微波輔助Osborne法提取米糠谷蛋白及對(duì)其性質(zhì)的影響

肖志剛，段慶松，段玉敏，朱旻鵬，蘇 爽，何 東，高育哲

(1.沈陽師范大學(xué) 糧食學(xué)院，沈陽 110034； 2.沈陽師范大學(xué) 學(xué)前與初等教育學(xué)院，沈陽 110034)

米糠是稻米加工過程的主要副產(chǎn)物，主要由果皮、種皮、胚乳和糊粉層組成[1]。米糠中蛋白質(zhì)含量豐富，占10%～16%。米糠蛋白組成為清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白，含量分別為37%、36%、22%、5%[2]，其中，谷蛋白作為米糠中主要的不溶性蛋白，較清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白具有較高的必需氨基酸含量[3]，研究米糠谷蛋白的提取對(duì)于探索其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。

目前提取米糠谷蛋白的主要方法為Osborne法，該方法是根據(jù)蛋白質(zhì)在不同pH條件下的溶解性不同且等電點(diǎn)處溶解度最低的特點(diǎn)，采取堿溶酸沉法將多種蛋白質(zhì)分級(jí)提取出來，但Osborne法分離米糠谷蛋白的提取率較低[4]。提取前對(duì)米糠進(jìn)行輔助處理有助于提高蛋白的提取率。微波可滲透分子內(nèi)部，增加分子運(yùn)動(dòng)，對(duì)氫鍵、疏水鍵產(chǎn)生作用，從而改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象與活性。本試驗(yàn)采用微波對(duì)米糠進(jìn)行預(yù)處理后，利用Osborne法提取米糠谷蛋白，確定最優(yōu)提取條件，并將微波、未微波處理提取的米糠谷蛋白結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)進(jìn)行比較，為米糠谷蛋白的開發(fā)和應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

龍粳31號(hào)大米米糠(水分含量11.92%)，遼寧盛寶天隆米業(yè)。SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒，考馬斯亮藍(lán)R-250，十二烷基硫酸鈉，鹽酸胍，5,5-二硫基-2,2-二硝基苯甲酸，其他試劑均為分析純。

DWF-100型電動(dòng)粉碎機(jī)，GL-21M高速冷凍離心機(jī)，Ntcolet 5DXC紅外光譜儀，SU3500掃描電鏡，DELTA320型pH 計(jì)，MAS-II PLUS常壓微波萃取儀，SRD-200凱氏定氮儀，F(xiàn)97熒光分光光度計(jì)，J810圓二色譜儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微波輔助Osborne法提取米糠谷蛋白

根據(jù)Osborne[2]的分級(jí)原理并加以修改。將新鮮米糠過0.28 mm(50目)篩，稱取50 g于200 mL蒸餾水中，在一定的微波功率、微波時(shí)間和微波溫度下對(duì)米糠進(jìn)行微波處理，再根據(jù)Osborne法進(jìn)行谷蛋白提取。采用GB 5009.5—2016凱氏定氮法測(cè)定谷蛋白含量，按公式(1)計(jì)算米糠谷蛋白提取率(Y)。

Y=m1/m×100%

(1)

式中：m1為提取液中谷蛋白含量；m為原料中谷蛋白含量。

1.2.2 米糠谷蛋白掃描電鏡分析

將米糠谷蛋白冷凍干燥處理，并用掃描電鏡對(duì)米糠谷蛋白進(jìn)行形貌觀察。將待觀察的樣品涂在導(dǎo)電膠帶上，并涂上一層5 mm厚的金屬，設(shè)置電壓5 kV，于500×放大倍數(shù)下選擇合適視野，拍攝米糠谷蛋白形貌特征。

1.2.3 米糠谷蛋白結(jié)構(gòu)分析

1.2.3.1 紅外光譜分析

將1 mg米糠谷蛋白樣品與100 mg溴化鉀混勻，壓制成片進(jìn)行紅外光譜分析，光譜掃描范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.2.3.2 圓二色譜分析

