PRE-084預處理對缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞凋亡的影響

高啟軍，鄧長金

急性ST段抬高型心肌梗死多為血管完全閉塞，持續(xù)性心肌缺血可以導致心肌細胞壞死，盡早開通閉塞血管恢復血流灌注可以降低心肌細胞壞死，是最有效的治療方法[1]。但缺血后再灌注可因一系列原因出現(xiàn)心肌細胞損傷，引起心肌細胞凋亡，其發(fā)病機制較為復雜，目前還未完全闡明[2]。細胞凋亡是一種受基因調(diào)控的程序性細胞死亡，是心肌缺血再灌注損傷的主要原因[3]。在心肌缺血再灌注損傷中心肌細胞凋亡的可能作用機制包括活性氧大量生成、細胞內(nèi)鈣超載、線粒體損傷等，同時一些信號轉(zhuǎn)導通路及調(diào)控基因也影響心肌細胞凋亡的過程。最重要的凋亡調(diào)控基因是Bcl-2 基因家族，而Bax和Bcl-2的相互作用又是其中最為關(guān)鍵的細胞凋亡調(diào)控因素。Bcl-2 抑制細胞凋亡，而 Bax 促進細胞凋亡。通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax的表達來防止細胞凋亡，是治療缺血再灌注損傷的方法之一。

Sigma-1受體是近幾年研究的熱點之一，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和其他周邊組織中廣泛表達。這些受體與神經(jīng)變性疾病、抑郁癥、特發(fā)性疼痛和癌癥有關(guān)，已成為治療這些疾病的新靶點[4]。最近的研究表明，Sigma-1受體激動劑具有心肌保護作用[5-6]。目前Sigma-1受體激動劑的研究主要集中于抑郁合并心血管疾病，而且研究時間較長，多為干預1個月，但其對缺血再灌注損傷的影響尚不清楚。本研究通過建立心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，觀察Sigma-1受體激動劑PRE-084對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞凋亡的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 SD雄性大鼠，SPF級，體重220～250 g，由武漢大學動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK鄂2015-0018。PRE-084購自美國stanta公司。

1.2 實驗分組 將15只SD雄性大鼠隨機分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、PRE-084組，每組5只。PRE-084組于手術(shù)前1 h給予1 mg/kg PRE-084；假手術(shù)組和缺血再灌注組給予等體積的生理鹽水，均為腹腔注射給藥，實施30 min缺血及24 h再灌注造模；假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制作及樣本獲取 大鼠腹腔注射麻醉(10%水合氯醛3 mL/kg)，氣管插管后連接上小動物呼吸機，設置頻率為60次/min，潮氣量為2 mL/100 g，在胸骨左側(cè)開胸，結(jié)扎冠狀動脈左前降支中上1/3處。觀察到結(jié)扎點的遠端心肌變蒼白、心電監(jiān)護提示ST段抬高為造模成功，缺血30 min后，松開結(jié)扎線，恢復冠狀動脈灌注，觀察約10 min后逐層縫合。再灌注24 h后再次麻醉大鼠，剪開胸腔后取出心臟，去除心房、右心室，將左室分為兩塊，一塊放入4%多聚甲醛中固定，用于末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP 缺口末端標記測定法(TUNEL)檢測心肌細胞凋亡，另一塊放入-80 ℃冰箱中，擇期行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢查。

1.3.2 心肌細胞凋亡檢測(TUNEL法) 凋亡細胞斷裂的基因組DNA暴露的3′-OH可以連上熒光素(FITC)標記的dUTP(fluorescein-dUTP)，從而可以通過熒光顯微鏡進行檢測。將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水處理后，按照試劑盒說明書進行染色。以 TUNEL 陽性細胞數(shù)量與同一視野心肌細胞總數(shù)的比值作為左心室心肌細胞凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。

1.3.3 熒光RT-PCR 檢測Sigma-1受體、Bcl-2、Bax mRNA水平 于冰上取約100 mg組織，于1 mL 預冷的Trizol中充分研磨，按 Trizol 說明書提取組織總 RNA，經(jīng) RNA 濃度和純度測定后，進行逆轉(zhuǎn)錄。Sigma-1受體引物序列：正向引物5′- GCAGTGGGTGTTTGTGAACG-3′，反向引物5′- TCTCAGCCCAGTATCGTCCC-3′；Bax 引物序列：正向引物5′- TGAACTGGACAACAACATGGAG-3′，反 向引物5′- AGCAAAGTAGAAAAGGGCAACC-3′；Bcl-2 引物序列：正向引物5′- TTGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3′，反 向引物 5′- TTCAGAGACAGCCAGGAGAAATC-3′；β- 肌動蛋白(β-actin)引物序列：正向引物 5′- CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3′，反向引物 5′- TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3′。實時熒光定量PCR是在StepOneTMReal-Time PCR儀(Life technologies公司)上完成，每個樣品均作3個復孔，使用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa公司)進行檢測。

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌組織TUNEL檢測結(jié)果(見圖1、圖2) 按TUNEL試劑盒提供的方法檢測凋亡細胞，假手術(shù)組凋亡細胞少，模型組可見大量凋亡細胞，PRE084組可見少量凋亡細胞。假手術(shù)組、缺血再灌注組、PRE-084組細胞凋亡指數(shù)分別為0.04±0.01，0.38±0.05，0.16±0.03，3組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=138.20，P=0.001)。與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組與PRE-084組凋亡指數(shù)明顯增加(P<0.01)；與缺血再灌注組相比，PRE-084組細胞凋亡指數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。說明缺血再灌注損傷可引起心肌細胞凋亡明顯增加，而PRE-084預處理能減少心肌細胞凋亡。

