體外模擬消化對(duì)大米谷蛋白結(jié)構(gòu)及水解產(chǎn)物生物活性的影響

石嘉懌，張 太，梁富強(qiáng)

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210046）

大米蛋白具有較為合理的氨基酸組成成分，與世界衛(wèi)生組織/聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織推薦的蛋白質(zhì)氨基酸組成比例的最佳模式較為接近，容易被人體消化吸收。與其他谷物（如小麥、玉米、大麥、小米和高粱等）蛋白相比，大米蛋白具有低過(guò)敏性、更高的蛋白質(zhì)消化率以及更高的生物價(jià)值。谷蛋白是一種剛性的球狀結(jié)構(gòu)蛋白，亞基間通過(guò)分子內(nèi)、分子間二硫鍵及疏水相互作用形成分子質(zhì)量64～500 kDa的致密大分子聚集體，但因其富含二硫鍵，通常以大分子聚合體形式存在，且不溶于水，在一定程度上限制了谷蛋白在食品領(lǐng)域的應(yīng)用[1]。蛋白通過(guò)酶的水解可以提高溶解性等功能性質(zhì)，且越來(lái)越多的研究表明水解產(chǎn)物中小分子物質(zhì)（＜3 kDa）具有許多有益健康的功能[2-3]。

氧化應(yīng)激與相關(guān)的氧化損傷是導(dǎo)致血管損傷的主要因素，其與高血壓的發(fā)病機(jī)制具有較大關(guān)系，因此有必要分析大米谷蛋白在人體消化道內(nèi)抗氧化和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）抑制之間的變化與聯(lián)系。研究表明大米多肽可以減弱活性氧誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)[4]。Zhang Junhui等[5]使用不同的蛋白酶水解大米蛋白后，得到強(qiáng)抗氧化活性的水解產(chǎn)物。Li Guanhong等[6]使用堿性蛋白酶水解大米蛋白，體外ACE抑制活性產(chǎn)物顯著增加。傳統(tǒng)上對(duì)于蛋白生物活性的評(píng)價(jià)方法集中于使用商業(yè)酶水解蛋白，篩選小分子質(zhì)量（200～500 Da）多肽。這樣的評(píng)價(jià)方式卻忽略了人體正常消化和吸收系統(tǒng)的重要性，或者已認(rèn)定通過(guò)該方式水解產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)進(jìn)入胃腸道仍舊能保持正常的生物活性。體外制備的活性物質(zhì)在體內(nèi)經(jīng)過(guò)胃中的低酸環(huán)境、胃酶、胰酶和其他肽酶等作用，會(huì)發(fā)生降解而失活的情況[7]。Liu Dandan等[8]基于體外模擬消化的方式，發(fā)現(xiàn)核桃蛋白水解物的ACE抑制能力和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除活性要優(yōu)于核桃多肽。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明體外ACE抑制活性與體內(nèi)實(shí)際的降血壓效應(yīng)并不總是呈正相關(guān)[9]。說(shuō)明體內(nèi)胃腸道的消化作用會(huì)對(duì)蛋白水解物生物活性產(chǎn)生額外的影響。人體的消化系統(tǒng)是一種天然的酶水解系統(tǒng)，胃蛋白酶和胰蛋白酶兩步消化比商業(yè)水解酶更契合人體正常的消化情況，體外模擬消化得到的水解物的生物活性具有更好的耐受性[10]。

大米蛋白通過(guò)體外模擬消化后，能產(chǎn)生具有生物活性的物質(zhì)，但是對(duì)于消化過(guò)程中水解產(chǎn)物生物活性的變化規(guī)律有待進(jìn)一步的研究。因此本實(shí)驗(yàn)中以大米谷蛋白為研究對(duì)象，通過(guò)體外模擬胃腸消化，比較了不同消化時(shí)間下胰蛋白酶對(duì)大米谷蛋白內(nèi)源熒光和二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化情況，及水解產(chǎn)物DPPH自由基清除率、·OH清除能力、Fe2+螯合能力、ACE抑制率的變化和水解物分子質(zhì)量分布，以探索大米谷蛋白在人體消化過(guò)程中抗氧化和ACE抑制能力的變化規(guī)律及其構(gòu)效關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粳稻‘南粳3818’ 中央儲(chǔ)備糧南京直屬庫(kù)有限公司。

