大米谷蛋白的堿致變性和結(jié)構(gòu)表征

袁江蘭，常 靜，李傳雯，康 旭

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068）

大米谷蛋白的堿致變性和結(jié)構(gòu)表征

袁江蘭，常 靜，李傳雯，康 旭

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068）

為探究強(qiáng)堿處理大米谷蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化規(guī)律，利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、差示掃描量熱法、表面疏水性分析、掃描電子顯微鏡觀察、脫酰胺分析等方法表征堿處理大米谷蛋白的結(jié)構(gòu)變化，以溶解性、乳化性、起泡性為指標(biāo)表征其性質(zhì)變化。SDS-PAGE和差示掃描量熱分析結(jié)果表明，當(dāng)NaOH溶液濃度大于等于0.08 mol/L時(shí)，谷蛋白發(fā)生完全變性，亞基明顯降解，并且形成大分子聚集物；當(dāng)pH≥12.0時(shí)，谷蛋白溶解度顯著提高，pH值為13.0時(shí)溶解度達(dá)到80%；NaOH溶液濃度大于等于0.1mol/L時(shí)造成大米谷蛋白脫酰胺，分子中谷氨酸含量明顯增加，并且溶解性、表面疏水性和脫酰胺度具有相關(guān)性；掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果表明堿處理導(dǎo)致大米谷蛋白解聚，結(jié)構(gòu)變松散；堿處理改善了大米谷蛋白乳化性和起泡性，以0.5 mol/L NaOH溶液處理120 min為最佳，過(guò)度堿處理會(huì)破壞谷蛋白乳化能力和起泡能力。堿處理改變了谷蛋白結(jié)構(gòu)，從而改善了谷蛋白溶解性、乳化性和起泡性，使其有望在食品或相關(guān)領(lǐng)域中得到有效利用。

大米；谷蛋白；堿處理；結(jié)構(gòu)；性質(zhì)

大米中蛋白質(zhì)含量為6.7%～8.3%，僅次于淀粉含量。大米蛋白主要包括清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白，其中谷蛋白含量超過(guò)80%。大米蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，具有氨基酸組成合理、必需氨基酸含量高、過(guò)敏性低、消化率高等優(yōu)點(diǎn)。大米蛋白中含量最高的谷蛋白是堿溶性蛋白質(zhì)，只能溶解于濃度較高的堿溶液中，而不溶于水。另外，在大米的加工或存放過(guò)程中，其谷蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生進(jìn)一步變化，導(dǎo)致難溶性增加[1]。因此使得大米蛋白的研究和應(yīng)用受限。

食品加工中常用堿處理蛋白質(zhì)，例如雞蛋蛋白質(zhì)受堿作用形成皮蛋風(fēng)味；大豆蛋白用pH 12.0的堿液熱處理，蛋白的溶解性、乳化性和彈性模量均顯著提高[2-3]；蛋白質(zhì)堿熱處理降解產(chǎn)生的氨基酸之間會(huì)形成賴丙復(fù)合物[4]。蛋白質(zhì)分子中的谷氨酰胺、天冬酰胺也可以在較強(qiáng)堿性條件下發(fā)生脫酰胺而變?yōu)楣劝彼岷吞於彼?，從而使蛋白質(zhì)肽鏈趨于舒展[5]。堿處理大麥谷蛋白發(fā)生脫酰胺反應(yīng)，蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)并水解，同時(shí)由于二硫鍵交聯(lián)和疏水作用引起蛋白質(zhì)發(fā)生可溶性聚集，而且乳化穩(wěn)定性比較好[6]。所以合理利用堿處理蛋白質(zhì)，可以使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生改變，功能特性也發(fā)生相應(yīng)改變。

