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    微波輔助Osborne法提取米糠谷蛋白及對(duì)其性質(zhì)的影響

    2022-02-12 09:42:50肖志剛段慶松段玉敏朱旻鵬高育哲
    中國油脂 2022年1期
    關(guān)鍵詞:谷蛋白米糠水性

    肖志剛,段慶松,段玉敏,朱旻鵬,蘇 爽,何 東,高育哲

    (1.沈陽師范大學(xué) 糧食學(xué)院,沈陽 110034; 2.沈陽師范大學(xué) 學(xué)前與初等教育學(xué)院,沈陽 110034)

    米糠是稻米加工過程的主要副產(chǎn)物,主要由果皮、種皮、胚乳和糊粉層組成[1]。米糠中蛋白質(zhì)含量豐富,占10%~16%。米糠蛋白組成為清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白,含量分別為37%、36%、22%、5%[2],其中,谷蛋白作為米糠中主要的不溶性蛋白,較清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白具有較高的必需氨基酸含量[3],研究米糠谷蛋白的提取對(duì)于探索其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。

    目前提取米糠谷蛋白的主要方法為Osborne法,該方法是根據(jù)蛋白質(zhì)在不同pH條件下的溶解性不同且等電點(diǎn)處溶解度最低的特點(diǎn),采取堿溶酸沉法將多種蛋白質(zhì)分級(jí)提取出來,但Osborne法分離米糠谷蛋白的提取率較低[4]。提取前對(duì)米糠進(jìn)行輔助處理有助于提高蛋白的提取率。微波可滲透分子內(nèi)部,增加分子運(yùn)動(dòng),對(duì)氫鍵、疏水鍵產(chǎn)生作用,從而改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象與活性。本試驗(yàn)采用微波對(duì)米糠進(jìn)行預(yù)處理后,利用Osborne法提取米糠谷蛋白,確定最優(yōu)提取條件,并將微波、未微波處理提取的米糠谷蛋白結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)進(jìn)行比較,為米糠谷蛋白的開發(fā)和應(yīng)用提供理論支撐。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    龍粳31號(hào)大米米糠(水分含量11.92%),遼寧盛寶天隆米業(yè)。SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒,考馬斯亮藍(lán)R-250,十二烷基硫酸鈉,鹽酸胍,5,5-二硫基-2,2-二硝基苯甲酸,其他試劑均為分析純。

    DWF-100型電動(dòng)粉碎機(jī),GL-21M高速冷凍離心機(jī),Ntcolet 5DXC紅外光譜儀,SU3500掃描電鏡,DELTA320型pH 計(jì),MAS-II PLUS常壓微波萃取儀,SRD-200凱氏定氮儀,F(xiàn)97熒光分光光度計(jì),J810圓二色譜儀。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 微波輔助Osborne法提取米糠谷蛋白

    根據(jù)Osborne[2]的分級(jí)原理并加以修改。將新鮮米糠過0.28 mm(50目)篩,稱取50 g于200 mL蒸餾水中,在一定的微波功率、微波時(shí)間和微波溫度下對(duì)米糠進(jìn)行微波處理,再根據(jù)Osborne法進(jìn)行谷蛋白提取。采用GB 5009.5—2016凱氏定氮法測(cè)定谷蛋白含量,按公式(1)計(jì)算米糠谷蛋白提取率(Y)。

    Y=m1/m×100%

    (1)

    式中:m1為提取液中谷蛋白含量;m為原料中谷蛋白含量。

    1.2.2 米糠谷蛋白掃描電鏡分析

    將米糠谷蛋白冷凍干燥處理,并用掃描電鏡對(duì)米糠谷蛋白進(jìn)行形貌觀察。將待觀察的樣品涂在導(dǎo)電膠帶上,并涂上一層5 mm厚的金屬,設(shè)置電壓5 kV,于500×放大倍數(shù)下選擇合適視野,拍攝米糠谷蛋白形貌特征。

