該成分主要存在于宿主細(xì)胞內(nèi)，很多病原菌在感染過程中會(huì)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生HO-1，沙門菌通過巨噬細(xì)胞具有上調(diào)HO-1 表達(dá)量的作用，為沙門菌提供了生存空間[15]。

圖1 沙門菌感染調(diào)控宿主免疫系統(tǒng)的機(jī)制（引自Bernal-Bayard J[29]）

感染早期發(fā)生后，SPI-1T3SS 系統(tǒng)表達(dá)量普遍下調(diào)，在低pH 值、低Mg2+/Fe3+含量和低營養(yǎng)有效性的吞噬環(huán)境中誘導(dǎo)SPI-2 T3SS 的表達(dá)[16]。此系統(tǒng)分泌的效應(yīng)蛋白對(duì)于SCV 膜泡的修復(fù)和維持具有至關(guān)重要的作用，其中SseJ 作用于膜泡上的磷脂和膽固醇，可以使SCV 的蛋白表位發(fā)生改變，同時(shí)還可以使胞質(zhì)內(nèi)膽固醇含量升高。sifA 結(jié)構(gòu)也可以保持SCV 膜的完整性，進(jìn)而為沙門菌在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制生存提供有利保障[17]。

1.2 細(xì)胞的自噬機(jī)制自噬是一種高度保守的細(xì)胞內(nèi)過程，其將不需要的或受損的細(xì)胞質(zhì)成分傳遞給溶酶體進(jìn)行降解。這一過程涉及36 種以上的自噬相關(guān)蛋白復(fù)合體相互作用，這些蛋白復(fù)合體相互協(xié)調(diào)，將細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)包裹在雙膜結(jié)合的液泡中，然后與溶酶體融合形成降解性自溶體[18]。通過這種方式，自噬作為一種質(zhì)控機(jī)制發(fā)揮作用，消除蛋白質(zhì)聚集體和受損的細(xì)胞器以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

SPI-1 T3SS 是主動(dòng)侵襲所必需的，此外SPI-2 T3SS 的表達(dá)促進(jìn)了沙門菌在自噬體膜泡內(nèi)存活[19]。在沙門菌感染宿主細(xì)胞期間，SPI-1 T3SS 介導(dǎo)的SCV 損傷使泛素和galectin-8 靶向SCV 內(nèi)的沙門菌或細(xì)胞質(zhì)中的游離沙門菌，完成對(duì)其的清除。這些活動(dòng)信號(hào)能夠招募重要的抗菌自噬分子，包括轉(zhuǎn)運(yùn)受體激酶TBK1 和WIPI2，通過抗菌自噬限制沙門菌增殖[20]。自噬在修復(fù)受損的SCV 膜方面也發(fā)揮作用，能夠誘導(dǎo)SCV 內(nèi)沙門菌SPI-2 T333 活化。在上皮細(xì)胞中，沙門菌通過SPI-2 T3SS 介導(dǎo)的方式誘導(dǎo)SCV附近形成泛素聚集體。這些聚集體被自噬機(jī)制識(shí)別，SPI-2 T3SS 效應(yīng)器SseL 是一種二肽酶，能夠降低細(xì)胞自噬流，有助于細(xì)胞內(nèi)沙門菌的復(fù)制[21]。此外，SPI-2 T3SS 通過向SCV 招募局灶性粘附激酶（FAK）和激活A(yù)kt-mTORC1 信號(hào)通路抑制巨噬細(xì)胞自噬發(fā)生，從而抑制干擾素β（IFN-β）介導(dǎo)的保護(hù)性細(xì)胞因子反應(yīng)[22]。SpvB 是一種具有ADP 核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的SPI-2 T3SS 效應(yīng)蛋白，通過防止G-肌動(dòng)蛋白聚合成F-肌動(dòng)蛋白絲抑制自噬體的形成[23]。

2 自噬在沙門菌感染中的雙重作用

細(xì)胞自噬作用于沙門菌感染包括3 條途徑，其中兩條途徑作為抗菌防御機(jī)制，攻擊入侵的沙門菌，清除病原體，進(jìn)而保護(hù)宿主細(xì)胞；還有一條途徑被感染細(xì)胞的沙門菌所利用，既修復(fù)了破損的SCV，又為自身的復(fù)制生存提供了環(huán)境。