大米谷蛋白由3 種亞基組成，分子質(zhì)量分別約為20、34、43 kD[7]。其分子中谷氨酰胺、天冬酰胺含量較高，易通過(guò)氫鍵、疏水作用等形成致密的大分子蛋白聚合體，因此谷蛋白結(jié)構(gòu)相當(dāng)穩(wěn)定[8]。實(shí)踐中常用較強(qiáng)的堿性條件溶解和處理大米谷蛋白，但關(guān)于強(qiáng)堿性條件下大米谷蛋白結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能特性方面的變化卻鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究了堿處理對(duì)大米谷蛋白結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能特性的影響，為谷蛋白的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粳米（Oryza sativa L.） 市售。

8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）、三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)metyl aminomethane，Tris）、考馬斯亮藍(lán)（G-250，R-250）、β-巰基乙醇 美國(guó)Sigma公司；N,N-甲叉雙丙烯酰胺（N,N’-methylenebisacrylamide，Bis）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 武漢市蓋云天生物技術(shù)有限公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker、甘氨酸 日本Takara公司；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 北京博倫凱鑫科技有限公司；茚三酮 上海三愛(ài)思試劑有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2100紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；FD-1真空冷凍干燥機(jī) 杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；K9860全自動(dòng)凱氏定氮儀 濟(jì)南海能儀器股份有限公司；L8900氨基酸自動(dòng)分析儀、F-7000熒光分光光度計(jì)、S-5500掃描電子顯微鏡 日本日立高新技術(shù)公司；Mini-PROTEAN電泳儀 美國(guó)伯樂(lè)公司；DSC1差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 大米谷蛋白提取

采用堿溶酸沉法[9-10]。將大米粉和一定濃度的NaOH溶液按料液比1∶10（m/V）混合，攪拌4 h，然后5 000 r/min離心30 min，取上清液，再用0.05 mol/L的鹽酸調(diào)等電點(diǎn)至4.8，靜置12 h后將樣品調(diào)至pH 7.0。同樣條件離心取沉淀，再用去離子水洗沉淀3 次除去可溶性的物質(zhì)。在將沉淀用質(zhì)量濃度為5 g/100 mL的NaCl溶液按料液比1∶8（m/V）提取3.5 h后，除去少量的清蛋白和球蛋白，再以同樣條件離心取沉淀，沉淀采用75%乙醇按料液比1∶8（m/V）提取3.5 h后同樣條件離心除去醇溶蛋白。最后冷凍干燥得到谷蛋白凍干粉。

1.3.2 大米谷蛋白純度測(cè)定

通過(guò)凱氏定氮儀測(cè)定各谷蛋白凍干粉樣品中蛋白質(zhì)含量，并通過(guò)式（1）計(jì)算大米谷蛋白純度。

1.3.3 大米谷蛋白電泳分析

參考Laemmli的方法[11]，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）分析各谷蛋白凍干粉亞基組成及分子質(zhì)量。將不同濃度堿液提取的大米谷蛋白凍干粉樣品和樣品緩沖液按1∶1（m/V）混合，然后加熱3 min，10 000r/min離心5min，取10 μL上樣。其中分離膠為12%，濃縮膠為4%。

1.3.4 DSC分析

稱取2 mg谷蛋白凍干粉置于密封的鋁制坩堝中，用DSC儀測(cè)定谷蛋白熱特性曲線，溫度掃描范圍為20～120 ℃，掃描速率為10 ℃/min，Al2O3石英管作參比。

1.3.5 蛋白脫酰胺度測(cè)定

大米谷蛋白凍干樣品分散于NaOH溶液中，制得5 g/100 mL谷蛋白分散液，室溫條件下攪拌30 min后于70 ℃恒溫水浴鍋中攪拌60 min使其發(fā)生脫酰胺反應(yīng)。然后快速冷卻至室溫，用0.5 mol/L HCl溶液調(diào)整溶液至中性pH值，透析除鹽，凍干。然后稱取0.1 g凍干樣品，加入3 mol/L HCl溶液5 mL，密封于消化管中，120 ℃恒溫水解3 h。冷卻后用自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定水解后樣品的含氮量，按式（2）計(jì)算脫酰胺度。