參考文獻(xiàn)[7]的方法并加以改進(jìn)。取10 mg待測(cè)樣品，加入10 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.5，0.005 mol/L),充分混合之后，將溶液倒入吸收池，將其放在圓二色譜儀中掃描，以190～250 nm作為掃描范圍，掃描速度100 nm/min，利用Spectra Analysis軟件對(duì)圖譜進(jìn)行函數(shù)平滑，利用儀器附帶Jasco二級(jí)結(jié)構(gòu)估值程序估算待測(cè)樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.4 米糠谷蛋白的功能性質(zhì)分析

1.2.4.1 溶解性測(cè)定

準(zhǔn)確稱取2 g的米糠谷蛋白溶于10 mL蒸餾水中，調(diào)pH為7.0，室溫?cái)嚢? h，于8 000 r/min離心20 min，然后用凱氏定氮法測(cè)定上清液的含氮量。溶解性用氮溶指數(shù)表示，按公式(2)計(jì)算。

INS=x1/x×100%

(2)

式中：INS為氮溶指數(shù)值；x1為上清液含氮量；x為樣品總含氮量。

1.2.4.2 持水性和持油性測(cè)定

稱取0.1 g米糠谷蛋白溶于5 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液或大豆油中，室溫下渦旋3 min，于5 000 r/min離心20 min，稱取離心后沉淀的質(zhì)量。按照公式(3)計(jì)算持水性(y1)或持油性(y2)。

(3)

式中：m為米糠谷蛋白的質(zhì)量；m1為離心后沉淀的質(zhì)量。

1.2.4.3 乳化活性及乳化穩(wěn)定性測(cè)定

采用文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行測(cè)定。稱取0.2 g米糠谷蛋白溶于20 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，混勻，從中取15 mL與5 mL大豆油混合，以10 000 r/min均質(zhì)3 min。將50 μL的底部乳液與5 mL 0.1%的SDS完全混合，然后在500 nm處測(cè)定吸光度(A0)(對(duì)照組為0.1%SDS)。靜置10 min后再次從底部各取50 μL樣品，用5 mL 0.1%SDS溶液稀釋，測(cè)定吸光度(A10)。乳化活性(IEA)和乳化穩(wěn)定性(IES)分別按公式(4)和公式(5)計(jì)算。

(4)

(5)

式中：N為稀釋倍數(shù)；φ為體系中油相體積分?jǐn)?shù)；C為樣品溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度；ΔT為兩次間隔時(shí)間差。

1.2.4.4 起泡性及泡沫穩(wěn)定性測(cè)定

采用文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行測(cè)定，并加以修改。準(zhǔn)確稱量0.2 g米糠谷蛋白與20 mL 0.05 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液于50 mL燒杯中混勻。使用均質(zhì)機(jī)以10 000 r/min均質(zhì)3 min，測(cè)均質(zhì)后液面體積(V0)，在室溫下靜置30 min后再讀取液面體積(V30)。起泡性(H1)和泡沫穩(wěn)定性(H2)分別按照公式(6)和公式(7)計(jì)算。

(6)

(7)

1.2.5 米糠谷蛋白表面疏水性的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[10]方法采用ANS探針法測(cè)定米糠谷蛋白的表面疏水性。用磷酸緩沖溶液(0.05 mol/L，pH 7.0)制備8 mmol/L ANS溶液，加入一定量的米糠谷蛋白，使其充分溶解，在8 000 r/min下離心20 min，除去沉淀，以Lowery法計(jì)算米糠谷蛋白質(zhì)量濃度。通過磷酸緩沖溶液的稀釋，得到質(zhì)量濃度分別為0.05～0.15 mg/mL的米糠谷蛋白溶液，取40 μL ANS溶液滴加至不同質(zhì)量濃度的米糠谷蛋白溶液中，避光靜置15 min，然后進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試條件為激發(fā)波長(zhǎng)390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)470 nm，掃描夾縫5 nm，掃描速率10 nm/s。將熒光強(qiáng)度與米糠谷蛋白質(zhì)量濃度做線性圖，以初始段的斜率值計(jì)為米糠谷蛋白的表面疏水性。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表處理，采用SPSS.24軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 微波功率對(duì)米糠谷蛋白提取率的影響