2.1 細(xì)胞自噬對(duì)沙門菌具有免疫作用宿主細(xì)胞可以通過兩種自噬方式防御沙門菌的感染。如圖2 所示（途徑1），在第一種途徑中，雖然大多數(shù)細(xì)菌都包含在SCV 中，但是有部分沙門菌能逃出空泡，在胞漿中過度復(fù)制。這些游離性沙門菌難以長期在胞漿內(nèi)生存，從SCV 釋放不久后就被泛素（Ubiquitin）標(biāo)記，其中P62 為泛素化結(jié)合蛋白，可以與泛素標(biāo)記的細(xì)菌結(jié)合，同時(shí)P62 也作為自噬底物與LC3 結(jié)合介導(dǎo)自噬體，通過泛素結(jié)合域與泛素化細(xì)菌結(jié)合，并與自噬體分子標(biāo)記物Atg8/LC3 和自噬底物SQSTM1/p62 相互作用將其與新生的自噬體連接。一旦隔離在完整的自噬體中，沙門菌將會(huì)被降解[24]。細(xì)胞防御沙門菌自噬作用的第二種途徑是識(shí)別SPI-1T3SS 的針孔裝置遺留的SCV 膜損傷。如圖2 所示（途徑2），在這種情況下，沙門菌存在于受損的SCV 中。SPI-1 T3SS 造成的SCV 膜穿孔，會(huì)招募包括半乳凝素（galectin-8）在內(nèi)的多種細(xì)胞溶質(zhì)成分，galectin-8 是膜結(jié)構(gòu)完整的標(biāo)記蛋白，是自噬的誘導(dǎo)分子。galectin-8 標(biāo)記的SCV 招募LC3、NDP52 到細(xì)胞膜上，促發(fā)自噬信號(hào)的產(chǎn)生，進(jìn)一步發(fā)生自噬捕獲和沙門菌的降解[25]。

自噬作為一種基本的分解代謝機(jī)制，它通過溶酶體的作用參與非必需或功能失調(diào)的細(xì)胞成分的降解。在這個(gè)過程中，待降解的物質(zhì)被逐漸成熟的自噬體包裹，然后，自噬體與溶酶體融合，形成自噬溶酶體。最后，借助于溶酶體內(nèi)存在的多種酶類和酸性環(huán)境，待降解物質(zhì)被降解為氨基酸和糖類等，進(jìn)而被細(xì)胞循環(huán)利用[26]。沙門菌依賴SPI-2 T3SS 誘導(dǎo)SCV 附近形成泛素聚集體，這些聚集體被自噬機(jī)制識(shí)別后，發(fā)揮免疫作用防御沙門菌的感染，在此過程中，T3SS 效應(yīng)蛋白在沙門菌逃避免疫系統(tǒng)中的具體作用如表1 所示[27]。

表1 T3SS 效應(yīng)蛋白在沙門菌逃避免疫系統(tǒng)中的作用（引自Bernal-Bayard J[29]）

2.2 沙門菌利用自噬機(jī)制增殖感染沙門菌作為兼性胞內(nèi)菌，可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬促進(jìn)自身存活。與自噬作為細(xì)胞天然免疫防御機(jī)制相比，沙門菌可以分泌部分效應(yīng)蛋白，避免自噬過程中SCV 被溶酶體融合，從而在SCV 中持久增殖。如文中提到的鼠傷寒沙門菌，攜帶的毒力質(zhì)粒中含有一段約8 kb 的高度保守區(qū)域[28]，負(fù)責(zé)細(xì)菌的血清抵抗、粘附和定植，沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv 區(qū)域包含了3 個(gè)與毒力相關(guān)的基因：轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子spvR 與兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因spvB 和spvC[29]。其中spvB 決定著沙門菌在巨噬細(xì)胞中的增殖程度，并誘導(dǎo)沙門菌感染期間宿主細(xì)胞的晚期凋亡[30]。SPV 蛋白是ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性所必需的，它作為細(xì)胞內(nèi)毒素，共價(jià)修飾單體肌動(dòng)蛋白，為沙門菌感染營造良好的生長環(huán)境[31-32]。