胃蛋白酶（250 U/mg）、胰酶、ACE、N-[3-(2-呋喃基)丙烯?；鵠-Phe-雙甘氨酸（N-[3-(2-furyl)acryloyl]-Phe-Gly-Gly，F(xiàn)APGG） 美國(guó)Sigma公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；水溶性V E（Trolox）、卡托普利（Captopril） 上海阿拉丁公司；乙腈、甲酸（色譜級(jí)） 德國(guó)默克公司。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；PHS-25 pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；Coulter J6高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司；SHA-C水浴振蕩器 常州國(guó)華電器有限公司；Amicon Stirred Cell超濾裝置美國(guó)Millipore公司；F-7000熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；TENSOR 27傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）儀 德國(guó)Bruker公司；WH-2微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；Spectra-Max M2e酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（quadrupole time-of-flight mass spectrometry，Q-TOF-MS）系統(tǒng) 美國(guó)AB Sciex公司。

1.3 方法

1.3.1 大米谷蛋白的制備

參考文獻(xiàn)[11]的方法提取大米谷蛋白（圖1）。大米粉碎后過(guò)80 目篩，米粉按照1∶4（m/V）加入正己烷，室溫下攪拌24 h，隨后靜置棄去上清液，沉淀移至通風(fēng)廚中12 h。重復(fù)步驟一次得到脫脂米粉。脫脂米粉按照1∶8（m/V）比例加入超純水，室溫?cái)嚢? h，4 ℃下8 000 r/min離心15 min，保留沉淀而去除大米中清蛋白。按照同樣的方法，將沉淀分散于質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaCl溶液除去球蛋白、體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液除去醇溶蛋白，以上每個(gè)提取步驟重復(fù)3 次。最終加入0.05 mol/L NaOH溶液提取谷蛋白，離心后使用1 mol/L HCl溶液將上清液pH值調(diào)節(jié)至谷蛋白等電點(diǎn)4.8，靜置2 h后離心得到沉淀蛋白。隨之把沉淀均勻分散在適量水中，將pH值調(diào)節(jié)至中性，再次離心后將沉淀凍干，得到大米谷蛋白并于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 大米谷蛋白提取以及體外消化流程Fig.1 Flow chart of the extraction and in vitro digestion of rice glutelin

1.3.2 大米谷蛋白含量的測(cè)定

參考GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的方法，采用凱氏定氮法測(cè)定所提取谷蛋白的含量，谷蛋白轉(zhuǎn)換系數(shù)為5.95。

1.3.3 大米谷蛋白體外模擬胃腸消化

大米谷蛋白體外模擬胃腸消化參考文獻(xiàn)[12]的方法，使用胃蛋白酶、胰蛋白酶兩步法。首先將谷蛋白按照1∶20（m/V）的比例溶解于pH 2.0的胃液中，隨后將質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的胃蛋白酶溶解于適量的胃液中，37 ℃中保溫10 min后加入谷蛋白胃液中，37 ℃恒溫水浴振蕩器避光水解2 h，分別再消化15、30、60、90、120 min取樣。隨后用1 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH 8.5，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的胰蛋白酶，37 ℃恒溫條件下消化水解5 h，消化期間補(bǔ)加適量1 mol/L NaOH溶液來(lái)維持腸溶液pH值穩(wěn)定，分別再消化0.5、1、2、3、4、5 h取樣。每次取樣于100 ℃水中，滅酶10 min終止反應(yīng)。待充分冷卻后，4 ℃下8 000 r/min離心25 min。不同消化時(shí)間上清液一部分直接用于測(cè)水解度，另一部分使用截留分子質(zhì)量3 kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，對(duì)小于3 kDa的濾液脫鹽處理后，冷凍干燥－20 ℃保存?zhèn)溆?。不同消化時(shí)間的沉淀凍干后－20 ℃保存。

1.3.4 水解度的測(cè)定

采用鄰苯二甲醛（ortho-phthalaldehyde，OPA）法測(cè)定谷蛋白不同消化時(shí)間的水解度。水解物以1∶20（V/V）比例與OPA試劑（100 mmol/L四硼酸鈉、0.01%十二烷基硫酸鈉、0.05 mg/mL OPA和0.05 mg/mL二硫蘇糖醇）混合。取200 μL加入96 孔板中振蕩3 s，37 ℃避光反應(yīng)2 min，在340 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