式中：C0為未處理大米谷蛋白含氮量/%；CN為堿處理后大米谷蛋白含氮量/%。

1.3.6 大米谷蛋白溶解度測(cè)定

采用Bradford法[12]。稱取脫酰胺谷蛋白凍干粉7 mg，分散于10 mL蒸餾水中，室溫條件下攪拌30 min后10 000 r/min離心10 min取上清液，測(cè)定上清液蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。所有數(shù)據(jù)均為3 次測(cè)定的平均值。并按式（3）計(jì)算溶解度。

式中：m0為上清液中谷蛋白的總質(zhì)量/mg；m1為凍干樣品中谷蛋白的總質(zhì)量/mg。

1.3.7 大米谷蛋白表面疏水性測(cè)定

表面疏水性采用ANS熒光探針?lè)╗13]。稱取一定量大米谷蛋白分散于0.5 mol/L NaOH溶液中制成5 g/100 mL的蛋白分散液，室溫條件下攪拌30 min后于70 ℃恒溫?cái)嚢璨煌瑫r(shí)間（40、80、120、160、240 min）取樣，然后快速冷卻至室溫，用0.5 mol/L HCl溶液調(diào)整pH值至中性，透析除鹽，凍干。

將上述不同時(shí)間取樣的凍干樣品溶于pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，分別制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的溶液，取4 mL，加入8 mmol/L ANS儲(chǔ)備液20 μL，振蕩均勻后用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光強(qiáng)度。激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為390 nm和470 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5 nm。以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)量濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率作為蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)。

1.3.8 大米谷蛋白谷氨酸含量測(cè)定

將1.3.7節(jié)制得的不同時(shí)間取樣的凍干樣品加入6 mol/L HCl溶液中，然后置于110 ℃馬弗爐中水解24 h，再用0.02 mol/L鹽酸稀釋至204 μg/mL，通過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾后用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定谷氨酸含量。分離柱為離子交換柱（4.6 mm×60 mm），進(jìn)樣量10 μL。泵1流速為0.40 mL/min；泵2流速為0.35 mL/min。分離柱溫57 ℃，反應(yīng)柱溫135 ℃。通道一檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm；通道二檢測(cè)波長(zhǎng)440 nm。最后用外標(biāo)峰面積法計(jì)算樣品谷氨酸含量。

1.3.9 大米谷蛋白乳化性測(cè)定

采用分光光度法。將色拉油與1.3.7節(jié)攪拌不同時(shí)間制得的大米谷蛋白凍干樣品溶液按照體積比1∶3混合后，經(jīng)過(guò)均質(zhì)機(jī)10 000 r/min處理后制成乳濁液。然后再將100 μL的乳濁液置于50 mL的燒杯中，用0.1% SDS稀釋到10 mL，測(cè)定500 nm波長(zhǎng)處吸光度（A1），表征乳化能力；10 min后再次測(cè)定記為（A2），按公式（4）計(jì)算乳化穩(wěn)定性。

1.3.10 大米谷蛋白起泡性測(cè)定

將1.3.7節(jié)攪拌不同時(shí)間制得的大米谷蛋白凍干樣品制成2 g/100 mL的分散液，置于500 mL的量筒中，10 000 r/min、40 s均質(zhì)3 次。記下此時(shí)液面的體積V1/mL，靜置30 min后再次讀取液面的體積V2/mL。起泡能力及起泡穩(wěn)定性按式（5）、（6）計(jì)算。

1.3.11 掃描電子顯微鏡觀察

將1.3.7節(jié)攪拌不同時(shí)間制得的大米谷蛋白凍干樣品進(jìn)行噴金處理，然后采用掃描電子顯微鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)樣品均做3 個(gè)平行，每個(gè)平行測(cè)定重復(fù)3 次，取平均值，結(jié)果用表示。采用Origin 8.0軟件處理和分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿法提取大米谷蛋白的純度

