利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(shù)及環(huán)介導等溫擴增技術(shù)在結(jié)核性腦膜炎的診斷價值

冉燕 趙建軍 張建勇 宗兆婧

遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科結(jié)核病區(qū)（貴州遵義563003）

我國是全球30 個結(jié)核病高負擔國家之一，耐藥結(jié)核病患者有增多趨勢［1］，結(jié)核性腦膜炎作為最為嚴重的肺外結(jié)核病，嚴重者可致殘或?qū)е禄颊咚劳觯?-4］，目前臨床上結(jié)核性腦膜炎診斷依賴于臨床癥狀、腦脊液化驗和頭顱影像學檢查，由于結(jié)核菌涂片陽性率低，且陽性可能為非結(jié)核分枝桿菌感染，結(jié)核菌培養(yǎng)周期長，頭顱影像學早期改變無特異性，有時會造成漏診、誤診等［5］，對結(jié)核性腦膜炎的診斷，尤其是早期診斷目前尚缺乏高效、簡便的方法［6］。利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(shù)（GeneXpert MTB/RIF）和環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP）為WHO 認證的可用于結(jié)核病診斷的新方法［7］，GeneXpert MTB/RIF 不但能檢測出有無結(jié)核分枝桿菌，其還可判斷有無利福平耐藥基因突變，2 h 可獲得結(jié)果，LAMP 是在等溫條件下進行DNA 擴增，能快速檢出結(jié)核菌，具有操作簡單、耗時更短（50 min）、價廉等優(yōu)勢，兩種方法均有學者進行研究［8-10］，但目前在結(jié)核性腦膜炎的診斷中未見腦脊液GeneXpert MTB/RIF 和LAMP 兩種實驗室方法比較的相關(guān)報道，現(xiàn)回顧性分析我科110例結(jié)核性腦膜炎患者，探討腦脊液GeneXpert MTB/RIF 及腦脊液LAMP 檢測兩種方法對結(jié)核性腦膜炎的早期診斷價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象2016年12月至2019年12月在我院呼吸與危重癥醫(yī)學科結(jié)核病區(qū)和神經(jīng)內(nèi)科住院患者，納入110 例臨床診斷為結(jié)核性腦膜炎的患者為結(jié)核性腦膜炎組，年齡均≥14 周歲且符合《結(jié)核性腦膜炎臨床診斷專家共識》［11］及《2019 中國中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病診療指南》［12］診斷標準，除外妊娠、糖尿病、HIV 感染及免疫缺陷患者，所有患者無抗結(jié)核化療病史，院外未降顱內(nèi)壓治療。結(jié)核性腦膜炎合并血行播散性肺結(jié)核患者43 例，合并繼發(fā)性肺結(jié)核58 例，單純結(jié)核性腦膜炎患者9 例。110 結(jié)核性腦膜炎患者隨機分為A 組和B 組，其中A 組男43 例，平均年齡（55.41±16.07）歲；女17 例，平均年齡（33.19 ± 15.18）歲，B 組男31 例，平均年齡（40.34 ± 18.14）歲；女19 例，平均年齡（40.94 ±20.74）歲，CG 組20 例（診斷為病毒性腦膜炎、化膿性腦膜炎、隱球菌性腦膜炎）為對照組，診斷標準參考第8 版《神經(jīng)病學》［13］。三組患者入院后行頭顱MRI，簽署知情同意書后A 組行腰椎穿刺術(shù)抽腦脊液共22 mL 分別查腦脊液常規(guī)、生化、結(jié)核菌涂片、結(jié)核菌培養(yǎng)、GeneXpert MTB/RIF，B 組同樣抽腦脊液22 mL 送腦脊液常規(guī)、生化、結(jié)核菌涂片、結(jié)核菌培養(yǎng)、LAMP，CG 組同樣抽腦脊液24 mL送腦脊液常規(guī)、生化、結(jié)核菌涂片、結(jié)核菌培養(yǎng)、GeneXpert MTB/RIF 和LAMP。腦脊液常規(guī)、生化和結(jié)核菌涂片均在我院檢驗科完成，腦脊液結(jié)核菌培養(yǎng)、GeneXpert MTB/RIF 及腦脊液LAMP 在我科呼吸醫(yī)學研究室完成。

