氣相色譜外標法測定蛋黃卵磷脂(供注射用)中7種脂肪酸含量

溫愷嘉，梁北梅，李詠華，林元亨，唐順之，許文東

(廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司 中藥提取分離過程現(xiàn)代化國家工程研究中心, 廣東省藥用脂質(zhì)重點實驗室，廣州510240)

蛋黃卵磷脂是從蛋黃中提取并精制得到的天然磷脂混合物，主要成分為磷脂酰膽堿[1-3]，具有較好的乳化、分散、消泡等特性，被廣泛用于脂肪乳、脂質(zhì)體等特殊注射劑種[4-6]。當作為各類腸外營養(yǎng)劑、載藥脂肪乳輔料或產(chǎn)品中的蛋黃卵磷脂用量達10%或以上時，需考察蛋黃卵磷脂脂肪酸含量。

目前，國內(nèi)暫無權(quán)威資料收錄蛋黃卵磷脂脂肪酸測定方法，而脂質(zhì)類脂肪酸測定方法在《中國藥典》四部與GB 5009.168—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》均有收錄。但國標方法前處理復(fù)雜，氣相運行時間需90 min，測定效率低?！吨袊幍洹匪牟可婕爸|(zhì)脂肪酸測定方法在大豆油、橄欖油、山崳酸甘油酯、月桂酰聚氧乙烯甘油酯、油酸山梨坦、氫化大豆油、氫化蓖麻油等品種中均有收錄，其中大豆油脂肪酸測定方法與橄欖油、山崳酸甘油酯、氫化蓖麻油脂肪酸測定方法完全一致，說明該法適用范圍廣，因此本文選擇中國藥典四部《大豆油》脂肪酸項(下稱“大豆油中典方法”)為參考，通過適度優(yōu)化，建立一種適用于蛋黃卵磷脂(供注射用)脂肪酸含量測定方法，該方法經(jīng)過方法學驗證，可應(yīng)用到企業(yè)內(nèi)控及小試研究中，為日后的分析工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

蛋黃卵磷脂(供注射用)樣品(批號I30181201、I30181202、I30181203)，廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司。

棕櫚酸甲酯(BCBV7285，99.0%)、硬脂酸甲酯(GCBV9730，99.5%)、油酸甲酯(BCBR9854V，99.0%)、亞油酸甲酯(BCBV3078，98.5%)、花生四烯酸甲酯(SLBV7453，100.0%)標準品，Sigma公司；棕櫚油酸甲酯(92720046，99.0%)、二十二碳六烯酸甲酯(Z9920150，99.0%)標準品，ANPEL公司；正庚烷、甲醇、氫氧化鈉、氯化鈉、無水硫酸鈉，均為分析純，廣州化學試劑廠；14%三氟化硼甲醇溶液，分析純，美國Sigma公司。

安捷倫7890A氣相色譜儀(搭配FID檢測器)，賽默飛變色龍色譜工作站，島津AP225WD電子天平，明澈-D 24UV純水/超純水系統(tǒng)，SGH-500型恒溫水浴鍋，HWS-26氫氣發(fā)生器，高純氮氣(純度≥99.999%)，干燥空氣。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

Agilent DB-WAX毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為高純氮氣(純度≥99.999%)，恒流流速1.0 mL/min；柱升溫程序為初始溫度210℃，保持10 min，以8℃/min速率升至250℃，保持35 min，共運行50 min；進樣口溫度260℃；檢測器溫度270℃；進樣量1 μL；分流進樣，分流比50∶1;空氣流速300 mL/min；氫氣流速30 mL/min。

1.2.2 標準曲線的制作

1.2.2.1 單一標準品儲備液的配制

分別精密稱取棕櫚酸甲酯標準品200 mg、棕櫚油酸甲酯標準品10 mg、硬脂酸甲酯標準品100 mg、油酸甲酯標準品200 mg、亞油酸甲酯標準品100 mg、花生四烯酸甲酯標準品100 mg、二十二碳六烯酸甲酯標準品10 mg，以正庚烷溶解并定容至10 mL，得7種單一標準品儲備液。