不同濃度的絲氨酸（0.005、0.004、0.002 5、0.001、0.000 5 mmol/mL）用來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白質(zhì)水解度（degree of hydrolysis，DH）按式（1）計(jì)算[13]。

式中：hs為樣品中游離胺基的含量/（mmol/g）；htotal為樣品中游離氨基的含量/（mmol/g）。假設(shè)谷蛋白質(zhì)完全水解時(shí)htotal為7.96 mmol/g。所有樣品測(cè)定3 次。

1.3.5 大米谷蛋白不同消化時(shí)間下分子結(jié)構(gòu)變化測(cè)定

1.3.5.1 內(nèi)源熒光光譜測(cè)定

將大米谷蛋白樣品3 7 ℃下溶解于0.0 1 m o l/L pH 8.0的磷酸鹽緩沖液中，使得谷蛋白溶液終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。在激發(fā)波長(zhǎng)280 nm條件下，采集300～500 nm之間的發(fā)射波長(zhǎng)，狹縫寬度2.5 nm、速率100 nm/s，以磷酸鹽緩沖液為空白。

1.3.5.2 FTIR分析

稱取1～2 mg大米谷蛋白粉末與適量KBr混合，混合物充分研磨均勻后，使用壓片機(jī)壓制成透明薄片，隨后在干燥室溫環(huán)境采集FTIR圖譜。采集條件為分辨率4 cm－1，掃描范圍400～4 000 cm－1，樣品掃描次數(shù)為32 次。利用Peakfit 4.12軟件對(duì)譜圖中1 700～1 600 cm－1酰胺I區(qū)分峰處理。

1.3.6 不同消化時(shí)間谷蛋白多肽抗氧化性測(cè)定

1.3.6.1 ·OH清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[14]，對(duì)不同消化時(shí)間水解物釆用水楊酸法測(cè)定，將樣品配制成不同質(zhì)量濃度梯度（10、5、2、1、0.5、0.25 mg/mL），取0.1 mL樣品加入9.1 mmol/L水楊酸溶液和9.1 mmol/L FeSO4各0.1 mL，最后加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng)。漩渦混勻后取200 μL加入96 孔板，37 ℃下反應(yīng)30 min，測(cè)510 nm波長(zhǎng)處的吸光度。按式（2）計(jì)算·OH清除率。

式中：A0為空白組吸光度，超純水做樣品；A1為樣品反應(yīng)后的吸光度。

1.3.6.2 金屬離子螯合能力的測(cè)定

取0.45 mL（2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL）的樣品加入45 μL 2 mmol/L FeCl2溶液和1 815 μL去離子水混合均勻，然后加入90 μL 5 mmol/L菲啰嗪溶液，劇烈振蕩均勻，室溫下靜置10 min，在562 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A1，以等體積去離子水取代樣品作為對(duì)照，所測(cè)吸光度為A0。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。螯合率按式（3）計(jì)算。

式中：A0為空白對(duì)照組吸光度；A1為樣品反應(yīng)后的吸光度。

1.3.6.3 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[15]的方法，將不同消化時(shí)間下樣品稀釋成不同質(zhì)量濃度梯度（3、1.5、1、0.25、0.1、0.05 mg/mL），取0.1 mmol/L的DPPH溶液和樣品各100 μL加入96 孔板中，室溫避光30 min后測(cè)定517 nm波長(zhǎng)處吸光度，記為Ai；取樣品和無(wú)水乙醇各100 μL加入96 孔板中，30 min后測(cè)定吸光度，記為Aj；取0.1 mmol/L的DPPH溶液和無(wú)水乙醇各100 μL混勻，30 min后測(cè)定吸光度，記為A0，以此作為空白對(duì)照。DPPH自由基清除率按式（4）計(jì)算。

1.3.7 不同消化時(shí)間谷蛋白ACE抑制率測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[16]的方法并稍作改動(dòng)。將每個(gè)樣品分別配制成2、1、0.5、0.25、0.1、0.05 mg/mL質(zhì)量濃度。取樣品溶液40 μL，ACE溶液10 μL（1 U ACE溶解于10 mL pH 8.2的80 mmol/L HEPES緩沖液），1.0 mmol/L FAPGG底物50 μL加入96 孔板并充分混勻，37 ℃預(yù)熱5 min后，在340 nm波長(zhǎng)處測(cè)定30 min內(nèi)吸光度的變化率，40 μL的HEPES緩沖液代替樣品作對(duì)照組。根據(jù)式（5）計(jì)算ACE抑制率。

