珊瑚來(lái)源群體淬滅活性產(chǎn)生菌的篩選與抑菌活性研究*

黃沁愉，蔣學(xué)建，蘇宏飛,2**，隆正良，陳 凡，黃麗萍，張志鵬

(1.廣西大學(xué)海洋學(xué)院，廣西南寧 530004;2.廣西大學(xué)，廣西南海珊瑚礁研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西大學(xué)珊瑚礁研究中心，廣西南寧 530004;3.廣西大學(xué)工程實(shí)踐與訓(xùn)練中心，廣西南寧 530004)

0 引言

群體感應(yīng)(Quorum Sensing,QS)是細(xì)菌根據(jù)自身細(xì)胞密度變化進(jìn)行自我協(xié)調(diào)的一種群體行為[1]。QS調(diào)控機(jī)制與病原微生物的毒力和致病性密切相關(guān)。受QS調(diào)控的細(xì)菌，通過(guò)產(chǎn)生不同的信號(hào)分子如AHL、AI-2、CAI-1等，控制其不同的性狀表達(dá)，如抗生素的合成、毒素的產(chǎn)生、生物膜成熟及生物發(fā)光等[2-5]。

近年來(lái)，珊瑚白化現(xiàn)象日益嚴(yán)重。導(dǎo)致珊瑚白化的主誘因有很多種，其中由各類(lèi)致病菌引起的珊瑚疾病已成為世界三大珊瑚礁區(qū)白化的重要因素[6]。頻繁發(fā)生的珊瑚疾病造成主要造礁物種突發(fā)性大范圍死亡，嚴(yán)重減少礁區(qū)的生物多樣性，對(duì)珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生不可控的甚至是難以逆轉(zhuǎn)的生態(tài)破壞[7]。Weir-Brush等[8]發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)濃度與海水表溫相關(guān)性良好，是引發(fā)珊瑚死亡，尤其是引起變形角珊瑚疾病的主要病原體。溶珊瑚弧菌(V.coralliilyticus)作為較新發(fā)現(xiàn)的珊瑚疾病病原體，也是近年來(lái)多種珊瑚的隱形殺手[9]。Bhedi等[10]研究表明，高溫脅迫下黑帶病菌大量繁殖并合成AHL，加速侵染健康珊瑚，導(dǎo)致珊瑚大范圍白化。有研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)會(huì)條件下部分珊瑚共附生細(xì)菌如溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、創(chuàng)傷弧菌(V.vuLnificus)等，利用QS信號(hào)因子改變珊瑚共附生微生物種群組成，打破珊瑚內(nèi)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致宿主珊瑚白化[11]。Papenfort等[2]發(fā)現(xiàn)致病弧菌霍亂弧菌(V.cholerae)和哈維氏弧菌(V.harveyi)受QS系統(tǒng)調(diào)控，通過(guò)分泌信號(hào)因子AI-2、CAI-1與膜受體結(jié)合，激活體內(nèi)群體感應(yīng)基因的表達(dá)。Certner等[12]對(duì)健康鹿角珊瑚(A.cervicornis)添加外源AHL信號(hào)分子，發(fā)現(xiàn)也會(huì)促使其白化。這些研究證據(jù)表明，珊瑚細(xì)菌性白化與寄生珊瑚的病原細(xì)菌群體感應(yīng)密切相關(guān)，意味著致病菌的群體淬滅完全有可能降低甚至解除珊瑚患病的威脅。

群體淬滅(Quorum Quenching，QQ)指通過(guò)抑制致病菌的QS效應(yīng)，阻斷胞間“信息交流”，達(dá)到抵御致病菌感染的目的[13]。群體淬滅產(chǎn)生菌可通過(guò)降解病原菌信號(hào)因子，阻斷細(xì)菌的信號(hào)交流，從而在不產(chǎn)生耐藥性的情況下有效抑制毒力基因的表達(dá)，是新型環(huán)境友好型的病菌防治策略[14]。目前已發(fā)現(xiàn)多例群體淬滅現(xiàn)象，Dong等[4]在蘇云金芽孢桿菌中克隆獲得的AiiA基因編碼的AHL內(nèi)酯酶，能高效抑制具有QS效應(yīng)的植物致病菌軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovora)；Koch等[15]在布魯氏菌(Brucellamelitensis)中發(fā)現(xiàn)，?；D(zhuǎn)移酶AibP在體外條件下能夠降解自身產(chǎn)生的內(nèi)生信號(hào)分子，并在巨噬細(xì)胞的侵染期間減少內(nèi)生信號(hào)分子的積累；Chan等[16]從馬來(lái)西亞雨林的生姜根圍中分離出 3 株具有抑制群體感應(yīng)效果的菌，其中兩株通過(guò)自身產(chǎn)生的內(nèi)酯水解酶產(chǎn)生廣譜的AHL降解活性從而抑制群體感應(yīng)，另一株則通過(guò)酰基轉(zhuǎn)移酶改變 AHL 的結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)群體感應(yīng)的抑制?？梢?jiàn)，干擾病原細(xì)菌間的QS效應(yīng)有可能成為解決珊瑚白化的新方法。群體淬滅現(xiàn)象同樣可以在珊瑚中實(shí)現(xiàn)，Meyer等[17]從珊瑚藍(lán)細(xì)菌中分離得到一種抑制劑，該化合物能夠結(jié)合珊瑚致病菌V.harveyi群體感應(yīng)受體蛋白，產(chǎn)生群體淬滅，還能夠使珊瑚共附生弧菌熒光淬滅。因此，挖掘具有群體淬滅活性的菌株，開(kāi)展其對(duì)珊瑚共附生微生物中群體感應(yīng)和群體淬滅介導(dǎo)的相互作用機(jī)制的研究，可為深入解析珊瑚共附生微生物抗病分子機(jī)制提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也能為今后深入研究珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的生物修復(fù)提供理論依據(jù)。

