超聲、細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)及BRAFV600E基因?qū)谞钕俳Y(jié)節(jié)的診斷價(jià)值

趙媛 趙永剛 張春芳 陳昊 張智弘

1南京醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院連云港市第一人民醫(yī)院（江蘇連云港222002）；2南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（南京210029）

甲狀腺結(jié)節(jié)是甲狀腺最常見的疾病之一，在人群中的發(fā)生率為20% ～76%，其中惡性結(jié)節(jié)占5%～15%［1-2］；甄別甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性及其生物學(xué)行為，進(jìn)而做出正確的臨床決策是臨床的首要任務(wù)和當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。

超聲（ultrasound，US）在甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別診斷中具有不可替代的優(yōu)勢，是首選檢查方法。以此為基石，超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)（fine?needle aspiration cytology，F(xiàn)NAC）是術(shù)前診斷甲狀腺結(jié)節(jié)良、惡性的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其使用Bethesda 報(bào)告甲狀腺細(xì)胞病變系統(tǒng)，該報(bào)告系統(tǒng)分級(jí)明確，有助于改善患者管理，亦存在一定局限性，其中19.7% ～30%無法明確診斷［3-5］。2015年美國甲狀腺協(xié)會(huì)（ATA）指南建議使用分子標(biāo)志物來進(jìn)一步診斷和管理不確定結(jié)節(jié)。近年來，分子標(biāo)志物大量應(yīng)用到術(shù)前FNAC 檢測中，BRAFV600E是當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一，大約40% ～83%的PTC 存在BRAFV600E突變，其診斷PTC 的陽性預(yù)測值接近100%，稱其是PTC 的特異性標(biāo)記物［6］。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集2015年1月至2018年12月在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)US 檢查同時(shí)行FNAC、BRAFV600E基因突變檢測并且有術(shù)后病理的512 例甲狀腺結(jié)節(jié)病例資料，包括61 例良性病變和451 例甲狀腺惡性腫瘤，入選病例中男122 例，女390 例，年齡17 ～77 歲，平均（43.4±12.4）歲，結(jié)節(jié)最大直徑3 ～73 mm，平均（13.3±9.4）mm。

1.2 方法

1.2.1 超聲檢查常規(guī)描述甲狀腺影像和報(bào)告系統(tǒng)（the thyroid imaging reporting and data system，TIRADS）分類中的五個(gè)方面：結(jié)構(gòu)、回聲水平、形態(tài)、邊緣和鈣化，同時(shí)描述結(jié)節(jié)位置、大小、數(shù)量、血供情況、與周圍被膜組織的關(guān)系，以及評(píng)估頸部淋巴結(jié)情況，根據(jù)TIRADS 分類將結(jié)節(jié)分為6 類。

1.2.2 細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查超聲探查目標(biāo)結(jié)節(jié)，確定穿刺路徑；局部0.5%碘伏消毒，戴無菌手套，左手固定結(jié)節(jié)，右手在超聲引導(dǎo)下將帶5 mL針筒的25G 穿刺針沿預(yù)定路線刺入結(jié)節(jié)內(nèi)，反復(fù)抽吸3 次左右，將注射器內(nèi)穿刺物打入BD 公司一次性保存液中并反復(fù)抽吸幾次，送至病理科，使用BD 公司沉降式液基細(xì)胞自動(dòng)制片設(shè)備進(jìn)行制片和巴氏染色，后透明、封片和鏡檢。

1.2.3 BRAFV600E基因突變檢測取材方法同細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)，將注射器內(nèi)穿刺物打入BD 公司一次性保存液中，送至病理科分子室后轉(zhuǎn)移到裝有裂解液的EP 管中，采用擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)多聚酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增法檢測BRAFV600E基因突變結(jié)果。

1.3 結(jié)果判讀

1.3.1 超聲結(jié)果判讀術(shù)前超聲評(píng)估甲狀腺結(jié)節(jié)均按照KWAK 等［7］提出的甲狀腺影像和報(bào)告系統(tǒng)分為6類。TIRADS 1類：正常甲狀腺；TIRADS 2類：良性甲狀腺結(jié)節(jié)；TIRADS 3 類：可能良性甲狀腺結(jié)節(jié)；TIRADS 4A 類：低度可疑惡性結(jié)節(jié)；TIRADS 4B類：中度可疑惡性結(jié)節(jié)；TIRADS 4C 類：高度可疑惡性結(jié)節(jié)；TIRADS 5 類：典型惡性征象；TIRADS 6類：已行活檢并有惡性病理診斷。