1.2 方法

1.2.1 涂片抗酸染色法檢測腦脊液中的抗酸桿菌取腦脊液標本1 mL，抗凝后離心10 min，棄上清，取沉渣均勻涂抹于玻片2/3 處，將玻片置于染色架上，用火焰固定，滴加石碳酸復紅染液，蓋滿玻片，加熱至出現(xiàn)蒸汽后脫離火焰，保持5 min，輕緩沖洗，瀝水，滴加脫色液，保持1 min，再滴加亞甲藍溶液染色30 s，最后水洗干燥后進行鏡檢，用顯微鏡讀片觀察300 個視野后報告結(jié)果。

1.2.2 羅氏培養(yǎng)法檢出腦脊液中的結(jié)核分枝桿菌取腦脊液5 mL，抗凝后離心10 min，棄上清，取沉渣2 ～3 滴接種于2 支培養(yǎng)基斜面上，置37 ℃溫箱培養(yǎng)，分別在第3 天和第7 天各觀察1 次，此后需每周觀察1 次，有菌落生長需經(jīng)抗酸染色確認后報告，至第8 周無菌落生長則報告為陰性。當結(jié)果為陽性時，再采用對硝基苯甲酸鑒定菌落為非結(jié)核分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌。

1.2.3 腦脊液GeneXpert MTB/RIF 檢測方法取腦脊液8 mL，抗凝后離心10 min，棄上清，取沉淀置于前處理管中，加入GeneXpert MTB/RIF 處理液，劇烈搖動10 ～20 次，室溫放置15 min，一次移液管取2 mL 處理后樣品由加樣孔緩慢加入Cartidge 反應(yīng)盒內(nèi)，打開電腦和GeneXpert MTB/RIF 檢測儀，運行GeneXpert MTB/RIF 操作軟件，儀器自檢結(jié)束后開始測試，待測試結(jié)束后讀取結(jié)果。

1.2.4 腦脊液LAMP 檢測方法取腦脊液8 mL，離心后取60 μL 至加熱管，90 ℃加熱5 min，取出吸附管置于吸附架上，勾住吸附管帽環(huán)向上提起打開吸附管，將加熱管底部旋入吸附管頂端，震動充分混勻，將吸附管的注射帽放在蓋子里，倒置吸附管，加反應(yīng)液至兩刻度線之間，將帽環(huán)套住純化裝置尖端，丟棄裝置，取毛細管插緊上端后插入陽性對照，吸取液體至刻度線，將其擠入到LAMP 反應(yīng)管內(nèi)，握緊底端將全部反應(yīng)液體甩到蓋子上，倒置2 min，使干燥的LAMP 試劑與反應(yīng)液充分混合，上下翻轉(zhuǎn)使充分混勻，當反應(yīng)模塊溫度達到67 ℃開始LAMP 反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)管并放入熒光檢測模塊，記錄反應(yīng)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，統(tǒng)計學方法采用χ2檢驗和t檢驗，以P< 0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核性腦膜炎A 組患者和B 組患者腦脊液細胞學檢測結(jié)果比較結(jié)核性腦膜炎A 組和結(jié)核性腦膜炎B 組患者腰椎穿刺術(shù)測腦脊液壓力，送腦脊液常規(guī)及生化檢查，提示僅腦脊液蛋白兩組之間存在統(tǒng)計學差異，而腦脊液壓力、白細胞計數(shù)、氯化物、葡萄糖、ADA、LDH 兩組之間差異均無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 結(jié)核性腦膜炎A 組患者和B 組患者腦脊液細胞學檢測結(jié)果比較Tab.1 Comparison of CSF cytological test results between group A and group B in patients with tuberculous meningitis±s

表1 結(jié)核性腦膜炎A 組患者和B 組患者腦脊液細胞學檢測結(jié)果比較Tab.1 Comparison of CSF cytological test results between group A and group B in patients with tuberculous meningitis±s

組別A 組B 組t 值P 值壓力235.39±95.32 218.48±85.99 0.860 0.394腦脊液蛋白3 205.48±2 125.13 3 187.70±2 217.71 2.356 0.532白細胞計數(shù)591.67±1 472.71 453.00±1 298.64 1.822 0.068氯化物112.18±10.48 116.09±9.89 1.784 0.080葡萄糖1.65±1.63 2.15±1.12 1.582 0.121 ADA 7.97±4.88 6.02±4.92 1.891 0.064 LDH 106.16±76.99 87.75±78.47 1.122 0.267