式中：ΔA樣品和ΔA空白分別表示樣品組和空白組每分鐘吸光度的變化率。

1.3.8 抗氧化和ACE抑制活性肽分析

將不同消化時(shí)間組分用50%乙腈溶解，使得最終濃度為50 mg/L，后采用Q-TOF-MS（配有PDA和TOF檢測(cè)器）對(duì)分子質(zhì)量小于3 kDa的組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。液相色譜條件：C18色譜柱（12 cm×150 μm，1.9 μm）；流動(dòng)相A：100%超純水；流動(dòng)相B：100%乙腈-0.1%甲酸；梯度洗脫方式：流動(dòng)相B體積分?jǐn)?shù)為5%～95%；洗脫時(shí)間：2 0 m i n；進(jìn)樣體積：1 0 μ L；流速：0.5 mL/min。質(zhì)譜條件：正離子模式；噴霧電壓2 000 V；全掃描模式，掃描范圍m/z300～1 000；二級(jí)質(zhì)譜掃描方式：直線掃描。肽段匹配數(shù)據(jù)庫(kù)選用uniprot-Glutelin。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS Statistics軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組平均值進(jìn)行相關(guān)性分析、方差齊性檢驗(yàn)、單因素方差分析和Duncan多重比較分析，以P＜0.05表示差異顯著。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷蛋白體外模擬消化產(chǎn)物的DH變化

圖2 體外模擬胃（a）和腸（b）在不同消化時(shí)間大米谷蛋白DH變化Fig.2 Change in DH of glutelin during in vitro simulated gastric (a)and intestinal (b) digestion

用凱氏定氮法測(cè)定得出該谷蛋白純度為88.5%。圖2a顯示，經(jīng)過(guò)2 h的胃蛋白酶水解后，最終的水解率為8.70%。研究認(rèn)為蛋白經(jīng)過(guò)胃蛋白的初步水解，產(chǎn)物一般是分子質(zhì)量較大的多肽[17]。小腸作為人體的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收部位，其中胰蛋白酶發(fā)揮了重要作用，因此本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究了胰蛋白酶的水解對(duì)于谷蛋白和水解產(chǎn)物的活性變化。胰蛋白酶作為內(nèi)肽酶，可以沿其底物的一級(jí)結(jié)構(gòu)在氨基酸鏈的中間切割肽鍵。因此胰酶的加入能大幅度提高谷蛋白DH，并產(chǎn)生大量的小分子活性肽。如圖2b所示，加入胰蛋白酶0～2 h谷蛋白DH顯著增加（P＜0.05），在接下來(lái)3～5 h DH增加趨于平緩?？赡苡捎谝鹊鞍酌缚汕懈畹馁嚢彼岷途彼釟埢腃-末端肽段數(shù)目不斷減少，酶在反應(yīng)體系中的活性逐漸降低以及底物和水解產(chǎn)物之間的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用[18]。最終谷蛋白在胰蛋白酶水解5 h后DH達(dá)到35.43%。