圖1 堿法提取的大米谷蛋白純度Fig. 1 Purity of alkali extractable rice glutelin

由圖1可知，NaOH濃度為0.02～0.08 mol/L時(shí)，提取物中谷蛋白純度隨NaOH濃度增加而增加，當(dāng)NaOH濃度為0.10 mol/L時(shí)，提取物谷蛋白純度明顯下降，可能是因?yàn)镹aOH濃度過(guò)高導(dǎo)致大米淀粉糊化[14]，同時(shí)部分淀粉及其他成分也溶于強(qiáng)堿溶液，雜質(zhì)增加，從而使谷蛋白純度明顯下降。0.05、0.08 mol/L NaOH溶液提取物的谷蛋白純度差別不明顯，同時(shí)考慮到較高濃度堿對(duì)谷蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響，綜合分析，采用0.05 mol/L NaOH溶液提取大米谷蛋白較為宜。

2.2 堿法提取大米谷蛋白亞基和分子質(zhì)量

天然的大米谷蛋白由亞基聚合而形成，每一個(gè)亞基又由一條α肽鏈和一條β肽鏈通過(guò)一個(gè)二硫鍵共價(jià)連接組成[15]，由圖2可知，不同濃度堿液提取的大米谷蛋白3 條亞基有明顯區(qū)別，在NaOH濃度為0.02、0.05 mol/L時(shí)，3 條亞基條帶較清晰，當(dāng)NaOH濃度增大到0.08 mol/L時(shí)，大米谷蛋白亞基條帶顏色變淺，各亞基均有彌散，特別是分子質(zhì)量約為44.3 kD的亞基基本消失，同時(shí)在分離膠的頂部有1 條較清晰的沉積帶，很可能與谷蛋白的變性聚集有關(guān)。大米谷蛋白經(jīng)過(guò)多次酸堿處理會(huì)使蛋白質(zhì)部分分子發(fā)生變性聚集[16]，稀堿處理使雞蛋蛋清蛋白也產(chǎn)生了同樣的聚集結(jié)構(gòu)[17]。當(dāng)NaOH濃度增大到0.10 mol/L時(shí)，3 條亞基條帶進(jìn)一步變淺，分子質(zhì)量約為44.3 kD的亞基消失，同時(shí)在分離膠的頂部有一條更加清晰的沉積帶。經(jīng)過(guò)強(qiáng)堿作用的大米谷蛋白，很可能變性聚集和降解同時(shí)存在，堿性越強(qiáng)，聚集程度越高，同時(shí)降解也越明顯。顯然，低于0.05 mol/L的NaOH溶液對(duì)谷蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)影響較小，堿液濃度升高則谷蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，大麥谷蛋白也具有相似情況，當(dāng)用0.1、0.5mol/L NaOH溶液處理大麥谷蛋白時(shí)，起始階段即發(fā)生迅速而廣泛的水解作用，并且隨堿濃度增大水解程度加深，但是隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，水解產(chǎn)物濃度降低同時(shí)出現(xiàn)了新的聚集物，說(shuō)明水解物有聚集成大分子的趨勢(shì)[6]。

圖2 大米谷蛋白亞基和分子質(zhì)量Fig. 2 Subunit composition and molecular mass of rice glutelin

2.3 堿法提取大米谷蛋白DSC的變化

圖3 堿液提取的大米谷蛋白DSC變化Fig. 3 DSC curves of alkali extractable rice glutelin

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)發(fā)生變性時(shí)，其結(jié)構(gòu)一般表現(xiàn)為從有序到無(wú)序，從折疊到展開(kāi)，高級(jí)結(jié)構(gòu)展開(kāi)時(shí)會(huì)吸收熱量，通過(guò)DSC測(cè)定可以反應(yīng)大米谷蛋白是否發(fā)生變性。由圖3可知，0.02 mol/L NaOH溶液提取的大米谷蛋白有明顯的變性峰，變性溫度為72.5 ℃，而0.05 mol/L NaOH溶液提取的大米谷蛋白也有明顯的變性峰，但變性溫度降低至71.8 ℃，變性溫度逐漸降低，這是因?yàn)殡S著堿濃度的增大，堿導(dǎo)致的變性作用越來(lái)越明顯，結(jié)構(gòu)逐漸展開(kāi)，因此變性溫度隨之降低[18]。當(dāng)NaOH濃度大于等于0.08 mol/L時(shí)，變性峰消失，幾乎呈一條直線，說(shuō)明大米谷蛋白已經(jīng)在堿的作用下完全變性。當(dāng)堿液濃度低于0.05 mol/L時(shí)，隨著NaOH濃度的升高，維系高級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力趨向于被部分打破，谷蛋白分子逐漸趨于變性，但高級(jí)結(jié)構(gòu)尚能維系。當(dāng)NaOH濃度達(dá)到0.08 mol/L時(shí)，谷蛋白分子內(nèi)原有的非化學(xué)鍵作用力被破壞，谷蛋白去折疊，發(fā)生變性，也因此可能導(dǎo)致聚集和降解的發(fā)生[19]。DSC結(jié)果與SDS-PAGE結(jié)果一致。