在微波時(shí)間15 min、微波溫度35℃條件下，考察微波功率對(duì)米糠谷蛋白提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 微波功率對(duì)米糠谷蛋白提取率的影響

由圖1可知，隨微波功率的增加，米糠谷蛋白提取率不斷增加，在微波功率為700 W時(shí)達(dá)到最高(72.5%)。這可能是在微波處理時(shí)，米糠細(xì)胞壁被破碎，內(nèi)部氫鍵以及二硫鍵被破壞，蛋白質(zhì)易于溶出，谷蛋白提取率升高。微波功率超過700 W后，米糠谷蛋白提取率降低。因此，選定微波功率為700 W。

2.1.2 微波時(shí)間對(duì)米糠谷蛋白提取率的影響

在微波功率700 W、微波溫度35℃條件下，考察微波時(shí)間對(duì)米糠谷蛋白提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 微波時(shí)間對(duì)米糠谷蛋白提取率的影響

由圖2可知，隨微波時(shí)間的延長(zhǎng)，米糠谷蛋白提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在微波時(shí)間超過15 min后，米糠谷蛋白提取率不斷降低。原因是在微波的作用下，微波時(shí)間過長(zhǎng)，蛋白質(zhì)分子氫鍵以及基團(tuán)發(fā)生改變，內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露出來，疏水殘基相互作用形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)難以溶出，使谷蛋白提取率降低。因此，選定微波時(shí)間為15 min。

2.1.3 微波溫度對(duì)米糠谷蛋白提取率的影響

在微波時(shí)間15 min、微波功率700 W條件下，考察微波溫度對(duì)米糠谷蛋白提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 微波溫度對(duì)米糠谷蛋白提取率的影響

由圖3可知，隨微波溫度的升高，米糠谷蛋白提取率呈現(xiàn)不斷升高的趨勢(shì)，在40℃時(shí)米糠谷蛋白提取率達(dá)到最大，之后繼續(xù)升高溫度，米糠谷蛋白提取率下降。在微波作用下，隨著溫度的升高蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得疏松，蛋白質(zhì)中二硫鍵被破壞，促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解，從而提高了蛋白提取率。因此，選定微波溫度為45℃。

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用三因素三水平的正交試驗(yàn)對(duì)米糠谷蛋白提取參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)因素水平見表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由表2可見，各因素對(duì)米糠谷蛋白提取率影響大小依次為A>C>B，即微波功率>微波溫度>微波時(shí)間，最優(yōu)方案為A3B3C2。結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，最終確定最優(yōu)工藝方案為A3B2C2，即微波功率800 W、微波時(shí)間15 min、微波溫度40℃。在最優(yōu)方案下，米糠谷蛋白提取率為73.1%。

2.3 微波處理對(duì)米糠谷蛋白性質(zhì)的影響

2.3.1 微波處理前后米糠谷蛋白的掃描電鏡圖

采用掃描電鏡觀察微波處理前后米糠谷蛋白表面形貌，結(jié)果見圖4。

圖4 微波處理前后米糠谷蛋白掃描電鏡圖

由圖4可知，米糠谷蛋白表面多孔，經(jīng)過微波處理后蛋白表面孔隙增大，其原因可能與微波處理后堿液提取的米糠谷蛋白非共價(jià)鍵的相互作用增強(qiáng)有關(guān)。