    1.2.3 米糠谷蛋白結(jié)構(gòu)分析

    1.2.3.1 紅外光譜分析

    將1 mg米糠谷蛋白樣品與100 mg溴化鉀混勻,壓制成片進(jìn)行紅外光譜分析,光譜掃描范圍為400~4 000 cm-1,分辨率為4 cm-1。

    1.2.3.2 圓二色譜分析

    參考文獻(xiàn)[7]的方法并加以改進(jìn)。取10 mg待測(cè)樣品,加入10 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.5,0.005 mol/L),充分混合之后,將溶液倒入吸收池,將其放在圓二色譜儀中掃描,以190~250 nm作為掃描范圍,掃描速度100 nm/min,利用Spectra Analysis軟件對(duì)圖譜進(jìn)行函數(shù)平滑,利用儀器附帶Jasco二級(jí)結(jié)構(gòu)估值程序估算待測(cè)樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

    1.2.4 米糠谷蛋白的功能性質(zhì)分析

    1.2.4.1 溶解性測(cè)定

    準(zhǔn)確稱取2 g的米糠谷蛋白溶于10 mL蒸餾水中,調(diào)pH為7.0,室溫?cái)嚢? h,于8 000 r/min離心20 min,然后用凱氏定氮法測(cè)定上清液的含氮量。溶解性用氮溶指數(shù)表示,按公式(2)計(jì)算。

    INS=x1/x×100%

    (2)

    式中:INS為氮溶指數(shù)值;x1為上清液含氮量;x為樣品總含氮量。

    1.2.4.2 持水性和持油性測(cè)定

    稱取0.1 g米糠谷蛋白溶于5 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液或大豆油中,室溫下渦旋3 min,于5 000 r/min離心20 min,稱取離心后沉淀的質(zhì)量。按照公式(3)計(jì)算持水性(y1)或持油性(y2)。

    (3)

    式中:m為米糠谷蛋白的質(zhì)量;m1為離心后沉淀的質(zhì)量。

    1.2.4.3 乳化活性及乳化穩(wěn)定性測(cè)定

    采用文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行測(cè)定。稱取0.2 g米糠谷蛋白溶于20 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液,混勻,從中取15 mL與5 mL大豆油混合,以10 000 r/min均質(zhì)3 min。將50 μL的底部乳液與5 mL 0.1%的SDS完全混合,然后在500 nm處測(cè)定吸光度(A0)(對(duì)照組為0.1%SDS)。靜置10 min后再次從底部各取50 μL樣品,用5 mL 0.1%SDS溶液稀釋,測(cè)定吸光度(A10)。乳化活性(IEA)和乳化穩(wěn)定性(IES)分別按公式(4)和公式(5)計(jì)算。

    (4)

    (5)

    式中:N為稀釋倍數(shù);φ為體系中油相體積分?jǐn)?shù);C為樣品溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度;ΔT為兩次間隔時(shí)間差。

    1.2.4.4 起泡性及泡沫穩(wěn)定性測(cè)定

    采用文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行測(cè)定,并加以修改。準(zhǔn)確稱量0.2 g米糠谷蛋白與20 mL 0.05 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液于50 mL燒杯中混勻。使用均質(zhì)機(jī)以10 000 r/min均質(zhì)3 min,測(cè)均質(zhì)后液面體積(V0),在室溫下靜置30 min后再讀取液面體積(V30)。起泡性(H1)和泡沫穩(wěn)定性(H2)分別按照公式(6)和公式(7)計(jì)算。

    (6)

    (7)

    1.2.5 米糠谷蛋白表面疏水性的測(cè)定

    參考文獻(xiàn)[10]方法采用ANS探針法測(cè)定米糠谷蛋白的表面疏水性。用磷酸緩沖溶液(0.05 mol/L,pH 7.0)制備8 mmol/L ANS溶液,加入一定量的米糠谷蛋白,使其充分溶解,在8 000 r/min下離心20 min,除去沉淀,以Lowery法計(jì)算米糠谷蛋白質(zhì)量濃度。通過磷酸緩沖溶液的稀釋,得到質(zhì)量濃度分別為0.05~0.15 mg/mL的米糠谷蛋白溶液,取40 μL ANS溶液滴加至不同質(zhì)量濃度的米糠谷蛋白溶液中,避光靜置15 min,然后進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試條件為激發(fā)波長(zhǎng)390 nm,發(fā)射波長(zhǎng)470 nm,掃描夾縫5 nm,掃描速率10 nm/s。將熒光強(qiáng)度與米糠谷蛋白質(zhì)量濃度做線性圖,以初始段的斜率值計(jì)為米糠谷蛋白的表面疏水性。