圖1 3組熒光顯微鏡下心肌細胞凋亡情況

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與缺血再灌注組比較，#P<0.01。

2.2 3組大鼠心肌Sigma-1受體 mRNA表達比較 PRE-084組、缺血再灌注組Sigma-1受體 mRNA 表達水平較假手術(shù)組明顯下降(P<0.01)，與缺血再灌注組比較，PRE-084組Sigma-1受體 mRNA 表達上升(P<0.01)。說明缺血再灌注可引起Sigma-1受體 mRNA表達下降，而PRE-084預處理能使Sigma-1受體 mRNA表達增加。詳見表1。

2.3 3組大鼠心肌Bcl-2、Bax mRNA表達比較 3組大鼠心肌Bcl-2、Bax mRNA表達比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與假手術(shù)組比較，PRE-084組及缺血再灌注組Bax mRNA表達均上升(P<0.01)，Bcl-2 mRNA表達均下降(P<0.01)，與缺血再灌注組相比，PRE-084組中Bax mRNA表達明顯下降(P<0.01)，Bcl-2 mRNA表達明顯上升(P<0.01)。說明缺血再灌注可引起B(yǎng)cl-2下降、Bax上升，相應的Bcl-2/Bax比值下降，促進細胞凋亡，而PRE-084預處理使Bcl-2上升、Bax下降，相應的Bcl-2/Bax比值上升，抑制細胞凋亡。詳見表1。

表1 3組大鼠心肌Sigma-1受體、Bcl-2、Bax mRNA表達比較(±s)

3 討 論

本實驗通過建立大鼠心肌缺血再灌注模型，觀察Sigma-1受體激動劑PRE-084對缺血再灌注心肌細胞凋亡的影響；使用RT-PCR法測定Bax、Bcl-2及Sigma-1受體mRNA 表達。實驗結(jié)果表明，在心肌缺血再灌注前應用PRE-084干預，可以抑制心肌細胞凋亡；PRE-084在心肌缺血再灌注中通過Sigma-1受體調(diào)控Bcl-2及Bax基因表達水平來干預心肌細胞凋亡。

心肌細胞凋亡是心肌在病理因素的作用下發(fā)生的主動而有序的程序性死亡。缺血再灌注損傷的發(fā)病機制是多因素性的，凋亡是再灌注損傷的主要致病機制之一[7]。當心臟處于超負荷或心肌缺血等病理狀態(tài)時，可能誘發(fā)細胞凋亡[8]。心肌細胞是不可再生的細胞，心肌細胞凋亡會導致心肌收縮功能障礙。因此，抑制心肌細胞凋亡是減輕心肌梗死病人心肌損傷的有效途徑之一。本實驗研究表明，缺血再灌注損傷引起心肌細胞凋亡增多，而PRE-084預處理可減少心肌細胞凋亡。

凋亡是一種基因調(diào)控的程序性死亡，凋亡調(diào)節(jié)基因分為抑制凋亡基因和促凋亡基因。研究最多的凋亡調(diào)控基因是Bcl-2 基因家族[9]，其產(chǎn)物根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)、功能不同分為抑制凋亡蛋白和促凋亡蛋白，抑制凋亡蛋白包括Bcl-2、Bcl-X、Mcl-1、Bcl-w，促凋亡蛋白包括Bid、Bax、Bak、Bad，抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白含量的多少決定對細胞凋亡調(diào)控的方向，其中Bcl-2和Bax的相互作用在細胞凋亡調(diào)控過程中起重要作用[10]，主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核模和線粒體膜。Bcl-2 和Bax對細胞凋亡的調(diào)控作用，不僅受其表達的影響，而且受到 Bcl-2/Bax 比值的影響，Bcl-2/Bax 比值升高抑制凋亡發(fā)生，降低則促進凋亡。研究表明，Bcl-2可在多處不同的層面抑制心肌細胞凋亡[11]，Bcl-2可抑制氧自由基的產(chǎn)生而降低氧自由基損傷；可以調(diào)節(jié)胞內(nèi)細胞器的Ca2+而減輕鈣超載；還可以抑制線粒體膜上通透性轉(zhuǎn)換孔開放，從而抑制細胞凋亡；Bcl-2可直接和凋亡蛋白活化因子1(Apaf-1)結(jié)合，防止凋亡蛋白酶的激活；Bcl-2可與Bax結(jié)合形成二聚體，從而使Bax無法發(fā)揮促凋亡作用。而Bax作為Bcl-2的同源體，可抑制Bcl-2的作用，促進細胞凋亡。因此，可以通過干預Bcl-2/Bax的表達來阻斷細胞凋亡，從而減輕缺血再灌注損傷。本實驗結(jié)果顯示缺血再灌注使Bcl-2表達明顯下降，Bax表達明顯上升；經(jīng)PRE-084預處理后，與缺血再灌注組相比Bcl-2升高，Bax下降，Bcl-2/Bax比值上升，提示PRE-084降低細胞凋亡與調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，PRE-084抑制細胞凋亡的機制可能為通過增加激動Sigma-1受體增加Bcl-2表達、抑制Bax表達有關(guān)，其具體作用機制還有待進一步研究。