2.4 堿法提取大米谷蛋白對(duì)溶解度和脫酰胺度的影響

圖4 堿濃度對(duì)大米谷蛋白脫酰胺度和溶解度的影響Fig. 4 Effect of alkali concentration on deamidation degree and solubility of rice glutelin

由圖4可知，當(dāng)NaOH濃度低于0.1 mol/L時(shí)，谷蛋白未發(fā)生明顯的脫酰胺，當(dāng)NaOH濃度超過(guò)0.1 mol/L時(shí)，脫酰胺度和溶解度均隨著NaOH濃度的增加而增加。NaOH濃度為0.0～0.5 mol/L時(shí)，溶解性增加趨勢(shì)明顯，但是當(dāng)NaOH濃度大于0.5 mol/mL時(shí)，溶解度增加趨勢(shì)變緩。溶解度的變化和脫酰胺度的變化并未呈現(xiàn)明顯的正比關(guān)系，說(shuō)明脫酰胺只是影響谷蛋白溶解度的因素之一。較高濃度堿液導(dǎo)致谷蛋白不可逆變性，當(dāng)pH值恢復(fù)至中性時(shí)，變性谷蛋白發(fā)生聚集，反而會(huì)降低谷蛋白溶解度[20]。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，谷蛋白去折疊并進(jìn)一步水解，這種結(jié)構(gòu)上的改變會(huì)導(dǎo)致更多電荷和極性基團(tuán)暴露于水中，從而促進(jìn)了蛋白質(zhì)-水相互作用，使溶解度增加[21]。因此谷蛋白溶解度的變化是多因素綜合作用的結(jié)果。

2.5 堿法提取對(duì)大米谷蛋白表面疏水性的影響

圖5 堿熱處理對(duì)大米谷蛋白的表面疏水性影響Fig. 5 Effect of heating time on surface hydrohobicity of rice glutelin

由于脯氨酸、亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等非極性氨基酸含量較高，谷蛋白具有很強(qiáng)的疏水性[22]，與其他分子相互作用的主要驅(qū)動(dòng)力也是疏水作用力[23]。谷蛋白中谷氨酰胺和天冬酰胺含量較高，使其極性進(jìn)一步降低，因而溶解性很差。堿處理導(dǎo)致谷蛋白脫酰胺，極性增加，疏水性降低，溶解度隨之增加，結(jié)果如圖5所示。0.5 mol/L NaOH溶液處理的大米谷蛋白，隨著堿熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，表面疏水性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。當(dāng)處理時(shí)間超過(guò)120 min時(shí)，表面疏水性指數(shù)趨于穩(wěn)定。大麥谷蛋白用0.1 mol/L NaOH溶液處理時(shí)，80 min內(nèi)表面疏水性顯著上升，脫酰胺度也增加至5.6%，用0.5 mol/L NaOH溶液處理超過(guò)90 min，脫酰胺度持續(xù)增加，但表面疏水性趨于穩(wěn)定，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)水解度持續(xù)增加[6]。說(shuō)明堿處理時(shí)蛋白質(zhì)的疏水性變化與脫酰胺、水解具有相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)濃度處理的谷蛋白分子發(fā)生3 種主要的變化：一是分子變性，空間結(jié)構(gòu)趨于舒展，部分內(nèi)部基團(tuán)暴露；二是脫酰胺；三是分子部分降解。這3 種變化均會(huì)導(dǎo)致谷蛋白表面疏水性發(fā)生變化。