2.2 胰蛋白酶消化過(guò)程中谷蛋白熒光光譜分析結(jié)果

蛋白質(zhì)中可產(chǎn)生熒光的分子多處于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的芳香族氨基酸，被多種非極性氨基酸殘基包圍，通過(guò)測(cè)量谷蛋白中色氨酸（Trp）殘基可以在348 nm波長(zhǎng)處產(chǎn)生熒光強(qiáng)度變化，可以反映谷蛋白在消化過(guò)程中自身三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[19]。結(jié)果如圖3所示，胰蛋白酶不同消化時(shí)間下，谷蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度不斷升高，最大吸收波長(zhǎng)變大，最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)（λmax）發(fā)生紅移。Avramenko[20]和Zhao Guanli[21]等在扁豆、花生蛋白水解過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。胰蛋白酶5 h的水解過(guò)程中，蛋白質(zhì)熒光發(fā)射峰的λmax產(chǎn)生紅移。λmax紅移反映了水解過(guò)程中谷蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，芳香族氨基酸分子的側(cè)鏈基團(tuán)環(huán)境極性逐漸增加。在胰蛋白酶的消化過(guò)程中，熒光強(qiáng)度在0.5～1 h之間快速增加。表明包埋于蛋白中色氨酸殘基暴露于水的程度增加，這個(gè)階段谷蛋白大分子結(jié)構(gòu)迅速展開(kāi)，同時(shí)展現(xiàn)更多的胰蛋白酶結(jié)合位點(diǎn)，所以此階段中的DH迅速增加[22]。而經(jīng)過(guò)2～3 h的消化后熒光強(qiáng)度下降，這表明暴露于水的色氨酸殘基減少。這可以歸因于谷蛋白在經(jīng)過(guò)胰蛋白酶的高度水解生產(chǎn)肽段時(shí)，谷蛋白分子內(nèi)部的疏水相互作用和二硫鍵作用，形成的蛋白大分子聚集體埋沒(méi)了部分產(chǎn)生熒光的基團(tuán)，蛋白分子相互作用導(dǎo)致熒光猝滅[23]，谷蛋白結(jié)構(gòu)的聚合所以此階段的DH趨于平穩(wěn)。λmax在4～5 h相比較2～3 h產(chǎn)生了較大的紅移，證明4～5 h的水解過(guò)程使得谷蛋白的疏水性結(jié)構(gòu)得到大幅度的舒展，使得芳香族氨基酸分子的側(cè)鏈基團(tuán)更多地暴露于溶液中，因此導(dǎo)致在該階段熒光強(qiáng)度驟增。

圖3 體外模擬消化過(guò)程中不同消化時(shí)間下的大米谷蛋白熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of glutelin at different times of in vitro simulated digestion

2.3 體外模擬消化過(guò)程中谷蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量變化

消化過(guò)程中谷蛋白的酰胺I光譜進(jìn)行去卷積，如圖4所示。從開(kāi)始消化到消化完成的5 h過(guò)程中中谷蛋白的酰胺I區(qū)域中出現(xiàn)譜帶增加現(xiàn)象，表示在胰蛋白水解谷蛋白過(guò)程中，有新的羰基形成[24]。參考文獻(xiàn)[13]對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)與擬合圖譜中各子峰對(duì)應(yīng)關(guān)系，得出谷蛋白不同類型二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量，如表1所示。經(jīng)過(guò)胰蛋白酶的消化后，谷蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著性變化（P＜0.05）。在谷蛋白DH不斷增加的過(guò)程中，α-螺旋相對(duì)含量顯著增加（P＜0.05），從22.36%增加至36.59%。胰蛋白酶水解0.5～1 h后，谷蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量略有增加，而β-折疊結(jié)構(gòu)相對(duì)含量大幅減少，表明胰蛋白酶的水解使得蛋白的結(jié)構(gòu)得以舒展，也對(duì)應(yīng)了該階段內(nèi)源熒光光譜中色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度驟增的現(xiàn)象。在DH快速增大的2 h中，β-折疊相對(duì)含量顯著降低，從29.32%降低至最低值8.51%（P＜0.05），推測(cè)β-折疊的被胰蛋白酶水解。而β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量從15.72%增加至最高值25.45%，隨后呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。而水解過(guò)程中無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量并無(wú)明顯變化。這與Xu Xingfeng等[25]使用圓二色光譜研究水解過(guò)程大米蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)相似。Yong Yehui等[26]報(bào)道β-折疊是一種相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，而α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲則相對(duì)比較靈活。以上結(jié)果表明谷蛋白在5 h的胰蛋白酶的水解過(guò)程中打開(kāi)β-折疊結(jié)構(gòu)，使得結(jié)構(gòu)變得松散，使得胰蛋白酶更容易與谷蛋白結(jié)合，而水解更多活性肽段提供了可能。這也與谷蛋白水解過(guò)程內(nèi)源熒光測(cè)定的結(jié)果具有一致性。

表1 不同消化時(shí)間下大米谷蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量Table 1 Secondary structure contents of glutelin determined by FTIR spectroscopy at different digestion times

圖4 大米谷蛋白不同消化時(shí)間下FTIR中酰胺I帶譜圖Fig.4 Amide I FTIR spectra of glutelin at different digestion times