如圖2 所示（途徑3），自噬體分子標(biāo)記物Atg8/LC3 的增多會(huì)促進(jìn)SCV 膜的修復(fù)，并使SCV 成熟，隨后招募膜裝運(yùn)關(guān)鍵分子Rab5 和Rab7，以確保細(xì)胞成熟和SPI-2 T3SS 的表達(dá)[33]，進(jìn)而產(chǎn)生用于維持SCV 膜完整性的效應(yīng)蛋白絲狀體SifA，促進(jìn)SCV 的成熟，使沙門菌在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制生存[34]。在此期間，SPI-1 T3SS 介導(dǎo)的SCV 損傷使泛素和galectin-8信號(hào)分子釋放，隨即吸收重要的抗菌自噬成分，與此同時(shí)，SPI-2 T3SS 效應(yīng)蛋白SseL 激活后通過降低自噬通量完成細(xì)胞內(nèi)沙門菌的復(fù)制，進(jìn)而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的凋亡。

圖2 自噬作用于沙門菌感染的三大途徑（引自O(shè)wen K A[24]）

3 小結(jié)與展望

沙門菌感染宿主細(xì)胞時(shí)，由沙門菌毒力島SPI-1和SPI-2 編碼的兩種三型分泌系統(tǒng)發(fā)揮功能，其中SPI-1 T3SS 是入侵上皮細(xì)胞和SCV 生物形成早期所必需的，其針狀裝置介導(dǎo)了宿主細(xì)胞的入侵，對(duì)宿主細(xì)胞膜的損傷可以刺激宿主觸發(fā)抗菌自噬反應(yīng)；其次SCV 膜的破裂會(huì)引起膜內(nèi)酸化環(huán)境消失，從而誘導(dǎo)SPI-2 T3SS 的表達(dá)，促進(jìn)沙門菌在自噬體膜泡內(nèi)存活，增殖和擴(kuò)散。

沙門菌感染過程中自噬一方面作為抗菌防御機(jī)制，發(fā)揮免疫作用保護(hù)宿主細(xì)胞，另一方面沙門菌可以利用自噬體作為其增殖場(chǎng)所，達(dá)到加重機(jī)體感染的目的。因此，自噬在沙門菌感染中發(fā)揮著雙重作用，既能清除病原體，防御沙門菌的入侵，又能加劇感染，損傷宿主細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)室在沙門菌毒力基因探究方面取得了部分進(jìn)展，如htrA、sufB、YbjX等基因，利用λ-Red 同源重組系統(tǒng)構(gòu)建了基因缺失突變株，通過與野生型菌株對(duì)比分析其巨噬細(xì)胞內(nèi)存活能力、對(duì)環(huán)境應(yīng)激抵抗力和生物被膜形成能力等生物學(xué)特性，進(jìn)而研究毒力基因?qū)ι抽T菌致病力的影響。但是，在細(xì)胞自噬與沙門菌感染的信號(hào)途徑和作用機(jī)制方面仍需進(jìn)一步研究。無論自噬機(jī)制是通過何種途徑作用于感染的沙門菌，二者都有密不可分的關(guān)系。

相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)[9,11,27,29]，自噬在沙門菌感染早期時(shí)便啟動(dòng)發(fā)揮作用，以抑制沙門菌對(duì)機(jī)體造成進(jìn)一步損害，然而自噬在保護(hù)細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)被沙門菌分泌的效應(yīng)蛋白利用進(jìn)而加重宿主細(xì)胞的感染，使沙門菌得以增殖生存。關(guān)于自噬在沙門菌感染過程中發(fā)揮作用的研究，多數(shù)集中于動(dòng)物模型，而有關(guān)家禽家畜相關(guān)的報(bào)道尚未出現(xiàn)，因此在生產(chǎn)實(shí)踐中有關(guān)利用細(xì)胞自噬防治沙門菌的領(lǐng)域仍待進(jìn)一步深入研究，為沙門菌病的防治提供指導(dǎo)意義，進(jìn)而提高養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，所以利用細(xì)胞自噬防治沙門菌，將會(huì)成為新的研究熱點(diǎn)。