1.3.2 細(xì)胞學(xué)結(jié)果判讀細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)按照2007年美國國家癌癥協(xié)會(huì)制定的Bethesda 報(bào)告甲狀腺細(xì)胞病變系統(tǒng)進(jìn)行報(bào)告，將診斷結(jié)果分為6 類：Ⅰ類：標(biāo)本無法診斷或不滿意；Ⅱ類：良性病變；Ⅲ類：意義不明確的細(xì)胞非典型病變/濾泡性病變；Ⅳ類：濾泡性腫瘤/可疑濾泡性腫瘤；Ⅴ類：可疑惡性腫瘤；Ⅵ類：惡性腫瘤。

1.3.3 BRAFV600E 基因突變結(jié)果判讀若樣本的FAM 信號(hào)Ct 值≥28，則樣本為陰性（BRAFV600E野生型）；若樣本的FAM 信號(hào)Ct 值< 28，則樣本為陽性（BRAFV600E突變型）。

1.3.4 聯(lián)合診斷結(jié)果判讀聯(lián)合診斷時(shí)，幾種方法均診斷為良性，則判定為良性；若診斷不一致，則其中一種診斷為惡性，即判定為惡性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以術(shù)后病理為金標(biāo)準(zhǔn)，構(gòu)建US、FNAC、BRAFV600E及不同聯(lián)合診斷方法的ROC 曲線，聯(lián)合診斷使用二元Logistic 回歸分析計(jì)算聯(lián)合預(yù)測因子；通過ROC 曲線確定US 和FNAC 的最佳截?cái)帱c(diǎn)并計(jì)算AUC，比較不同方法的診斷效能；計(jì)數(shù)資料組間比較采用行×列卡方檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05 時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后切除512 例甲狀腺結(jié)節(jié)US、FNAC 及BRAFV600E突變測定結(jié)果512 例結(jié)節(jié)的US 診斷結(jié)果（表1）：TIRADS 3 類結(jié)節(jié)23 個(gè)，其中惡性2 例；TIRADS 4A 類結(jié)節(jié)100 個(gè)，其中惡性72 例；TIRADS 4B類結(jié)節(jié)146個(gè)，其中惡性136例；TIRADS 4C類結(jié)節(jié)171個(gè)，其中惡性169例；TIRADS 5類結(jié)節(jié)72個(gè)，均為惡性；FNAC 診斷結(jié)果（表2）：Bethesda Ⅰ類結(jié)節(jié)27 個(gè)，其中4 例術(shù)后被診斷為PTC；BethesdaⅡ類結(jié)節(jié)25 個(gè)，其中1 例被診斷為PTC；BethesdaⅢ類結(jié)節(jié)42 個(gè)，其中29 例被診斷為PTC，1 例為濾泡癌（follicular thyroid carcinoma，F(xiàn)TC），1 例為髓樣癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）；Bethesda Ⅳ類結(jié)節(jié)6 個(gè)，其中4 例被診斷為FTC；Bethesda Ⅴ類結(jié)節(jié)133 個(gè)，其中惡性132 例，包括126 例PTC，2 例淋巴瘤，1 例FTC，1 例MTC，1 例未分化癌，1 例嗜酸細(xì)胞癌；Bethesda Ⅵ類結(jié)節(jié)279 個(gè)，均被診斷為PTC；BRAFV600E診斷結(jié)果（表3）：BRAFV600E野生型78 例，其中惡性19 例，包括8 例PTC，5 例FTC，2 例MTC，2 例淋巴瘤，1 例未分化癌，1 例嗜酸細(xì)胞癌；BRAFV600E突變型434 例，其中被診斷為PTC 431 例，F(xiàn)TC 1 例。