1.2.2.2 系列混合標準工作液的配制

取1.2.2.1單一標準品儲備液，按表1以正庚烷依次稀釋成6個級別含7種標準品的系列混合標準工作液。

表1 6個級別系列混合標準工作液質(zhì)量濃度

1.2.2.3 標準曲線的繪制

取一定量表1中的系列混合標準工作液，按照1.2.1的色譜條件進行氣相色譜分析，每個級別混合標準工作液連續(xù)進樣3次，以各組分質(zhì)量濃度(x)為橫坐標，各組分峰面積均值(y)為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.3 樣品的前處理

稱取蛋黃卵磷脂(供注射用)樣品0.1 g，置于20 mL具塞試管中，加0.5 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液2 mL，在65℃水浴中加熱30 min，加入14%三氟化硼甲醇溶液2 mL，在65℃水浴中加熱30 min，取出放冷，精密加入正庚烷4.0 mL，密塞振搖2 min后，將液體轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加飽和氯化鈉溶液10 mL，搖勻，靜置使分層，取上層液，純水洗滌3次，每次2 mL，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后作為樣品溶液，待測。

1.2.4 脂肪酸含量的測定

取空白溶劑(正庚烷)、系列混合標準工作液、樣品溶液，按1.2.1色譜條件一次進樣，記錄色譜圖，根據(jù)保留時間定性，由標準曲線求得試樣中7種脂肪酸的質(zhì)量濃度，外標法定量，7種脂肪酸含量按下式計算。

(1)

式中：X為樣品中各脂肪酸的含量；ρ為樣品溶液中各脂肪酸甲酯的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為樣品溶液加入正庚烷的體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g；f為系數(shù)，7種脂肪酸對應(yīng)的系數(shù)值參照GB 5009.168—2016。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品定量方法的選擇

依據(jù)GB 5009.168—2016，脂肪酸含量測定的定量方法有3種，分別為峰面積歸一化法、外標法、內(nèi)標法。峰面積歸一化法多用于高純度的植物油類(如大豆油、橄欖油等)定量，適用于相對定量[7-9]；其他成分較復(fù)雜的物質(zhì)，樣品中含有一定量的未甲酯化成分，應(yīng)進行絕對定量，外標法、內(nèi)標法精準[10-11]，更適合采用。取批號I30181201的樣品，按1.2.3方法制備樣品溶液，分別按3種定量方法在1.2.1色譜條件下測定(內(nèi)標物選擇山崳酸甲酯)脂肪酸含量，結(jié)果見表2。由表2可看出，3種定量方法所得測定值各不相同?？紤]到需體現(xiàn)樣品中其他雜質(zhì)的含量，需進行絕對定量，因此選擇外標法與內(nèi)標法定量更合適，按上述條件對外標法和內(nèi)標法的脂肪酸回收率進行測定，對比兩種定量方法的準確度，結(jié)果見表3。由表3可看出，外標法的回收率更合理，因此選擇外標法作為定量方法。

表2 3種定量方法得到的脂肪酸含量對比 %

表3 2種定量方法的回收率對比 %

2.2 前處理方法考察

2.2.1 甲酯化加熱方式考察

根據(jù)大豆油中典方法，甲酯化加熱采用錐形瓶及回流管進行，容器內(nèi)表面積較大。實驗發(fā)現(xiàn)，樣品甲酯化樣液只有8 mL，容器內(nèi)表面積大易造成目標成分附著瓶壁，不利于樣液轉(zhuǎn)移。因此，本實驗采取具塞試管直接水浴加熱法，減少樣液接觸的容器內(nèi)表面積從而減少誤差引入。

2.2.2 提取方式考察

根據(jù)大豆油中典方法，甲酯化完成后，精密加入提取溶劑在65℃加熱提取一定時間，取出冷卻至室溫后再振蕩提取一定時間。本方法去除加熱步驟，在加入正庚烷后室溫振搖提取，通過對兩種提取方式分別進行準確度驗證發(fā)現(xiàn)，二者回收率相當。因此，本實驗選擇加入正庚烷室溫下振搖提取，既簡化實驗過程，又節(jié)省了時間。

