養(yǎng)心通脈方含藥血清預(yù)處理內(nèi)皮祖細胞對急性心肌梗死兔心肌bFGF、VEGF水平的影響

龐 延，盧健棋，朱智德，溫志浩，梁逸強，韓景波，彭志林，林 浩

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是一種冠狀動脈急性、持續(xù)性缺血缺氧引起心肌壞死的急危病癥，雖然通過藥物治療、搭橋手術(shù)以及支架置入等有效干預(yù)治療措施取得了實質(zhì)性進展，但是在損傷心肌的功能恢復(fù)方面仍存在一定局限，預(yù)后不夠理想。研究提示干細胞移植在治療缺血性心臟病中具有巨大潛力，內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cell，EPCs)能夠通過分泌各種血管生成因子以及直接分化為內(nèi)皮細胞，遷移到損傷部位并形成新的血管而改善心功能，但由于移植的EPCs在損傷組織中存活率較低，其臨床試驗結(jié)果并不令人滿意。因此，尋找一種保護和促進移植EPCs發(fā)揮最大效能的藥物具有重要意義[1-2]。前期研究表明，養(yǎng)心通脈方含藥血清能夠明顯促進AMI兔骨髓EPCs增殖、遷移和黏附能力，而血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)被認為是調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞增殖、活化和分化的重要因素之一[3-4]。本研究主要通過體內(nèi)實驗探討?zhàn)B心通脈方含藥血清預(yù)處理EPCs對AMI兔心肌bFGF、VEGF水平的影響，以期為中醫(yī)藥聯(lián)合干細胞移植治療缺血性心臟病提供一定臨床思路和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康雄性家兔39只，體質(zhì)量2.0～2.2 kg，12周齡，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物合格證號：SCXK(桂)2009-0002。

1.2 藥物、試劑及儀器 養(yǎng)心通脈方組成：紅參、麥冬、五味子、當歸、川芎、白術(shù)、桂枝、炙甘草各10 g，黃芪、白芍、丹參各15 g，木香、檀香各3 g，購于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，TRIzol Reagent(天根公司生產(chǎn)，批號DP424)，戊巴比妥鈉 (Serve，批號：201505)，兔骨髓淋巴細胞分離液(天津灝洋公司生產(chǎn)，批號：2013LRA)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS，維森特公司生產(chǎn)，批號：311-010-CL)，熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)檢測試劑盒(Genecopies，AOPR-1200)，人纖維連接蛋白(HFN，美國 Roche生產(chǎn)，批號：1105140700)，焦碳酸二乙酯(DEPC，Vetec生產(chǎn)，V900882)，胎牛血清 (FBS，Hyclone生產(chǎn)，批號:SV30087.01)，EPCs專用培養(yǎng)基 (EGM-2，Lonza生產(chǎn)，批號：CC-3202)，蛋白酶抑制劑混合物(弗德生物生產(chǎn)，F(xiàn)D1002)，BCA蛋白定量試劑盒(弗德生物生產(chǎn)，F(xiàn)D2001)，RIPA裂解液(弗德生物生產(chǎn)，F(xiàn)D008)，熒光定量PCR儀(ABI公司生產(chǎn)，貨號7500)，微量核酸定量儀(Merinton公司生產(chǎn)，SMA4000)，小動物呼吸機(CKENTSCIENTIFIC ORPORATION公司生產(chǎn)，型號：RSP-1002)，EGC-6511型心電圖機(上海光電醫(yī)用電子儀器廠)等。

1.3 養(yǎng)心通脈方含藥血清預(yù)處理EPCs培養(yǎng)液的制備 4只家兔取1只制備含藥血清，含藥血清組給予養(yǎng)心通脈方灌胃，參照《藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算》換算給藥量為8 mL /(kg·d)[5]，每日2次，連續(xù)5 d，末次給藥后無菌取血離心分離血清，滅活后備用。取3只家兔麻醉后從股骨干抽取骨髓組織，離心和洗滌獲取單個核細胞(MNC)，以含10%FBS的EGM-2培養(yǎng)基接種到預(yù)先處理的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)至第20天的EPCs用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 使細胞同步化，調(diào)整細胞密度至5×105個/mL，將10%養(yǎng)心通脈方含藥血清置入含10%FBS的EGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)96 h制成養(yǎng)心通脈方含藥血清預(yù)處理EPCs培養(yǎng)液[3]。