    1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

    采用Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表處理,采用SPSS.24軟件進(jìn)行顯著性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗(yàn)

    2.1.1 微波功率對(duì)米糠谷蛋白提取率的影響

    在微波時(shí)間15 min、微波溫度35℃條件下,考察微波功率對(duì)米糠谷蛋白提取率的影響,結(jié)果見圖1。

    圖1 微波功率對(duì)米糠谷蛋白提取率的影響

    由圖1可知,隨微波功率的增加,米糠谷蛋白提取率不斷增加,在微波功率為700 W時(shí)達(dá)到最高(72.5%)。這可能是在微波處理時(shí),米糠細(xì)胞壁被破碎,內(nèi)部氫鍵以及二硫鍵被破壞,蛋白質(zhì)易于溶出,谷蛋白提取率升高。微波功率超過700 W后,米糠谷蛋白提取率降低。因此,選定微波功率為700 W。

    2.1.2 微波時(shí)間對(duì)米糠谷蛋白提取率的影響

    在微波功率700 W、微波溫度35℃條件下,考察微波時(shí)間對(duì)米糠谷蛋白提取率的影響,結(jié)果見圖2。

    圖2 微波時(shí)間對(duì)米糠谷蛋白提取率的影響

    由圖2可知,隨微波時(shí)間的延長(zhǎng),米糠谷蛋白提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),在微波時(shí)間超過15 min后,米糠谷蛋白提取率不斷降低。原因是在微波的作用下,微波時(shí)間過長(zhǎng),蛋白質(zhì)分子氫鍵以及基團(tuán)發(fā)生改變,內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露出來,疏水殘基相互作用形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)難以溶出,使谷蛋白提取率降低。因此,選定微波時(shí)間為15 min。

    2.1.3 微波溫度對(duì)米糠谷蛋白提取率的影響

    在微波時(shí)間15 min、微波功率700 W條件下,考察微波溫度對(duì)米糠谷蛋白提取率的影響,結(jié)果見圖3。

    圖3 微波溫度對(duì)米糠谷蛋白提取率的影響

    由圖3可知,隨微波溫度的升高,米糠谷蛋白提取率呈現(xiàn)不斷升高的趨勢(shì),在40℃時(shí)米糠谷蛋白提取率達(dá)到最大,之后繼續(xù)升高溫度,米糠谷蛋白提取率下降。在微波作用下,隨著溫度的升高蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得疏松,蛋白質(zhì)中二硫鍵被破壞,促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解,從而提高了蛋白提取率。因此,選定微波溫度為45℃。

    2.2 正交試驗(yàn)

    根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,采用三因素三水平的正交試驗(yàn)對(duì)米糠谷蛋白提取參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,正交試驗(yàn)因素水平見表1,正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

    表1 正交試驗(yàn)因素水平

    表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

    由表2可見,各因素對(duì)米糠谷蛋白提取率影響大小依次為A>C>B,即微波功率>微波溫度>微波時(shí)間,最優(yōu)方案為A3B3C2。結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果,最終確定最優(yōu)工藝方案為A3B2C2,即微波功率800 W、微波時(shí)間15 min、微波溫度40℃。在最優(yōu)方案下,米糠谷蛋白提取率為73.1%。

    2.3 微波處理對(duì)米糠谷蛋白性質(zhì)的影響

    2.3.1 微波處理前后米糠谷蛋白的掃描電鏡圖

    采用掃描電鏡觀察微波處理前后米糠谷蛋白表面形貌,結(jié)果見圖4。

    圖4 微波處理前后米糠谷蛋白掃描電鏡圖

    由圖4可知,米糠谷蛋白表面多孔,經(jīng)過微波處理后蛋白表面孔隙增大,其原因可能與微波處理后堿液提取的米糠谷蛋白非共價(jià)鍵的相互作用增強(qiáng)有關(guān)。

