發(fā)酵劑抗氧化活性對發(fā)酵肉制品品質的影響研究進展

劉英麗，于青林，萬 真，李洪巖，劉 潔，王 靜

（北京工商大學食品與健康學院，中國-加拿大食品營養(yǎng)與健康聯合實驗室（北京），北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京 100048）

發(fā)酵肉制品是指原料肉在特定的溫度和濕度條件下，經微生物或酶的發(fā)酵作用而制成的具有較長貨架期以及特殊風味、質地和色澤的肉制品[1]。發(fā)酵肉制品歷史悠久、種類繁多，一般可分為以薩拉米香腸、廣式臘腸、中式香腸為代表的發(fā)酵香腸類和以金華火腿、宣威火腿、帕爾瑪火腿為代表的發(fā)酵火腿類；此外，廣義上來說，以臘肉、板鴨、酸肉為代表的中國傳統腌臘肉制品也均屬于發(fā)酵肉制品[2-3]。蛋白質和脂肪作為發(fā)酵肉制品中最重要的組成成分，其在生產加工過程中極易發(fā)生氧化降解，從而影響產品的品質。在發(fā)酵及成熟過程中，蛋白質水解生成短肽和游離氨基酸等物質，在微生物作用下繼續(xù)降解生成醛、酸和酯等，蛋白質適度降解可以改善產品的營養(yǎng)價值和風味，而蛋白質的過度氧化會對肉的質地、保水性和風味等產生不利影響，此外，蛋白質的氧化誘導還可能會影響其消化利用率，降低肉制品的營養(yǎng)價值[1,4-5]。脂肪氧化除直接產生己醛、2-壬烯醛、2,4-壬二烯醛、丁酸乙酯和1-辛烯-3-醇等揮發(fā)性風味化合物外，其氧化降解產物還能進一步參與美拉德反應，從而賦予發(fā)酵肉制品獨特濃郁的風味[6]。適度的脂肪氧化可以改善肉制品風味、提升品質，但過度氧化會產生酸敗味、哈喇味，使發(fā)酵肉制品失去良好色澤和質構品質，縮短產品的貨架期，影響消費者的接受程度，甚至會產生丙二醛、戊醛、4-羥基壬醛等有毒物質，對人體健康造成威脅[7-8]。因此，在發(fā)酵肉制品加工及流通過程中，如何抑制肉制品中脂肪和蛋白質的過度氧化受到廣泛關注。

目前，肉制品企業(yè)常通過添加天然或人工合成抗氧化劑來抑制產品的過度氧化，延長發(fā)酵制品的保藏期，常用的抗氧化劑主要有丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯、異抗壞血酸、茶多酚和迷迭香等[9-10]。隨著毒理學研究的深入，對于在肉質品中添加合成抗氧化劑的安全性受到質疑，有研究表明多種合成抗氧化劑具有潛在安全風險[11]。例如大量攝入丁基羥基茴香醚可誘發(fā)大鼠前胃癌[12]；二丁基羥基甲苯會促進甲狀腺癌和膀胱癌的發(fā)生[13]；過量攝入沒食子酸丙酯的不良反應包括腎臟損傷、胃刺激以及過敏反應等[14]。同時天然抗氧化劑的使用因來源及工藝等原因而發(fā)展受限。發(fā)酵劑作為肉類發(fā)酵過程中必不可少的加工助劑，在發(fā)酵肉制品中的作用被廣泛研究，一些功能性發(fā)酵劑被發(fā)現具有抗癌[15]、抗氧化[16]、降低膽固醇[17]等功能。Zhang Yulong等[18]對分離自發(fā)酵酸肉中的彎曲乳桿菌SR6和副干酪乳桿菌SR10-1的抗氧化活性進行了測定，其中彎曲乳桿菌SR6具有較高的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率和還原力，副干酪乳桿菌SR10-1具有較高的羥自由基清除率和脂質過氧化抑制能力。Kantachote等[19]使用產γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的發(fā)酵劑——戊糖片球菌HN8和納木雷氏乳桿菌NH2混合發(fā)酵泰國發(fā)酵豬肉香腸，發(fā)現與對照組相比，混合發(fā)酵劑的使用顯著降低了該香腸中生物胺和膽固醇的含量，同時提高了GABA水平。本文對脂肪與蛋白質的氧化、發(fā)酵肉制品中常見發(fā)酵劑的種類、抗氧化活性、抗氧化酶系以及抗氧化評價方法的研究進展進行綜述，以期為功能性發(fā)酵劑在發(fā)酵肉制品中抗氧化性的研究及應用提供參考依據。