2.2 比較US、FNAC 及BRAFV600E突變檢測及不同方法聯(lián)合的診斷效能構(gòu)建三種診斷方法及不同聯(lián)合診斷方法的ROC 曲線（圖1），ROC 曲線表明US 的最佳診斷截?cái)帱c(diǎn)是4B，即TIRADS 1?4A 類為良性，TIRADS 4B?6 類為惡性；FNAC 的最佳診斷截?cái)帱c(diǎn)是Ⅴ，即BethesdaⅠ?Ⅳ類為良性，BethesdaⅤ?Ⅵ類為惡性；以術(shù)后病理為標(biāo)準(zhǔn)，US 診斷甲狀腺惡性腫瘤的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和AUC 分別為83.59%、80.33%、96.92%、39.84%和0.888；FNAC 診斷對(duì)應(yīng)的指標(biāo)分別為91.13%、98.36%、99.76%、60.00%和0.980；BRAFV600E基因檢測為95.79%、96.72%、99.54%、75.64%和0.963；US+FNAC 診斷為94.46%、80.33%、97.26%、66.22% 和0.986；FNAC+BRAFV600E基因檢測為98.45%、96.72%、99.55%、89.39%和0.995；三種診斷方法聯(lián)合的指標(biāo)分別為98.89%、78.69%、97.17%、90.57%和0.993（表4）。

表1 TIRADS 分類結(jié)果與術(shù)后結(jié)果比較Tab.1 Comparison of TIRADS classification results with postoperative results 例

表2 Bethesda 報(bào)告結(jié)果與術(shù)后結(jié)果比較Tab.2 Comparison between the results reported by Bethesda and postoperative results例

表3 BRAFV600E檢測結(jié)果與術(shù)后結(jié)果比較Tab.3 Comparison of BRAFV600E detection results and postoperative results 例

圖1 US、FNAC、BRAFV600E及不同聯(lián)合診斷方法的ROC曲線Fig.1 ROC curves of US，F(xiàn)NAC，BRAFV600E and differentcombined diagnostic methods

表4 US、FNAC、BRAFV600E及不同聯(lián)合診斷方法的診斷效能Tab.4 Diagnostic efficacy of US，F(xiàn)NAC，BRAFV600E and different combined diagnostic methods

2.3 FNAC、BRAFV600E 突變檢測與術(shù)后病理結(jié)果比較BethesdaⅠ?Ⅳ類共100 例，其中BRAFV600E突變率35%（35/100），BethesdaⅠ?Ⅳ類惡性率為40%；BethesdaⅤ?Ⅵ類共412 例，其中BRAFV600E突變率96.84%（399/412），BethesdaⅤ?Ⅵ類惡性率為99.76%；512 例標(biāo)本中BRAFV600E 基因突變型434 例，占84.77%；野生型78 例，占15.23%（表5）。

2.4 US、FNAC、BRAFV600E與FNAC聯(lián)合BRAFV600E突變檢測診斷率的比較US 診斷陽性病例389例，陰性病例123 例；FNAC 診斷陽性病例412 例，陰性病例100 例；BRAFV600E診斷陽性病例434 例，陰性病例78 例；FNAC 聯(lián)合BRAFV600E診斷陽性病例446 例，陰性病例66 例；FNAC 聯(lián)合BRAFV600E診斷優(yōu)于單獨(dú)US，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩者聯(lián)合診斷亦優(yōu)于單獨(dú)FNAC（表6）。

表5 FNAC、BRAFV600E與手術(shù)病理結(jié)果比較Tab.5 Comparison of FNAC，BRAFV600E and surgical pathological results 例

表6 US、FNAC、BRAFV600E 與兩者聯(lián)合診斷的比較Tab.6 Comparison of US，F(xiàn)NAC，BRAFV600E and their combined diagnoses 例