2.3 起始柱溫考察

取1.2.2.2中的第3級別混合標準工作液分別在起始溫度為210℃與230℃，其他條件不變的情況下進樣，記錄色譜圖，不同起始柱溫色譜圖對比結(jié)果見圖1。

由圖1可知，色譜條件的起始柱溫采用210℃，該溫度能使各組分峰達到基線分離。若以大豆油中典方法的230℃為起始柱溫，則無法完全實現(xiàn)基線分離。

注：1.棕櫚酸甲酯；2.棕櫚油酸甲酯；3.硬脂酸甲酯；4.油酸甲酯；5.亞油酸甲酯；6.花生四烯酸甲酯；7.二十二碳六烯酸甲酯。下同

2.4 樣品專屬性考察

按照1.2.3的方法，分別取純水0.1 g以及批號I30181201的樣品與1.2.2.2中的第3級別混合標準工作液，制備空白溶液、樣品溶液、對照溶液，并將樣品溶液與混合標準工作液按1∶1混合，制備樣品加標溶液。精密吸取上述溶液1 μL，按照1.2.1色譜條件進樣檢測，進行樣品專屬性考察，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可看出，本方法的樣品的專屬性符合規(guī)定。

注：A.空白溶液；B.對照溶液；C.樣品溶液；D.樣品加標溶液。

2.5 線性關(guān)系考察

按照1.2.2方法繪制標準曲線，得到7種脂肪酸甲酯的標準曲線方程、相關(guān)系數(shù)(R2)及線性范圍，結(jié)果見表4。由表4可看出，在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，7種脂肪酸甲酯質(zhì)量濃度與對應(yīng)的峰面積的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.999。

表4 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.6 精密度實驗

取批號I30181201的樣品，按1.2.3方法處理，按1.2.1色譜條件進行分析，進行重復(fù)性與中間精密度實驗，其均值與相對標準偏差(RSD)見表5。由表5可知，本方法精密度良好。

表5 精密度實驗結(jié)果(n=6)

2.7 準確度驗證

取批號I30181201的樣品，按照本文建立的方法對7種脂肪酸進行加標回收率實驗，回收率均值見表3，7種脂肪酸回收率RSD依次為棕櫚酸1.9%、棕櫚油酸1.8%、硬脂酸0.6%、油酸1.2%、亞油酸0.6%、花生四烯酸0.7%、二十二碳六烯酸1.1%，符合準確度要求。

2.8 溶液穩(wěn)定性實驗

取批號I30181201的樣品，按1.2.3方法制備樣品溶液1份，分別在0、2、4、6、8、12、18、24、36 h內(nèi)，將溶液在1.2.1色譜條件下反復(fù)進樣，7種脂肪酸峰面積RSD均小于3%，說明溶液穩(wěn)定性在36 h內(nèi)保持良好。

2.9 系統(tǒng)耐用性考察

通過改變不同的氮氣流速、不同的進樣口/檢測器溫度、同一型號不同批號的色譜柱共4個單因素條件，分別進行7種脂肪酸含量測定，比較4個因素及原始條件下7種脂肪酸含量的測定結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4個單因素條件下得到的7種脂肪酸含量的RSD均小于3%，表明條件微小變動對各組分含量測定結(jié)果影響不大。

2.10 樣品測定

取蛋黃卵磷脂(供注射用)樣品3批，按1.2.3方法進行處理，在1.2.1色譜條件下測定其中的7種脂肪酸含量，每批樣品平行制備3份樣品，結(jié)果見表6。由表6可知，蛋黃卵磷脂(供注射用)中棕櫚酸、油酸、亞油酸、硬脂酸含量較高。計算每批次7種脂肪酸的RSD，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每批次7種脂肪酸的RSD均小于等于2%，數(shù)據(jù)符合精密度要求，表明該方法可用于蛋黃卵磷脂(供注射用)7種脂肪酸含量的測定。

表6 3批蛋黃卵磷脂(供注射用)脂肪酸含量測定結(jié)果(n=3) %

3 結(jié) 論

本研究以大豆油中典方法為參考依據(jù)，分別對定量方法、前處理方法、色譜條件進行優(yōu)化與考察，以優(yōu)化的條件進行線性、精密度、準確度、穩(wěn)定性、耐用性的考察，證實該方法適用于蛋黃卵磷脂(供注射用)中7種脂肪酸含量的測定。筆者也將本方法進行了拓展，將其應(yīng)用于蛋黃卵磷脂粗品、脫油蛋黃粉等樣品的脂肪酸含量測定中，均能達到較好的精密度與準確度，為日后工藝研究及產(chǎn)品脂肪酸來源考察，提供了可靠的分析與控制手段。