1.4 方法

1.4.1 AMI兔模型建立 SPF級健康雄性家兔腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，氣管插管后連接小型動物呼吸機機械輔助通氣，連接肢體導(dǎo)聯(lián)觀察心電圖，行左側(cè)胸廓切開術(shù)后撕開心包膜暴露心臟，找到左心耳位置，強光下暴露動脈血管，用7.0聚丙烯縫線于右室流出道和左心耳之間結(jié)扎左冠狀動脈前降支中上1/3處，心電圖可見ST段抬高，左心室心肌顏色逐漸由粉紅色變暗蒼白，將心臟回納入胸腔，關(guān)胸后分別對肌層和皮層進行縫合，術(shù)后予青霉素抗感染。

1.4.2 家兔實驗分組 將35只雄性SPF級兔隨機選取5只家兔作為正常組，不做處理；隨機選取5只家兔作為假手術(shù)組，只開胸穿線，不結(jié)扎左冠狀動脈前降支；其余25只家兔進行AMI造模，造模成功后隨機分為模型組、養(yǎng)心通脈方含藥血清預(yù)處理EPCs心肌注射組(中藥EPCs心肌注射組)、EPCs心肌注射組、養(yǎng)心通脈方含藥血清預(yù)處理EPCs耳緣靜脈注射組(中藥EPCs耳緣靜脈注射組)、EPCs耳緣靜脈注射組，每組5只。

1.4.3 各組干預(yù)及細胞移植方法 正常組、假手術(shù)組、模型組不予干預(yù)；中藥EPCs心肌注射組：將養(yǎng)心通脈方含藥血清預(yù)處理的EPCs細胞混懸液濃度調(diào)整為8×105/mL，在建立AMI模型手術(shù)結(jié)扎冠狀動脈15 min后，再次打開胸腔，分別于結(jié)扎區(qū)附近心肌組織分5點注射濃度為8×105/mL的養(yǎng)心通脈方含藥血清預(yù)處理的EPCs細胞混懸液250 μL后關(guān)閉胸腔；EPCs心肌注射組：在建立AMI模型手術(shù)結(jié)扎冠狀動脈15 min后，再次打開胸腔，分別于結(jié)扎區(qū)附近心肌組織分5點注射EPCs培養(yǎng)液1 mL后關(guān)閉胸腔；中藥EPCs耳緣靜脈注射組：建立AMI家兔模型后即刻從耳緣靜脈注射濃度為1×107/mL的養(yǎng)心通脈方含藥血清預(yù)處理的EPCs細胞混懸液；EPCs耳緣靜脈注射組：建立AMI家兔模型后即刻從耳緣靜脈注射EPCs培養(yǎng)液1 mL。術(shù)后2周處死各組家兔取心肌組織進行PCR、蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測。

1.5 檢測指標

1.5.1 PCR檢測bFGF、VEGF的mRNA表達 提取總RNA，擴增mRNA，再逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，熒光定量 PCR 法檢測bFGF、VEGF表達。引物合成由廣州四和生物科技有限公司合成。VEGF引物序列：正向引物GCCGAGAAAGAGAAAAAGTG，反向引物GAGAGAGAGCAGGAGATACA，片段長度為163 bp；bFGF引物序列：正向引物GGAAGATGGACGGCTGCTGG，反向引物CGTTTCAGTGCCACATACCAA，片段長度為162 bp；Atcb(內(nèi)參)引物序列：正向引物CTTCTAGGCGGACTGTTAGA，反向引物CCTTCACCGTTCCAGTTTTT，片段長度為179 bp。采用2-△△Ct法進行各基因表達的相對定量。

1.5.2 Western Blot檢測bFGF、VEGF蛋白表達 提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒等試劑進行蛋白濃度測定，經(jīng)上樣→電泳→轉(zhuǎn)膜→免疫反應(yīng)→化學(xué)發(fā)光顯色等處理后，利用Image J軟件處理系統(tǒng)分析目標條帶。