1 發(fā)酵肉制品中脂肪和蛋白質的氧化

1.1 脂肪的氧化

根據氧化過程中有無酶的參與，脂肪氧化可分為酶促氧化和非酶促氧化，后者又被稱為自動氧化，在發(fā)酵肉制品的脂肪氧化過程中起主導作用[20-21]。酶促氧化過程中，O2在酶的作用下與不飽和脂肪酸的不飽和雙鍵相連，進而發(fā)生氧化反應。自動氧化是指不飽和脂肪酸在加熱、輻照、金屬離子、水分等條件下的氧化反應，自然氧化過程是一個自由基鏈式反應過程，包含鏈引發(fā)、鏈傳遞和鏈終止3 個階段，也稱誘發(fā)期、增殖期和終止期[22-24]。氧氣、不飽和脂肪酸及促氧化物質是脂肪氧化發(fā)生的必要條件，脂肪的不飽和程度直接影響產品的氧化穩(wěn)定性。肉制品中的氧化反應通常發(fā)生于兩個部位，分別是肌肉組織中的磷脂以及脂肪組織中的甘油三酯。其中磷脂因含有亞麻油酸和花生四烯酸等大量不飽和脂肪酸，且在肌肉組織中位置更靠近血紅蛋白、氯化鈉等催化劑，較甘油三酯更容易發(fā)生氧化酸敗[25]。此外，脂肪氧化還受到溫度、pH值、水分活度、金屬離子、光、氯化鈉等的影響。

不飽和脂肪酸發(fā)生氧化后繼續(xù)分解產生醛、酮等羰基化合物和低級脂肪酸，羰基化合物進一步脫水、水解、環(huán)化生成內酯化合物，綜合賦予發(fā)酵肉制品良好的風味[26]。Huan Yanjun等[27]發(fā)現金華火腿中約50%的風味物質直接來自于脂肪氧化。但隨著氧化程度的加深，不飽和脂肪酸的過度氧化會給產品的風味、色澤等都帶來負面的影響。韋誠等[28]在探究發(fā)酵時長對酸肉理化指標及安全特性影響時，發(fā)現發(fā)酵20～50 d時，酸肉具有較好的色澤、硬度及咀嚼性，隨著發(fā)酵周期的延長，酸肉的過氧化值（peroxide value，POV）和硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）含量逐漸上升，肉制品的彈性下降，色澤變暗，品質降低。脂肪氧化產物中對肉制品風味起到貢獻作用的一般為小分子化合物，對人體健康有害的主要是大分子脂肪氧化物[29]。因此，在發(fā)酵肉制品的生產過程中應盡量保留小分子脂肪氧化物，抑制大分子脂肪氧化物的形成。

1.2 蛋白質的氧化

自Martinaud等[30]發(fā)現活性氧對肉成熟過程中肌原纖維蛋白有影響后，有關肉類蛋白質氧化的研究越來越多。與脂肪氧化類似，蛋白質氧化同樣遵循自由基鏈式反應過程，但蛋白質的氧化過程更為復雜且反應產物更多[31]。蛋白質氧化過程中主要發(fā)生氨基酸側鏈基團的修飾。幾乎所有氨基酸側鏈均可以與自由基反應發(fā)生修飾，但不同氨基酸的敏感程度并不相同。其中半胱氨酸含硫的活性中心具有較高的敏感性，在所有氨基酸殘基中最先被氧化，巰基氧化形成二硫鍵，導致蛋白質的交聯。Stadtman[32]報道活性氧優(yōu)先攻擊氨基酸殘基的側鏈，并導致一些氨基酸殘基轉化為羰基衍生物。此外，常見的蛋白質氧化反應還包括芳香族氨基酸側鏈與脂肪族發(fā)生羥基化、蛋氨酸亞砜化、堿性氨基酸脫氨生成羰基化合物等[33]。羰基化合物作為蛋白質氧化損傷的重要標志，一方面通過氨基酸側鏈氧化及主肽鏈斷裂直接形成；另一方面美拉德反應及蛋白質與非蛋白羰基化合物結合的間接作用也會導致羰基的產生[33-34]。