2.4 水解產(chǎn)物抗氧化性變化

蛋白經(jīng)酶水解后能夠得到具有抗氧化活性的多肽，并且在多肽分子質(zhì)量小于3 kDa時(shí)餾分中該活性提高了2～3 倍[27]。由圖5可知，在DPPH自由基抑制率、·OH清除能力和Fe2+螯合能力實(shí)驗(yàn)中，隨著谷蛋白DH的增加，水解產(chǎn)物的抗氧化性呈下降趨勢(shì)。根據(jù)回歸方程計(jì)算消化產(chǎn)物中抗氧化肽的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）變化如表2所示，Trolox清除DPPH自由基的IC50為0.004 mg/mL。在0.5～5 h消化過(guò)程，谷蛋白抗氧化肽DPPH自由基抑制率IC50從（1.113±0.015）mg/mL增加至（2.057±0.038）mg/mL。這可能是由于經(jīng)過(guò)胃蛋白酶2 h的水解后，更多的疏水性氨基殘基側(cè)鏈基團(tuán)暴露出來(lái)以穩(wěn)定DPPH自由基，而胰酶消化后能產(chǎn)生更多的親水性氨基酸，難與脂溶性DPPH自由基反應(yīng)[10]，導(dǎo)致清除DPPH自由基的能力下降。Fe2+螯合能力IC50從（0.678±0.019）mg/mL增加至（2.018±0.017）mg/mL，·OH清除能力IC50從（0.518±0.053）mg/mL增加至（1.482±0.045）mg/mL。研究表明水解產(chǎn)物的抗氧化活性主要取決于氨基酸組成以及序列結(jié)構(gòu)[28]，推斷加入胰蛋白酶后，隨著谷蛋白消化時(shí)間的推移，具有抗氧化性的肽段可能被水解而破壞抗氧化性的氨基酸序列結(jié)構(gòu)，進(jìn)而降低了其抗氧化活性。Mahdavi-Yekta等[29]使用堿性蛋白酶和胃蛋白酶對(duì)藜麥蛋白水解發(fā)現(xiàn)，消化時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)降低抗氧化肽對(duì)于DPPH自由基的抑制率，這與本實(shí)驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)相似。Liu Zhidong等[30]也指出，隨乳清蛋白消化時(shí)間的延長(zhǎng)，其多肽抗氧化能力也會(huì)呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。

圖5 不同消化時(shí)間下大米谷蛋白水解物抗氧化值變化Fig.5 Changes in antioxidant activity of rice glutelin hydrolysates at different digestion times

表2 不同消化時(shí)間下大米谷蛋白多肽生物活性對(duì)應(yīng)的IC50Table 2 IC50of glutelin peptides at different digestion times

2.5 ACE抑制率的變化

ACE可以將血管緊張素I轉(zhuǎn)化為血管緊張素II，而促使血壓升高。高血壓作為最常見(jiàn)的與氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)的慢性疾病。探究不同消化時(shí)間下抗氧化和ACE的抑制率變化，能更全面地詮釋谷蛋白的生物活性。大米蛋白經(jīng)胃蛋白酶水解后，在胰蛋白酶5 h消化過(guò)程間隔一定時(shí)間取凍干粉末，研究其ACE抑制率。如圖6所示，ACE抑制率與谷蛋白DH存在正相關(guān)關(guān)系，在胰蛋白酶水解的前2 h過(guò)程中，谷蛋白DH快速上升，水解物包含ACE抑制的肽段也因水解迅速增加，水解速率在2 h達(dá)到最大，而此時(shí)水解物ACE的抑制率也達(dá)到了最強(qiáng)。其中在胰蛋白酶消化2 h后水解物濃度為1 mg/mL時(shí)，ACE抑制率達(dá)到70.63%，水解物IC50為（0.693±0.011）mg/mL，將卡托普利作為對(duì)照，其IC50為0.007 μg/mL。在DH達(dá)到平穩(wěn)時(shí)期后，谷蛋白的一些結(jié)構(gòu)對(duì)胰蛋白酶產(chǎn)生了抗性，以及水解產(chǎn)物中肽段進(jìn)一步水解而降低了ACE抑制率[31]。蛋白經(jīng)過(guò)胃蛋白酶水解后，產(chǎn)生疏水性氨基酸和芳香族氨基酸可以與ACE形成競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合[32]。此外梁婷婷等[33]通過(guò)比較植物蛋白和紅肉水解物，得出單純從芳香族和疏水性氨基酸含量解釋ACE抑制活性差異不具有全面性。所以，大米谷蛋白模擬胃腸道消化后可以直接生成ACE抑制肽，但是過(guò)度水解會(huì)導(dǎo)致肽活性降低。