3 討論

CHEN 等［8］進(jìn)行流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示2000年至2011年我國甲狀腺癌的發(fā)病率由4.9%上升到20.1%，是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。術(shù)前鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的方法有很多，超聲是最便捷、最經(jīng)濟(jì)的方法，KWAK 等［7］提出五個(gè)惡性特征對(duì)其進(jìn)行分類，盡管這些特征具有較高的特異性，但敏感性相對(duì)較低；FNAC 是在超聲引導(dǎo)下通過細(xì)針對(duì)結(jié)節(jié)進(jìn)行穿刺診斷的方法，具有創(chuàng)傷小、效率及準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)［9］，但其中約10% ～40%的結(jié)節(jié)受大小、位置、穿刺及病理醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)水平等影響而不能明確診斷［10］；BRAFV600E作為PTC 的特異性標(biāo)記物，F(xiàn)NAC 基礎(chǔ)上進(jìn)一步檢測BRAFV600E可確診部分無法明確性質(zhì)的結(jié)節(jié)［11-12］。本文以術(shù)后病理為標(biāo)準(zhǔn)，比較US、FNAC、BRAFV600E及聯(lián)合診斷對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)的診斷價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示US 診斷甲狀腺惡性腫瘤的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為83.59%、80.33%、96.92%、39.84%，與MISTRY 等［13］研究相比，其陽性預(yù)測值偏高而陰性預(yù)測值偏低，顯示出影像科醫(yī)生對(duì)于惡性特征把握太緊，判斷相對(duì)保守；FNAC 診斷甲狀腺惡性腫瘤的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為91.13%、98.36%、99.76%和60.00%，陰性預(yù)測值明顯偏低，原因?yàn)锽ethesda Ⅲ和Ⅳ類惡性率明顯偏高；WU 等［14］根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)將Bethesda Ⅲ類分為四個(gè)亞組：AUS 未指定、AUS 不能排除濾泡性腫瘤、AUS 不能排除Hurthle 細(xì)胞腫瘤和AUS 不能排除PTC，這四個(gè)亞型的惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)分別為44%、81%、53%及63%。本文Bethesda Ⅲ類惡性率高的主要原因是細(xì)胞診斷醫(yī)生使用較多“AUS 不能排除PTC”的診斷術(shù)語；Bethesda Ⅳ類惡性率高是細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)的局限性造成的，濾泡性腫瘤與濾泡性癌的鑒別要點(diǎn)在于是否存在包膜或血管的侵犯，僅僅細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)很難對(duì)這兩類腫瘤進(jìn)行鑒別診斷［15］；本研究經(jīng)術(shù)后證實(shí)PTC 共439 例，其中431 例發(fā)生BRAFV600E突變；其他類型惡性腫瘤共12例，僅有1例FTC 發(fā)生BRAFV600E突變；上述結(jié)果顯示BRAFV600E檢測對(duì)PTC 的診斷意義較大，對(duì)其他類型惡性腫瘤幫助不大，由于甲狀腺惡性腫瘤中約99%為PTC［16］，因此BRAFV600E對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)仍然具有很高的診斷價(jià)值。

通過繪制ROC 曲線，顯示FNAC 聯(lián)合BRAFV600E的AUC 最大，診斷效能最高，敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為98.45%、96.72%、99.55%、89.39%。BEI?A 等［17-20］報(bào)道FNAC 聯(lián)合BRAFV600E基因檢測可改良單獨(dú)FNAC 的診斷效能。本研究中BethesdaⅠ類發(fā)生率為5.27%，其中BRAFV600E突變率為18.52%，惡性率為14.81%；Bethesda Ⅲ類發(fā)生率為8.20%，其中BRAFV600E突變率為69.05%，惡性率為73.81%；由此可以看出，BRAFV600E檢測可以明確診斷FNAC 中性質(zhì)不確定的大部分結(jié)節(jié)，從而減少不必要的外科手術(shù)［21-22］；術(shù)后病理診斷為其他類型惡性腫瘤12 例，其中BRAFV600E突變僅1 例，而FNAC 診斷Bethesda Ⅴ類5 例，Bethesda Ⅳ類4 例，Bethesda Ⅲ類2 例，并且給出了傾向性腫瘤類型，可見FNAC 可以降低BRAFV600E的假陰性率，兩者相互補(bǔ)充，顯著提高了診斷性能。

綜上所述，US 對(duì)甲狀腺惡性腫瘤有良好的預(yù)測作用，可以篩選出高危甲狀腺結(jié)節(jié)，進(jìn)而進(jìn)一步行細(xì)針穿刺和基因診斷。FNAC 聯(lián)合BRAFV600E可提高術(shù)前甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)的診斷。本研究亦存在局限性，總樣本中良性標(biāo)本比例偏低，可能存在一定的選擇偏倚，期待后期擴(kuò)充樣本量進(jìn)行深入研究探討甲狀腺結(jié)節(jié)術(shù)前最佳診斷方法，為患者管理和臨床決策提供更科學(xué)的依據(jù)。