蛋白質氧化會引起蛋白質的交聯和氨基酸側鏈的改變，對肉制品的持水性、硬度等理化性質及蛋白質消化率產生影響[35]。Grune等[36]報道了蛋白質的適度氧化有利于蛋白酶對蛋白質的識別，提高蛋白質的水解率，過度氧化和交聯會導致蛋白質聚集體的生成以及一些氨基酸側鏈氧化分解，使蛋白質不易被蛋白酶識別。此外，大量研究還發(fā)現，蛋白質的氧化會導致肉嫩度和多汁性的降低，這可能與蛋白質氧化后水解敏感度降低、不易被蛋白酶識別以及蛋白質交聯有關[37]。研究發(fā)現，干腌火腿中蛋白質氧化對產品品質影響顯著，并導致干腌火腿硬度增加、多汁性下降[38]。

1.3 脂肪與蛋白質氧化的相互作用

在肉制品中，脂肪和蛋白質的氧化過程并不相互獨立，根據現有研究提供的證據和共識，認為二者中任一方的氧化產物均會促進另一方的氧化，二者的氧化是相互促進的[37,39-40]。有研究指出，肉類系統中脂肪的氧化往往比肌原纖維蛋白氧化降解要快，脂質衍生的氫過氧化物和自由基容易導致蛋白質的氧化[33]。同時，肌紅蛋白（myoglobin，Mb）的變性會導致鐵元素的釋放，從而促進脂肪的氧化[41]。圖1描述了脂質雙分子層中不飽和脂肪酸與氧合肌紅蛋白（oxymyoglobin，MbO2）之間潛在的氧化相互作用[39]，磷脂在金屬離子等催化劑影響下發(fā)生氧化，產生過氧化自由基等初級氧化產物，其在脂肪氧化過程中非常不穩(wěn)定，極易進一步氧化產生4-羥基壬烯醛等次級氧化產物，這些次級氧化產物能夠促進氧和Mb氧化。同時，在氧和Mb氧化過程中會產生H2O2，其與Fe3+發(fā)生Fenton反應生成羥自由基又反過來促進脂肪氧化。值得注意的是，肌原纖維蛋白同時可以作為氧化還原活性物質，保護脂質等其他食物成分免受氧化反應。Garry等[42]報道了Mb具有清除體內活性氧的作用。

圖1 脂質雙分子層中不飽和脂肪酸與MbO2之間潛在氧化相互作用反應[39]Fig.1 Potential oxidative interactions between unsaturated fatty acids in the lipid bilayer and MbO2[39]

Estévez等[43]證實肉制品的顏色和質地特征與氧化引起的蛋白質功能性改變顯著相關，迷迭香提取物的添加有效抑制了香腸中蛋白質的氧化，增強了法蘭克福香腸的質地特征。吳雪燕[44]的研究也得出類似的結論。肉制品中脂肪和蛋白質的氧化相互關聯，二者共同影響產品品質，天然或人工抗氧化劑對肉制品品質的影響已被大量研究，而功能性微生物對肉制品品質的影響仍缺少系統深入的研究。

2 發(fā)酵劑在發(fā)酵肉制品中的抗氧化作用

在傳統發(fā)酵肉制品中，發(fā)酵微生物是在肉制品加工時通過環(huán)境和設備偶然混入原料中，并在競爭過程中逐漸成為優(yōu)勢菌的野生菌株。1940年Jenson和Paddock首次提出使用乳酸菌發(fā)酵香腸[4]，開創(chuàng)了人類使用純種發(fā)酵劑生產發(fā)酵肉制品的先河，自此，肉用發(fā)酵劑的應用與研究快速發(fā)展。在肉制品的發(fā)酵成熟中，微生物能夠分解糖發(fā)酵產酸，降低肉制品的pH值，防止腐敗菌的滋生，肌肉內源酶類能夠降解脂肪和蛋白質，產生游離脂肪酸、氨基酸及揮發(fā)性風味物質，既提高了營養(yǎng)價值又賦予發(fā)酵肉制品獨特的風味。其中對肉制品的發(fā)酵成熟起作用的微生物主要有細菌、酵母和霉菌[3]。