圖6 不同消化時(shí)間下大米谷蛋白水解物ACE抑制率（a）及DH與ACE抑制率的變化（b）Fig.6 Changes in ACE-inhibitory rate (a) and DH (b) of rice glutelin hydrolysates at different digestion times

2.6 不同消化時(shí)間下水解物肽段的質(zhì)譜分析結(jié)果

運(yùn)用Q-TOF-MS質(zhì)譜技術(shù)分析了不同消化時(shí)間下小于3 kDa的分子質(zhì)量分布。如圖7所示，胰蛋白酶消化5 h過(guò)程中，水解物中的多肽的分子質(zhì)量在2 000～3 000 Da的占比在不斷減小，1 000～2 000 Da隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，占比越來(lái)越大，說(shuō)明胰蛋白酶的消化過(guò)程將2 000～3 000 Da的肽段水解成1 000～2 000 Da的肽段，但分子質(zhì)量在500～1 000 Da之間的多肽含量保持穩(wěn)定。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，Wen Wenjun等[13]對(duì)小麥谷蛋白進(jìn)行體外模擬胃腸兩步消化后，水解物的分子質(zhì)量范圍在700～3 000 Da，且可以得到具有抗氧化和ACE抑制的肽段。

圖7 不同消化時(shí)間下水解產(chǎn)物生物活性肽分子質(zhì)量分布Fig.7 Molecular mass distribution of bioactive peptides in hydrolysates at different digestion times

消化時(shí)間0.5 h和2 h水解物進(jìn)行質(zhì)譜分析，并將檢測(cè)了肽段序列與BIOPEP數(shù)據(jù)庫(kù)存中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的大米谷蛋白抗氧化肽和ACE抑制肽進(jìn)行匹配。研究已經(jīng)表明，丙氨酸（A）、組氨酸（H）、脯氨酸（P）、色氨酸（W）、酪氨酸（Y）和蛋氨酸（M）具有抗氧化性[34]。如表3所示，0.5 h水解物中共發(fā)現(xiàn)12 條不同的肽段，其中8 個(gè)肽段中均至少含有一種具有抗氧化活性的氨基酸。10 條肽段的疏水性氨基酸含量占比50%以上，其中肽段VEGGFLFIV疏水性氨基酸含量占比高達(dá)88%。對(duì)2 h水解物肽段序列分析如表3所示，共發(fā)現(xiàn)12 條肽段中含有氨基酸殘基數(shù)在7～12之間，其中9 條肽段在N-端是疏水性氨基酸或者堿性氨基酸，符合ACE抑制肽的特點(diǎn)[35]。其中9 條肽段與大米谷蛋白BIOPEP數(shù)據(jù)庫(kù)具有ACE抑制活性的肽段匹配。

表3 抗氧化性最強(qiáng)（0.5 h）和ACE抑制率最高（2 h）的水解物多肽序列Table 3 Peptide sequences of hydrolysates with the strongest antioxidant capacity (at 0.5 h) and the highest ACE inhibitory activity (at 2 h)

3 結(jié) 論

谷蛋白體外模擬消化過(guò)程中，胰蛋白酶作用于β-折疊結(jié)構(gòu)使得谷蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)，內(nèi)源熒光強(qiáng)度增加，而釋放生物活性物質(zhì)。水解物的抗氧化性隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)與DH呈負(fù)相關(guān)，而ACE抑制率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，且與水解速率呈正相關(guān)，水解產(chǎn)物抗氧化和ACE抑制能力分別在0.5 h谷蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量最低和2 hβ-折疊結(jié)構(gòu)相對(duì)含量較少時(shí)達(dá)到最強(qiáng)且多肽分子質(zhì)量位于700～1 200 kDa。通過(guò)比較不同消化時(shí)間下小分子質(zhì)量（＜3 kDa）蛋白多肽發(fā)現(xiàn)，水解使得0.5～2 kDa的多肽子含量不斷增加。通過(guò)Q-TOF-MS鑒定了體外模擬消化水解物0.5 h和2 h的多肽序列，其中抗氧化肽10 條肽段的疏水性氨基酸含量占比50%以上，其中肽段VEGGFLFIV最具有代表性。ACE抑制多肽12 條肽段中9 條肽段在N-端是疏水性氨基酸或者堿性氨基酸。本實(shí)驗(yàn)為體外模擬消化條件下，開(kāi)發(fā)谷蛋白抗氧化和ACE抑制肽提供了理論依據(jù)。