2.3.2 微波處理對(duì)米糠谷蛋白結(jié)構(gòu)的影響

圖5是微波處理前后米糠谷蛋白的紅外光譜圖，表3為米糠谷蛋白的圓二色譜測(cè)定結(jié)果。由圖5可見，微波處理前后的米糠谷蛋白的紅外光譜圖走勢(shì)相似，但在二級(jí)結(jié)構(gòu)上存在很大差異。米糠谷蛋白在1 700 cm-1附近的振動(dòng)峰是由C—N伸縮振動(dòng)和N—H面內(nèi)變形振動(dòng)所形成的α-螺旋和β-折疊，在3 000 cm-1附近的振動(dòng)峰均是由 —CH2和 —CH3伸縮振動(dòng)引起的。蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-折疊是比較有序的蛋白結(jié)構(gòu)，具有較高的穩(wěn)定性[15]。由表3可知，微波處理后，米糠谷蛋白α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角向β-折疊轉(zhuǎn)移，β-折疊含量明顯提高，因此微波處理后的米糠谷蛋白有較高的穩(wěn)定性。

圖5 微波處理前后米糠谷蛋白的紅外光譜圖

表3 米糠谷蛋白的圓二色譜測(cè)定結(jié)果%

2.3.3 微波處理對(duì)米糠谷蛋白功能性質(zhì)的影響(見表4)

米糠谷蛋白是具有較大空間結(jié)構(gòu)的大分子類物質(zhì)，分子內(nèi)的大量基團(tuán)在受到外界影響時(shí)會(huì)發(fā)生某些變化，進(jìn)而影響其功能性質(zhì)[11]。由表4可知，米糠經(jīng)過微波處理后所提取的米糠谷蛋白功能性質(zhì)發(fā)生改變，溶解性提高了8.12百分點(diǎn)，持水性升高了0.89百分點(diǎn)，持油性降低了0.84百分點(diǎn)。郝天舒等[12]研究發(fā)現(xiàn)，微波處理提高了米糠蛋白的溶解性，可能是與蛋白氨基酸分布有關(guān)。米糠經(jīng)過微波處理后，米糠谷蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致親水基團(tuán)暴露，加劇了蛋白質(zhì)分子的氫鍵和離子基團(tuán)的水合作用，蛋白持水性升高。微波處理后米糠谷蛋白起泡性增加了20.41百分點(diǎn)，泡沫穩(wěn)定性則降低了21.66百分點(diǎn)。這可能是因?yàn)槲⒉ㄌ幚砗螅卓饭鹊鞍捉Y(jié)構(gòu)展開，更易吸附到空氣-水界面上，形成泡沫，這與Adam等[13]的研究結(jié)果一致。微波處理后，米糠谷蛋白乳化穩(wěn)定性增加了5.50百分點(diǎn)，但乳化活性降低了4.61百分點(diǎn)，這可能是微波處理破壞了米糠谷蛋白結(jié)構(gòu)，致使疏水基團(tuán)疏遠(yuǎn)水相，從而降低了乳化活性[14]。

表4 微波處理對(duì)米糠谷蛋白功能性質(zhì)的影響

2.3.4 微波處理對(duì)米糠谷蛋白表面疏水性的影響(見圖6)

圖6 微波功率對(duì)米糠谷蛋白表面疏水性的影響

由圖6可知，隨著微波功率的增加，米糠谷蛋白表面疏水性總體逐漸增加，且均高于未微波處理的。表明微波處理后，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露于蛋白質(zhì)分子表面。

3 結(jié) 論

本研究采用微波輔助Osborne法提取米糠谷蛋白，在微波功率800 W、微波時(shí)間15 min、微波溫度40℃條件下，米糠谷蛋白提取率達(dá)到73.1%。微波處理后米糠谷蛋白α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角向β-折疊轉(zhuǎn)移，β-折疊含量明顯提高。微波處理后，米糠谷蛋白的溶解性提高了8.12百分點(diǎn)，持水性升高了0.89百分點(diǎn)，起泡性增加了20.41百分點(diǎn)，乳化穩(wěn)定性增加了5.50百分點(diǎn)，持油性降低了0.84百分點(diǎn)，乳化活性降低了4.61百分點(diǎn)，泡沫穩(wěn)定性降低了21.66百分點(diǎn)。米糠谷蛋白表面疏水性隨微波功率增加總體逐漸增大。本研究可為米糠谷蛋白的工業(yè)化制備及在各種食品配方中的應(yīng)用提供理論支撐。