發(fā)酵肉制品傳統的生產存在生產周期長、產品品質難以控制、安全性差等問題，隨著發(fā)酵工業(yè)的進步，肉用發(fā)酵劑的品種日益繁多。Gilliland[45]認為良好的肉類發(fā)酵劑應符合非致病性、抗噬菌體、耐酸、耐鹽、耐亞硝酸鹽、在26.7～43 ℃下適宜生長等條件。此外，肉用發(fā)酵劑還應對肉制品的風味色澤有積極影響，耐酸、不具有氨基酸脫羧酶活性、不產生H2O2、對有害菌及病原體（如金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌及李斯特菌等）有拮抗作用[46]。如表1所示，發(fā)酵肉制品中常見的微生物主要有乳酸菌、葡萄球菌、微球菌、酵母菌及霉菌等[47-48]。

表1 發(fā)酵肉制品中常見的微生物種類及作用[47-48]Table 1 Common types of microorganisms and their functions in fermented meat products[47-48]

2.1 乳酸菌

乳酸菌是一類可以發(fā)酵糖類生產乳酸、微好氧或專性厭氧、革蘭氏染色陽性無芽孢細菌的統稱，在發(fā)酵肉制品成熟過程中起到降低pH值、抑制腐敗菌生長、促進風味色澤形成等重要作用[49]。無氧條件下，乳酸菌利用肉類中的碳水化合物生產乳酸，迅速降低肉制品的pH值至4.8～5.2之間，根據代謝產物的不同，發(fā)酵過程只產生乳酸的稱為同型發(fā)酵，除乳酸外還產生乙醇、醋酸、CO2等產物的稱為異型發(fā)酵。低酸性環(huán)境一方面抑制了腐敗病原菌的繁殖；另一方面也促進了水分的散失，加快了干燥的速率，延長了產品的貨架期[50]。Stahnke[51]指出，低pH值可以促進亞硝酸鹽轉化為亞硝酸，進一步降解為一氧化氮（nitric oxide，NO）和其他化合物，有效抑制了強致癌物亞硝胺的生成。同時NO可以與Mb結合，生成亞硝基Mb，促進肉制品發(fā)色[52]。此外，乳酸菌還可以產生細菌素來抑制或殺死李斯特菌、金黃色葡萄球菌等病原微生物，提高自身的競爭力[52]。研究表明，乳酸菌的蛋白水解系統能夠促進蛋白質降解，產生短肽及游離氨基酸等風味化合物，改善產品風味[53]。

乳酸菌具有抗氧化、維持腸道菌群平衡、降血壓、降膽固醇等生理功能，是一種優(yōu)質的天然抗氧化劑。Lin等[54]對19 株乳酸菌無細胞提取物的抗壞血酸自動氧化抑制能力、金屬離子螯合能力、活性氧自由基清除能力、超氧化物歧化酶（superoxide diamutase，SOD）活力和還原活性等抗氧化能力進行測定，發(fā)現所有的菌株均表現出抗氧化活性。吳祖芳等[55]對4 種食物來源的抗氧化乳酸菌進行篩選鑒定，得出戊糖乳桿菌H15和植物乳桿菌H17具有較高的超氧陰離子自由基清除能力和抑制脂質過氧化能力。目前，普遍認可的乳酸菌抗氧化機制有4 種：1）乳酸菌面臨氧脅迫時，通過分泌抗氧化物質（如硫醇類物質、抗氧化酶等）、清除活性氧及分解氧化代謝產物來抵抗氧脅迫作用；2）通過調節(jié)宿主細胞信號通路，如核因子E2相關性因子2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、蛋白激酶B等，提高其抗氧化能力；3）通過清除自由基系統控制細胞內自由基的數量，避免自由基過多造成細胞損傷；4）抑制脂質過氧化和螯合金屬離子作用。此外，乳酸菌在發(fā)酵過程中產生的代謝產物以及自身產生的胞外多糖等也具有一定的抗氧化作用。乳酸菌的多種抗氧化調控機制往往不是單獨發(fā)揮作用，而是相互關聯（圖2）。

圖2 乳酸菌抗氧化作用機制[56]Fig.2 Antioxidant mechanism of lactic acid bacteria[56]