2.6 堿法提取對(duì)大米谷蛋白谷氨酸含量的影響

圖6 堿處理大米谷蛋白谷氨酸含量Fig. 6 Glutamic acid content of rice glutelin after different heating times

由圖6可知，0.5 mol/L NaOH溶液處理的大米谷蛋白隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，谷氨酸含量逐漸增加。這一變化與脫酰胺度隨時(shí)間增加有關(guān)。谷氨酸含量增加使大米谷蛋白極性增大，疏水性降低。蛋白質(zhì)脫酰胺使谷氨酰胺和天冬酰胺中的酰胺基轉(zhuǎn)變?yōu)轸然?，最終成為谷氨酸和天冬氨酸[24]。因此在對(duì)大米谷蛋白堿熱處理的過(guò)程中，谷氨酸含量的增加也說(shuō)明谷蛋白發(fā)生了脫酰胺。

2.7 堿法提取對(duì)大米谷蛋白乳化性和起泡性的影響

圖7 堿熱處理對(duì)大米谷蛋白乳化性（a）和起泡性（b）的影響Fig. 7 Effect of alkali and heating treatment on emulsifying properties (a)and foamability (b) of rice glutelin

如圖7a所示，與未處理的大米谷蛋白相比，經(jīng)堿處理后乳化性總體上有提高的趨勢(shì)，當(dāng)熱堿處理時(shí)間為0～120 min時(shí)，乳化能力明顯增加，由0.578增大到0.896。隨后乳化能力又逐漸降低，乳化穩(wěn)定性的變化趨勢(shì)與乳化能力變化趨勢(shì)保持一致，但乳化能力變化規(guī)律與大麥谷蛋白有很大區(qū)別，而與很多其他蛋白如大豆蛋白、玉米蛋白等規(guī)律一致，即適度的脫酰胺改善了蛋白質(zhì)的乳化能力，而過(guò)度脫酰胺則破壞了蛋白質(zhì)的乳化能力，從而減少蛋白質(zhì)的可利用性[25]。溶解性可以作為決定蛋白質(zhì)功能特性的重要因素，溶解性良好的蛋白一般都具有良好的功能性質(zhì)[26]。溶解性的改善有利于功能特性的改善，從而拓寬蛋白質(zhì)的應(yīng)用范圍[5]。所以經(jīng)過(guò)堿處理的大米谷蛋白乳化性提高可歸因于溶解性增加，可溶性蛋白具有表面活性，易于吸附于油-水界面，但是乳化性也受溶解蛋白結(jié)構(gòu)影響[27]，堿處理時(shí)間延長(zhǎng)導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)持續(xù)變化，一定程度的降解和高級(jí)結(jié)構(gòu)的展開(kāi)等結(jié)構(gòu)變化均會(huì)直接影響大米谷蛋白的乳化性[28]。適度降解導(dǎo)致難溶蛋白乳化性顯著提高[29]。

如圖7b所示，在0～120 min期間，起泡性逐漸增大，這與大米谷蛋白的溶解性存在相關(guān)性，在強(qiáng)堿溶液中，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，谷蛋白溶解性逐漸增加，從而更易在空氣泡表面形成剛性膜狀結(jié)構(gòu)并且產(chǎn)生更多空氣泡，增加了起泡性[30]。當(dāng)處理時(shí)間超過(guò)120 min后，起泡性又呈明顯下降趨勢(shì)，說(shuō)明起泡性還與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)具有相關(guān)性，長(zhǎng)時(shí)間堿性條件下加熱使谷蛋白降解，空間結(jié)構(gòu)也發(fā)生明顯改變，對(duì)起泡能力影響顯著。起泡穩(wěn)定性和起泡性的變化趨勢(shì)基本一致。

圖8 大米谷蛋白超微結(jié)構(gòu)（×2 500）Fig. 8 Ultrastructure of rice glutelin (× 2 500)