2.2 結(jié)核性腦膜炎組和CG組腦脊液檢測結(jié)果結(jié)核性腦膜炎A 組60 例患者結(jié)核菌涂片陽性5 例，陽性率8.3%，結(jié)核菌培養(yǎng)10 例，陽性率16.7%，腦脊液GeneXpert MTB/RIF 陽性32 例，陽性率53.0%，利福平耐藥基因檢測陽性3 例。結(jié)核性腦膜炎B組50 例患者結(jié)核菌涂片陽性4 例，陽性率8.0%，結(jié)核菌培養(yǎng)9 例，陽性率18.0%，腦脊液LAMP 陽性29 例，陽性率58.0%。CG 組結(jié)核菌涂片、結(jié)核菌培養(yǎng)和腦脊液GeneXpert MTB/RIF、LAMP 檢測結(jié)果均為陰性。

2.3 結(jié)核性腦膜炎A 組、B 組和CG 組組間結(jié)果比較結(jié)核性腦膜炎A 組和CG 組腦脊液GeneXpert MTB/RIF對比差異有統(tǒng)計學意義（χ2=17.78，P=0.00）；結(jié)核性腦膜炎B 組和CG 組腦脊液LAMP 間差異有統(tǒng)計學意義（χ2=19.81，P=0.00）；結(jié)核性腦膜炎A 組和結(jié)核性腦膜炎B 組腦脊液GeneXpert MTB/RIF 和腦脊液LAMP 陽性率對比差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.24，P=0.62）。

2.4 腦脊液蛋白1 000 mg/L以上和1 000 mg/L以下患者腦脊液GeneXpert MTB/RIF和LAMP結(jié)果腦脊液蛋白1 000 mg/L 以上患者結(jié)核性腦膜炎A 組和B 組分別為40 例和28 例，A 組腦脊液Gen?eXpert MTB/RIF 陽性20 例，陽性率50.0%，B 組腦脊液LAMP 陽性15 例，陽性率53.6%。腦脊液蛋白1 000 mg/L 以下結(jié)核性腦膜炎A 組和B 組分別為20 例和22 例，A 組腦脊液GeneXpert MTB/RIF 陽性12 例，陽性率60.0%，B 組腦脊液LAMP 陽性14 例，陽性率63.6%。

3 討論

結(jié)核性腦膜炎是結(jié)核分枝桿菌感染引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)非化膿性炎性疾病，其發(fā)病率、致殘率和病死率高［14-15］，其預后與早期診斷、早期治療密切相關(guān)［14］，但早期診斷有一定的難度，目前實驗室方法有局限性，無法滿足對結(jié)核性腦膜炎早期、快速診斷的要求，近年來分子生物學技術(shù)開始被關(guān)注［16-18］，本研究探討兩種分子生物學技術(shù)（腦脊液GeneXpert MTB/RIF 和LAMP）在結(jié)核性腦膜炎中的早期診斷價值。