Yang Xin等[57]發(fā)現通過飼喂雛雞植物乳桿菌JM113，雛雞腸黏膜內Nrf2及下游HO-1基因的mRNA水平上調，有效減輕了霉菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對雛雞的不良影響。Pan Daodong等[58]發(fā)現從乳球菌培養(yǎng)物中分離得到的胞外多糖具有較強的羥自由基和超氧陰離子自由基清除能力，能夠顯著降低小鼠體內丙二醛的含量，并提高CAT和SOD的活力。

發(fā)酵肉制品研究方面，田圓圓等[59]對7 種傳統腌臘肉制品中的乳酸菌進行分離鑒定和抗氧化能力分析，發(fā)現一株腸膜明串珠菌L4具有較強的抗氧化能力，同時滿足肉類發(fā)酵劑的要求，有望開發(fā)為功能性肉類發(fā)酵劑。此外，還有研究發(fā)現具有高蛋白酶活性的乳酸菌可以提高發(fā)酵香腸中肽抗氧化活性。Cao Chenchen等[60]從中國傳統發(fā)酵香腸中分離出一株工藝性能優(yōu)良、蛋白酶活力高的植物乳桿菌CD101，并研究了其對發(fā)酵香腸肽抗氧化活性的影響，發(fā)現與對照組相比，以植物乳桿菌CD101為發(fā)酵劑的發(fā)酵香腸肽抗氧化活性顯著提高。

2.2 葡萄球菌和微球菌

葡萄球菌和微球菌均屬于微球菌科，二者的主要區(qū)別在于葡萄球菌兼性厭氧，有無氧氣均能較好地生長，而微球菌專性好氧，多集中于發(fā)酵肉制品中富氧的表層部位，兩者往往混合使用。實際生產中，葡萄球菌和微球菌除應滿足肉用發(fā)酵劑的基本要求外，還應具備分解H2O2、蛋白質和脂肪的活性，以及硝酸鹽還原酶活性，賦予發(fā)酵肉制品良好的風味和色澤，因此又被稱為“風味菌”[61]。近年來，被廣泛應用的發(fā)酵菌種主要有變異微球菌、肉糖葡萄球菌和木糖葡萄球菌。

乳桿菌和片球菌在發(fā)酵和成熟的最初階段起到了重要作用，而葡萄球菌和微球菌則將最終影響產品的色澤和風味。在發(fā)酵過程中，葡萄球菌和微球菌都能產生硝酸還原酶和亞硝酸鹽還原酶，既促進了腌肉色澤的形成，又降低了亞硝酸鹽及致癌物亞硝胺的含量[62]。在發(fā)酵過程中許多乳酸菌會產生強氧化劑H2O2，葡萄球菌和微球菌具有H2O2酶活性，可以促進H2O2分解，抑制過氧化物的產生。Coppola等[63]對意大利南部一種傳統發(fā)酵香腸中的菌種進行了分離鑒定，得到138 株葡萄球菌與微球菌，大多數菌株能在18 ℃或30 ℃下還原硝酸鹽，并具有H2O2酶活性。許多研究表明，葡萄球菌和微球菌有助于改善發(fā)酵肉制品的品質，延長產品的貨架期。張大磊等[64]研究具有亞硝酸鹽還原酶、蛋白酶和脂肪酶活性的2 株葡萄球菌和微球菌發(fā)酵廣式臘腸，發(fā)現接菌組比對照組有更高的感官評分和MetMb含量，更低的羰基值和TBARS含量。

2.3 霉菌和酵母菌

霉菌為好氧微生物，常分布于發(fā)酵肉制品的表面或靠外側一層，形成一層“保護膜”。霉菌常用于中式火腿和意式發(fā)酵干香腸的生產，通過在肉制品表面定植形成一層霉衣，一方面能夠控制水分的遷移，防止肉制品表面形成硬殼而影響產品品質；另一方面又起到避光和隔氧的作用，抑制產品的過度氧化。金二慶[65]在探究紅曲菌發(fā)酵對廣式臘腸風味、感官及貯藏特性的影響時，發(fā)現紅曲菌有助于抑制廣式臘腸中雜菌的生長，提高產品品質，延緩產品的腐敗變質，延長保質期。此外，霉菌還具有抑菌以及分解蛋白質和脂肪的能力，對發(fā)酵肉制品品質及特征風味物質的形成起重要作用[66]。Rodríguez等[67]對伊比利亞干腌火腿中分離出來的微生物蛋白水解酶活性進行評價，發(fā)現產黃青霉對干腌肉制品中蛋白質的水解起重要作用，能顯著提高火腿中游離氨基酸的含量。多數霉菌在人工培養(yǎng)基上可以產生霉菌毒素，因此霉菌發(fā)酵劑需驗證安全無毒后方可應用，產黃青霉和納地青霉是常用的不產毒霉菌發(fā)酵劑[61]。