2 結(jié) 果

2.1 各組缺血心肌及梗死心肌區(qū)bFGF、VEGF mRNA表達比較 在梗死心肌區(qū)及缺血心肌區(qū)，中藥EPCs心肌注射組和中藥EPCs耳緣靜脈注射組bFGF、VEGF mRNA 表達明顯高于假手術(shù)組、模型組、EPCs心肌注射組、EPCs耳緣靜脈注射組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但中藥EPCs心肌注射組bFGF、VEGF mRNA 表達與中藥EPCs耳緣靜脈注射組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，EPCs心肌注射組bFGF、VEGF mRNA 表達與EPCs耳緣靜脈注射組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組術(shù)后2周不同心肌組織bFGF、VEGF mRNA 表達比較(±s)

2.2 各組缺血心肌及梗死心肌區(qū)bFGF、VEGF蛋白表達比較 在梗死心肌區(qū)及缺血心肌區(qū)，中藥EPCs心肌注射組、中藥EPCs耳緣靜脈注射組bFGF、VEGF蛋白表達高于假手術(shù)組、模型組、EPCs心肌注射組、EPCs耳緣靜脈注射組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但中藥EPCs心肌注射組bFGF、VEGF蛋白表達與中藥EPCs耳緣靜脈注射組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，EPCs心肌注射組bFGF、VEGF 蛋白表達與EPCs耳緣靜脈注射組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，各組缺血心肌區(qū)bFGF、VEGF蛋白表達高于梗死心肌區(qū)。詳見表2。

表2 各組術(shù)后2周不同心肌組織bFGF、VEGF蛋白表達比較(±s)

3 討 論

AMI后心肌細胞大量壞死是預(yù)后不良的主要原因之一，長期以來，人們普遍認為，一旦心肌細胞死亡，幾乎無再生能力，然而，越來越多的證據(jù)表明，即使在梗死區(qū)也存在具有修復(fù)和促進心肌再生作用的祖細胞，但在缺乏最佳氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的情況下，新生心肌細胞存活率很低[6]。大量基礎(chǔ)研究及臨床研究提示，在損傷組心肌區(qū)移植干細胞不僅能夠分化產(chǎn)生有功能的新生心肌細胞，還可分化成內(nèi)皮細胞分泌多種促血管生成分子，促進干細胞歸巢，參與血管生成而改善損傷心肌血運重建并抑制心臟重塑過程，提示干細胞移植在未來輔助治療AMI中的可行性[7]。

EPCs于1997年在人外周血液中被發(fā)現(xiàn)，是一種對缺血信號極為敏感的干細胞，能夠在缺血早期迅速向缺血部位歸巢，產(chǎn)生大量的血管生成細胞因子及促進原位細胞增殖，通過整合蛋白激酶B(Akt)通路、內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)傳導(dǎo)、基質(zhì)細胞衍生因子1等信號通路，并激活以及分泌VEGF在內(nèi)的多種生長因子發(fā)揮保護和修復(fù)損傷組織的作用，如bFGF、VEGF等細胞生長因子，由于移植的EPCs面臨著損傷組織低氧濃度、炎癥反應(yīng)等復(fù)雜環(huán)境，移植的EPCs在臨床試驗中的結(jié)果并不令人滿意，通過EPCs預(yù)處理來保護EPCs活性可能是治療缺血性心臟病有效的治療策略，相關(guān)研究提示，逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒等介導(dǎo)的基因傳遞系統(tǒng)及使用兩種細胞組合移植被證明具有明顯提高細胞存活率和增強細胞功能，但天然化合物很容易從動物或植物分離，并且副作用更少，使之更具有優(yōu)勢，如褐藻和褐藻的提取物巖藻聚糖預(yù)處理EPCs能夠明顯減弱EPCs衰老和增強缺血組織的體內(nèi)細胞增殖和細胞存活，雷公藤堿能促進EPCs遷移、增殖能力等[2，8-9]。

養(yǎng)心通脈方是我院全國名老中醫(yī)李錫光教授治療冠心病的常用方，其療效肯定，沿用至今。本研究結(jié)果提示，養(yǎng)心通脈方預(yù)處理EPCs移植治療能夠明顯增加AMI兔損傷心肌bFGF、VEGF表達，損傷心肌處移植與耳緣靜脈注射移植兩種干預(yù)方式并無明顯差異。由于本研究樣本量較小，干預(yù)時間短，缺少短期及遠期療效評價，仍需進行多基因、多蛋白、多通路的深入研究，同時進行遠期療效對比以及中藥復(fù)方藥理學(xué)交叉探討其主要作用機制，以期為中醫(yī)藥預(yù)處理干細胞移植治療AMI提供更為準確的研究證據(jù)。