由圖8可知，未經(jīng)堿處理的大米谷蛋白聚集成團(tuán)，結(jié)構(gòu)十分緊湊，沒(méi)有明顯孔隙。堿處理40 min時(shí)，結(jié)構(gòu)變得松散，大米谷蛋白聚集體開(kāi)始解體。堿處理超過(guò)120 min，聚集體進(jìn)一步解體，形成細(xì)小狀碎片，且隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，形成的碎片越來(lái)越小。說(shuō)明經(jīng)過(guò)堿處理，大米谷蛋白逐漸解聚，結(jié)構(gòu)變松散，蛋白質(zhì)發(fā)生明顯降解。

3 結(jié) 論

大米谷蛋白是堿溶性蛋白質(zhì)，在強(qiáng)堿條件下溶解性較好，并且相對(duì)穩(wěn)定，但是其溶解性、穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)等和強(qiáng)堿溶液的濃度相關(guān)。當(dāng)強(qiáng)堿液濃度低于0.05 mol/L時(shí)，大米谷蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)未發(fā)生明顯變化，而溶解度大幅度提高。更高濃度的堿液導(dǎo)致大米谷蛋白明顯變性和降解，谷蛋白發(fā)生明顯的脫酰胺反應(yīng)，谷氨酸含量增加，表面疏水性逐漸減弱，起泡性和乳化性也發(fā)生變化，但起泡性和乳化性的變化與水解程度非正相關(guān)，適度的水解有利于提高其起泡性和乳化性。關(guān)于強(qiáng)堿性條件下大米谷蛋白結(jié)構(gòu)變化尚有待進(jìn)一步深入研究。

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Alkali Denaturation and Structural Characterizations of Rice Glutelin

YUAN Jianglan, CHANG Jing, LI Chuanwen, KANG Xu
(School of Food and Biological Engineering, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China)

The changes in the structure and properties of rice glutelin after alkali treatment were explored. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), automatic amino acid analyzer, differential scanning calorimetry(DSC), surface hydrophobicity analysis, scanning electron microscopy (SEM) and deamidization analysis were applied to elucidate the structure of rice glutelin, and solubility, emulsifying properties and foamability were determined to clarify the change of its properties. The results from SDS-PAGE and DSC showed that rice glutelin was denaturated completely,when the concentration of sodium hydride was 0.08 mol/L or higher, causing considerable degradation of subunits and the formation of macromolecular aggregates. When pH was 12.0 or higher, glutelin solubility increased significantly and reached 80% at pH 13.0. Alkali at high concentration above 0.1 mol/L caused deamidization, leading to a significant increase of glutamate content in the glutelin molecule, and the degree of deamidization was correlated with solubility and surface hydrophobicity. Results from SEM showed that alkali treatment led to the degradation and more loose structure of rice glutelin. Appropriate alkali treatment improved the emulsifying properties and foamability of rice glutelin, and the optimum condition was treatment of rice glutelin for 120 min with 0.5 mol/L NaOH solution, but excessive alkali treatment could destroy its emulsification properties and foamability. Proper alkali treatment changed the structure of rice glutelin and accordingly improved its solubility, emulsifying properties and foamability, which is expected to be effectively utilized in food or related fields.

rice; glutelin; alkali treatment; structure; properties

10.7506/spkx1002-6630-201721007

Q518.4

A

1002-6630（2017）21-0043-06

袁江蘭, 常靜, 李傳雯, 等. 大米谷蛋白的堿致變性和結(jié)構(gòu)表征[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(21): 43-48.

10.7506/spkx1002-6630-201721007. http://www.spkx.net.cn

YUAN Jianglan, CHANG Jing, LI Chuanwen, et al. Alkali denaturation and structural characterizations of rice glutelin[J].Food Science, 2017, 38(21): 43-48. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721007.http://www.spkx.net.cn

2016-07-10

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371741）

袁江蘭（1970—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称返鞍踪|(zhì)。E-mail：jlyuan1229@163.com