酵母菌兼性好氧、耐高滲透壓、產酸能力較弱，具有分解蛋白質、脂肪和H2O2的活性，主要分布于發(fā)酵肉制品的表面或淺表層[68]。在發(fā)酵肉制品的生產中酵母菌主要起到消耗氧氣、改善色澤和風味、抑制病原微生物生長等作用。在氧氣充足時，酵母菌進行好氧呼吸，消耗肉餡中殘存的氧氣，氧氣耗盡后進行厭氧發(fā)酵，降低環(huán)境的pH值，酸性環(huán)境有助于抑制病原微生物的生長以及色澤的穩(wěn)定[61]。多數酵母菌本身沒有硝酸鹽和亞硝酸鹽的還原能力，甚至還會對固有微生物的硝酸鹽還原能力產生抑制作用，在實際生產中酵母菌常與乳酸菌、微球菌等混合使用。常見的肉用酵母菌種主要有漢遜氏德巴利酵母和法馬塔假絲酵母，近年來假絲酵母和魯氏酵母等在發(fā)酵肉制品中也有應用[69]。Ozturk等[70]在研究分離自土耳其干發(fā)酵香腸Sucuk中酵母菌群的功能和工藝特性時，發(fā)現篩選出的24 株涎沫假絲酵母和23 株漢遜德巴利酵母均具有CAT活力。Flores等[71]發(fā)現漢遜氏德巴利酵母能夠抑制脂肪氧化，促進發(fā)酵香腸特征風味物質乙酯的產生，對香腸成熟過程中揮發(fā)性物質的生成有重要作用。國內研究方面，李林[72]利用從發(fā)酵酸魚中篩選出的3 種優(yōu)勢菌株（植物乳桿菌Lp120、木糖葡萄球菌Sx135和釀酒酵母菌Sc31）對魚肉漿模擬體系進行發(fā)酵，發(fā)現與空白對照相比，Sc組表現出一定的抗氧化活性，同時Sc組的游離脂肪酸氧化率僅為387.5 g/kg，遠低于Lp組（475.9 g/kg）及Sx組（802.2 g/kg）。

2.4 微生物抗氧化活性評價方法

微生物抗氧化活性的測定主要通過不同的方法分別對發(fā)酵上清液、菌懸液、胞外多糖和無細胞提取物這4 個部分進行評價。目前抗氧化的評價方法主要包括體外抗氧化活性評價法、細胞模型抗氧化評價法和體內抗氧化活性評價法。

體外抗氧化活性評價方法一般可分為4 類[73]：1）活性氧自由基清除能力，包括超氧陰離子自由基清除實驗、羥自由基清除實驗；2）基于氫原子轉移能力，包括氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）法、TBARS法、硫氰酸鐵（ferric thiocyanate，FTC）法；3）基于單電子轉移能力，包括DPPH自由基清除實驗、2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除實驗、鐵還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）法；4）基于金屬離子螯合能力（metal chelating capacity，MCC）法。表2總結了常見的體外抗氧化活性檢測方法及其適用性。

表2 體外抗氧化活性檢測方法Table 2In vitro antioxidant activity assays

體外抗氧化活性評價方法具有檢測周期短、操作簡單等優(yōu)點，但每種方法在原理、適用范圍上各有側重，其檢測結果通常只反映某種或某一類成分（如溶解特性）的抗氧化特性，難以對微生物的抗氧化性作出真實而全面的評價[89]。通常采用多種方法相互補充的方式，來彌補各種方法的不足，達到全面反映受試物抗氧化活性的目的[90]。此外，體外評價系統往往與細胞或生物體內真實環(huán)境相差較大，例如微生物不僅能夠清除自由基，還可以通過提高細胞或者生物體內內源性抗氧化物質（如SOD、GPx）等的水平來起到抗氧化的效果。因此，通常采用體外評價對微生物的抗氧化性進行初篩，通過細胞模型或動物實驗對微生物的抗氧化性進行進一步驗證。