本研究納入110 例結(jié)核性腦膜炎患者，隨機分為結(jié)核性腦膜炎A 組和結(jié)核性腦膜炎B 組，兩組腦脊液細胞學檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義，A 組進行腦脊液結(jié)核菌涂片、結(jié)核菌培養(yǎng)和腦脊液GeneXpert MTB/RIF 檢查，結(jié)果表明腦脊液GeneX?pert MTB/RIF 陽性率遠高于結(jié)核菌涂片、結(jié)核菌培養(yǎng)，腦脊液GeneXpert MTB/RIF結(jié)果提示其中有3例患者腦脊液利福平耐藥基因檢測為陽性，該3 例患者結(jié)核菌培養(yǎng)結(jié)果有2例為陽性，利福平耐藥，表明腦脊液GeneXpert MTB/RIF 不僅能早期判斷有無結(jié)核分枝桿菌感染，同時還能判斷有無利福平耐藥，指導臨床用藥。另1例結(jié)核菌培養(yǎng)為陰性，其原因分析可能是：（1）傳統(tǒng)藥敏結(jié)果受接種技術(shù)、培養(yǎng)基質(zhì)量、孵化時間、藥物耐藥臨界濃度等多種因素影響；（2）不排除該例患者是菌群中同時存在敏感菌和耐藥菌的結(jié)合；（3）送檢的結(jié)核菌培養(yǎng)和腦脊液GeneXpert MTB/RIF 為非同一份標本，結(jié)果可能存在不一致。而腦脊液LAMP 相對于GeneXpert MTB/RIF 檢測需要的時間更短，技術(shù)要求不高，價格相對低廉，故將結(jié)核性腦膜炎B 組進行結(jié)核菌涂片、結(jié)核菌培養(yǎng)，腦脊液LAMP 檢查，同樣腦脊液LAMP 陽性率也遠高于結(jié)核菌涂片、結(jié)核菌培養(yǎng)。本課題腦脊液GeneXpert MTB/RIF 和腦脊液LAMP對結(jié)核性腦膜炎的診斷陽性率均能達到53%和58%，可能和送檢量大（8 mL）有關(guān)，有文獻報道高容量的腦脊液能有效提高診斷陽性率［19-20］。同時還選取20 例臨床診斷為化膿性腦膜炎、病毒性腦膜炎、隱球菌性腦膜炎的患者進行腦脊液GeneX?pert MTB/RIF 及LAMP 檢測，結(jié)果20 例患者腦脊液結(jié)核菌涂片、結(jié)核菌培養(yǎng)、GeneXpert MTB/RIF 及LAMP 全為陰性。以上結(jié)果揭示腦脊液GeneXpert MTB/RIF 和腦脊液LAMP 均是早期診斷結(jié)核性腦膜炎較好的實驗室方法，特異性好，敏感性高，兩種檢測耗時均短（分別耗時2 h 及50 min），優(yōu)于目前常規(guī)檢測手段，可以作為早期診斷結(jié)核性腦膜炎的可靠指標。

結(jié)核性腦膜炎患者在腦膜發(fā)生炎癥的情況下，血腦屏障受損，通透性增高，進入腦脊液的蛋白量升高［21］，故腦脊液蛋白對結(jié)核性腦膜炎的診斷有較大的參考價值，腦脊液蛋白越高提示腦膜損壞越嚴重，結(jié)核菌繁殖越旺盛，有文獻報道腦脊液蛋白含量升高的程度為影響結(jié)核性腦膜炎早期診斷的獨立因素［22］。大多數(shù)結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液蛋白在1 000 mg/L 以上，本研究分析未抗結(jié)核化療前腦脊液蛋白在1 000 mg/L 以上和1 000 mg/L以下患者的腦脊液GeneXpert MTB/RIF 和腦脊液LAMP 的陽性率，實驗結(jié)果提示即使在腦脊液蛋白1 000 mg/L 以下，腦脊液GeneXpert MTB/RIF 和腦脊液LAMP 的陽性率仍可達到60.0%和63.6%，遠高于腦脊液結(jié)核菌涂片和結(jié)核菌培養(yǎng)，提示在腦脊液表現(xiàn)不典型的情況下腦脊液GeneXpert MTB/RIF 和腦脊液LAMP 對臨床結(jié)核性腦膜炎的早期確診提供了實驗室診斷依據(jù)。

綜上所述，腦脊液GeneXpert MTB/RIF 和腦脊液LAMP 兩種技術(shù)對結(jié)核性腦膜炎的診斷陽性率高，且耗時短，能早期獲得結(jié)果，對結(jié)核性腦膜炎的診斷有重要價值，但兩者各有優(yōu)勢，故建議在經(jīng)濟比較發(fā)達地區(qū)，可選擇腦脊液GeneXpert MTB/RIF 或LAMP 檢測有效提高診斷陽性率，但在基層醫(yī)院或經(jīng)濟貧困地方可先行腦脊液LAMP，若臨床高度懷疑耐藥的患者仍可選擇腦脊液GeneXpert MTB/RIF。本研究標本數(shù)量偏少，接下來擬擴大標本量進一步對同一份標本進行腦脊液GeneXpert MTB/RIF 和腦脊液LAMP 檢查，希望能更進一步提高結(jié)核性腦膜炎早期診斷率，早期指導治療和改善患者預后。