    2.3.2 微波處理對(duì)米糠谷蛋白結(jié)構(gòu)的影響

    圖5是微波處理前后米糠谷蛋白的紅外光譜圖,表3為米糠谷蛋白的圓二色譜測(cè)定結(jié)果。由圖5可見,微波處理前后的米糠谷蛋白的紅外光譜圖走勢(shì)相似,但在二級(jí)結(jié)構(gòu)上存在很大差異。米糠谷蛋白在1 700 cm-1附近的振動(dòng)峰是由C—N伸縮振動(dòng)和N—H面內(nèi)變形振動(dòng)所形成的α-螺旋和β-折疊,在3 000 cm-1附近的振動(dòng)峰均是由 —CH2和 —CH3伸縮振動(dòng)引起的。蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-折疊是比較有序的蛋白結(jié)構(gòu),具有較高的穩(wěn)定性[15]。由表3可知,微波處理后,米糠谷蛋白α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角向β-折疊轉(zhuǎn)移,β-折疊含量明顯提高,因此微波處理后的米糠谷蛋白有較高的穩(wěn)定性。

    圖5 微波處理前后米糠谷蛋白的紅外光譜圖

    表3 米糠谷蛋白的圓二色譜測(cè)定結(jié)果%

    2.3.3 微波處理對(duì)米糠谷蛋白功能性質(zhì)的影響(見表4)

    米糠谷蛋白是具有較大空間結(jié)構(gòu)的大分子類物質(zhì),分子內(nèi)的大量基團(tuán)在受到外界影響時(shí)會(huì)發(fā)生某些變化,進(jìn)而影響其功能性質(zhì)[11]。由表4可知,米糠經(jīng)過微波處理后所提取的米糠谷蛋白功能性質(zhì)發(fā)生改變,溶解性提高了8.12百分點(diǎn),持水性升高了0.89百分點(diǎn),持油性降低了0.84百分點(diǎn)。郝天舒等[12]研究發(fā)現(xiàn),微波處理提高了米糠蛋白的溶解性,可能是與蛋白氨基酸分布有關(guān)。米糠經(jīng)過微波處理后,米糠谷蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞,導(dǎo)致親水基團(tuán)暴露,加劇了蛋白質(zhì)分子的氫鍵和離子基團(tuán)的水合作用,蛋白持水性升高。微波處理后米糠谷蛋白起泡性增加了20.41百分點(diǎn),泡沫穩(wěn)定性則降低了21.66百分點(diǎn)。這可能是因?yàn)槲⒉ㄌ幚砗螅卓饭鹊鞍捉Y(jié)構(gòu)展開,更易吸附到空氣-水界面上,形成泡沫,這與Adam等[13]的研究結(jié)果一致。微波處理后,米糠谷蛋白乳化穩(wěn)定性增加了5.50百分點(diǎn),但乳化活性降低了4.61百分點(diǎn),這可能是微波處理破壞了米糠谷蛋白結(jié)構(gòu),致使疏水基團(tuán)疏遠(yuǎn)水相,從而降低了乳化活性[14]。

    表4 微波處理對(duì)米糠谷蛋白功能性質(zhì)的影響

    2.3.4 微波處理對(duì)米糠谷蛋白表面疏水性的影響(見圖6)

    圖6 微波功率對(duì)米糠谷蛋白表面疏水性的影響

    由圖6可知,隨著微波功率的增加,米糠谷蛋白表面疏水性總體逐漸增加,且均高于未微波處理的。表明微波處理后,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開,內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露于蛋白質(zhì)分子表面。

    3 結(jié) 論

    本研究采用微波輔助Osborne法提取米糠谷蛋白,在微波功率800 W、微波時(shí)間15 min、微波溫度40℃條件下,米糠谷蛋白提取率達(dá)到73.1%。微波處理后米糠谷蛋白α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角向β-折疊轉(zhuǎn)移,β-折疊含量明顯提高。微波處理后,米糠谷蛋白的溶解性提高了8.12百分點(diǎn),持水性升高了0.89百分點(diǎn),起泡性增加了20.41百分點(diǎn),乳化穩(wěn)定性增加了5.50百分點(diǎn),持油性降低了0.84百分點(diǎn),乳化活性降低了4.61百分點(diǎn),泡沫穩(wěn)定性降低了21.66百分點(diǎn)。米糠谷蛋白表面疏水性隨微波功率增加總體逐漸增大。本研究可為米糠谷蛋白的工業(yè)化制備及在各種食品配方中的應(yīng)用提供理論支撐。

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