細胞模型抗氧化評價法具有快速、經濟、準確的特點，能較好地闡明抗氧化劑在體內的吸收、代謝機理。當前，研究較多的細胞模型抗氧化評價法有基于紅血球細胞抗氧化保護能力（cell-based antioxidant protection in erythrocytes，CAP-e）法、細胞抗氧化活性（cellular antioxidant activity，CAA）法、紅細胞氧化溶血抑制（oxidative hemolysis inhibition assay，OxHLIA）法和氧化損傷細胞模型法。其中CAP-e法和CAA法的原理相同，利用熒光染料2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）進入細胞后在細胞酯酶的作用下分解為還原型二氯熒光素（2',7'-dichlorodihydrofluorescein，DCFH），外源性自由基引發(fā)劑2,2'-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽（2,2'-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride，AAPH）將DCFH氧化為具有強熒光性的氧化型二氯熒光素，熒光強度與自由基含量成正比，與受試物抗氧化強度成反比[91]。二者的區(qū)別是前者以正常紅細胞作為細胞模型，能有效避免細胞本身發(fā)生氧化應激的缺陷[92]；后者以肝癌細胞作為細胞模型，肝臟是人體進行物質代謝的主要場所，而肝癌細胞具有和人體正常肝細胞相似的生理活性[93]。CAP-e法和CAA法靈敏度高，適用于高通量分析，缺點是熒光標記物敏感、檢測設備昂貴、操作復雜、實驗周期長[94]。OxHLIA法同樣以AAPH作為自由基引發(fā)劑，測定受試物對氧化應激下紅細胞溶血的抑制能力[95]。氧化損傷細胞模型法是指將細胞暴露于H2O2或脂質過氧化物體系下，觀察受試物對細胞氧化損傷的抑制能力[96]。除上述常見的細胞抗氧化實驗外，還有噻唑藍法、ATP測定法、乳酸脫氫酶釋放法等[97]。

雖然體外實驗和細胞實驗具有便捷、高效、成本低的優(yōu)勢，但仍不能完全反映抗氧化劑在生物體內的吸收代謝等情況，因為抗氧化劑須經過胃腸道的酸性環(huán)境以及多種酶的消化降解后才被機體吸收，到達靶向器官發(fā)揮作用。體內抗氧化活性評價法是指給人或動物注射或飼喂受試物，通過測定實驗動物體內抗氧化酶活力及丙二醛等指標對受試物的抗氧化能力進行評價[98-99]。體內抗氧化活性評價結果準確，能夠真實反映受試物在體內抗氧化能力的同時對受試物的毒理性質等進行評價，但實驗周期長、成本高，不適合抗氧化劑前期大批量的測定[77]。

表3 部分發(fā)酵劑在發(fā)酵肉制品中的抗氧化性研究結果Table 3 Antioxidant effects of some starters in fermented meat products

目前，大量文獻報道了發(fā)酵劑的抗氧化潛力，表3整理了近年來部分發(fā)酵肉制品中發(fā)酵劑的抗氧化活性研究結果。由于研究所采用的抗氧化測定方法不盡相同，使得各發(fā)酵劑菌株之間的抗氧化性能難以比較，但總地來說，發(fā)酵劑在發(fā)酵肉制品中的抗氧化能力評價方法以自由基清除實驗、ABTS陽離子自由基清除實驗、TBA實驗、POV實驗最為常見。各類發(fā)酵劑中乳酸菌的研究較多，葡萄球菌、微球菌、霉菌和酵母的抗氧化活性研究較少。隨著對發(fā)酵劑抗氧化機制研究的逐漸深入，發(fā)酵劑在發(fā)酵肉制品中發(fā)揮抗氧化作用的生物活性物質有待明確，發(fā)酵劑在不同抗氧化實驗中的抗氧化能力與其對發(fā)酵肉制品品質影響之間的相關關系尚待闡明。

3 抗氧化酶系

微生物的抗氧化活性一方面是菌體內阿魏酸、半胱氨酸等抗氧化活性成分造成的，另一方面細胞內抗氧化酶類也起到了至關重要的作用。常見的抗氧化酶主要有SOD、CAT以及GPx 3 類。

圖3 各類抗氧化酶的反應方程[110-111]Fig.3 Reaction equations of antioxidant enzymes[110-111]

SOD可以快速催化高活性的超氧陰離子并歧化為O2和活性較弱的H2O2（圖3），H2O2可以被CAT及GPx繼續(xù)分解[111]。根據所攜帶金屬離子的不同，SOD可以分為4 類：Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD和Ni-SOD。其中Cu/Zn-SOD在原始的生物類群中較為常見，存在于真核生物細胞質、周質空間及葉綠體中；Mn-SOD常見于原核生物及真核生物的線粒體內；Fe-SOD主要存在于少數植物和原核生物細胞內；Ni-SOD的研究較少，目前只發(fā)現在藍細菌和鏈霉菌屬中有存在[112]。Arasu等[113]研究發(fā)現具有良好H2O2耐受性和DPPH自由基清除能力的短乳桿菌P68具有SOD及GPx活力。Zuo Fanglei等[114]研究發(fā)現SOD和CAT的異源表達能夠顯著提升長雙歧桿菌NCC2705對活性氧的耐受能力，此外這兩種酶的共同表達在應對氧化應激時具有協同的有益作用。

CAT又稱觸酶、血紅素酶，廣泛存在于動物、植物和微生物中，是一種四聚體酶，由4 個相同四面體排列的亞基組成，每個亞基各有一個鐵卟啉基。CAT能夠催化H2O2分解成H2O和O2，此外CAT還具有過氧化物酶活力，可以和氫供體（甲醇、乙醇、甲酸或酚類）反應[111]。Lin Jinzhong等[115]發(fā)現異源表達的CAT有效提高了干酪乳桿菌對抗H2O2損傷的能力。釀酒酵母在銅離子脅迫導致的氧化應激下，其細胞內CAT和SOD的活力均有不同程度的提高[116]。

與CAT類似，GPx也是四聚體酶，4 個相同的亞基單位里每個亞基都含有一個硒半胱氨酸殘基。GPx代謝是最基本的抗氧化防御代謝機制之一，通過還原性谷胱甘肽催化脂質過氧化物或H2O2還原，從而保護細胞免收氧化損傷[110]。蔡秋杏等[117]對分離自腌干魚的乳酸菌抗氧化酶活力及其胞外多糖抗氧化能力進行了測定，發(fā)現抗氧化能力越強的菌株其抗氧化酶活力越高，其中綜合抗氧化能力最強的干酪乳桿菌L21 SOD、GPx及CAT活力分別為（44.28±2.28）、（12.80±0.09）U/mg和（1.23±0.07）U/mg。

4 結 語

微生物對發(fā)酵肉制品的發(fā)酵成熟起到至關重要的作用，蛋白質和脂肪的氧化程度直接影響產品的最終品質。合適的發(fā)酵劑和添加劑能夠促進氧化降解、縮短生產周期、控制氧化程度、抑制有害菌的生長繁殖。當前發(fā)酵劑在發(fā)酵肉制品中抗氧化性的研究主要集中于抗氧化微生物的篩選鑒定以及微生物應用于產品后理化指標和感官評價的表現，其中抗氧化菌種主要集中于乳酸菌，除乳酸菌外其他微生物的抗氧化機制還缺乏系統深入的研究。微生物抗氧化活性的評價和篩選方法根據反應環(huán)境的差異一般可分為體外實驗、細胞實驗和動物實驗，不同的評價方法因其原理與操作的不同，在評價過程中受到很多限制，同時體外模擬環(huán)境與體內真實環(huán)境相比仍有較大差異，且菌株被機體攝入后，消化作用及菌體的自聚性和黏附性都會對微生物的抗氧化能力造成影響，微生物體外抗氧化活性與緩解體內氧化應激能力之間的關系尚不明確，缺乏一種能夠綜合評價微生物體外抗氧化活性并能真實反映其緩解體內氧化應激能力的方法。此外，還應關注脂肪與蛋白質的初級氧化和次級氧化、氧化過程中脂肪與蛋白質的相互作用、添加劑等對發(fā)酵肉制品品質的影響。我國是肉制品消費大國，發(fā)酵肉制品歷史悠久、種類豐富、微生物資源繁多，應充分利用我國寶貴的微生物資源，結合現代基因工程、酶工程、細胞工程等先進技術，促進肉制品產業(yè)深化發(fā)展，為消費者提供優(yōu)質美味的發(fā)酵產品。