微生物界中常見(jiàn)的病原菌幾乎都可以形成生物被膜，病原菌生物被膜的形成是造成宿主慢性感染的主要原因。溶珊瑚弧菌和溶藻弧菌為常見(jiàn)的珊瑚病原菌，廣泛分布于海洋環(huán)境中，Cervino等[18]發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌與其他弧菌協(xié)同作用可使健康的圓菊珊瑚(Montastreaspp.)感病，其中溶藻弧菌也常常被認(rèn)為是魚(yú)類(lèi)、甲殼類(lèi)和人類(lèi)疾病的病原[19]；而Kimes等[20]揭露溶珊瑚弧菌的毒力因子表達(dá)受溫度調(diào)控，可在水生動(dòng)物組織的表面形成生物被膜。可形成生物被膜的細(xì)菌對(duì)抗生素和宿主免疫防御機(jī)制的抗性較普通病原菌強(qiáng)[21]，相比物理、化學(xué)方法，通過(guò)抑制病原菌的QS調(diào)控形成生物被膜的生物治療方法解決珊瑚感病問(wèn)題，具有環(huán)境友好、安全性高及可持續(xù)強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)[22]。

三亞珊瑚岸礁是我國(guó)岸礁最為發(fā)育的地點(diǎn)之一，鹿回頭岸段一直是我國(guó)開(kāi)展珊瑚礁研究和保護(hù)管理的代表地區(qū)[23]，該地區(qū)珊瑚及其共附生微生物物種豐富度高，是熱帶海洋中最突出的代表性生態(tài)系統(tǒng)之一[24]。雖然近年來(lái)鹿回頭地區(qū)珊瑚面臨著多重威脅，珊瑚覆蓋率從以前的80%—90%下降到如今的21.83%，但已有相關(guān)研究表明，這種情況主要是人類(lèi)活動(dòng)影響和全球氣候變化所導(dǎo)致的[25]，而該地區(qū)極少有關(guān)于珊瑚疾病的研究及報(bào)道[7]，由此推測(cè)，該地區(qū)可能存在群體淬滅活性菌。

紫色桿菌(Chromobacteriumviolaceum)是一類(lèi)具QS效應(yīng)的革蘭氏陰性細(xì)菌，當(dāng)自身細(xì)胞密度達(dá)到一定臨界濃度時(shí)，會(huì)向環(huán)境釋放信號(hào)分子C6-HSL與特定轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，調(diào)控紫色素相關(guān)基因的表達(dá)[26]，產(chǎn)生紫色素用以指示QS作用的產(chǎn)生。目前作為一種簡(jiǎn)便、直觀的QS抑制因子篩選模型[27]，被廣泛應(yīng)用于各類(lèi)細(xì)菌的QS研究中。本項(xiàng)目選取三亞鹿回頭7類(lèi)珊瑚樣品為研究對(duì)象，以紫色桿菌為指示菌，篩選出具有較高群體淬滅活性的珊瑚共附生菌株，運(yùn)用16S rDNA測(cè)序分析并結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行種屬鑒定，研究其對(duì)海洋致病菌溶珊瑚弧菌和溶藻弧菌的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)性和生物被膜生成的影響，為防治病原細(xì)菌群體感應(yīng)引起的珊瑚白化提供新材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

從三亞市鹿回頭半島三亞灣(109°28′E,18°13′N(xiāo))采集覆蓋度高的、具有代表性的珊瑚樣品，包括鹿角珊瑚(Acroporaaustera)、鹿角杯型珊瑚(Pocilloporadamicornis)、扁腦珊瑚(Platygyrasp.)、片狀薔薇(Turgescenssp.)、濱珊瑚(Poritessp.)、盾形陀螺(Scleractinlasp.)及角蜂巢(Favitessp.)等7類(lèi)珊瑚。每類(lèi)珊瑚采集3個(gè)樣品，每個(gè)樣品剪碎后裝入10 mL海水，振蕩儀振蕩后，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

胰蛋白胨粉末(LP0042)、酵母粉末、技術(shù)瓊脂粉末(Agar Powder)購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；葡萄糖粉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉、檸檬酸鐵購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；宿主弧菌溶珊瑚弧菌、溶藻弧菌購(gòu)自國(guó)家海洋局第三研究所海洋微生物保藏中心；紫色桿菌CV12614 購(gòu)自美國(guó)微生物保藏中心；2×Taq Mastermix購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；Glycine、TRIS、SDS購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；膠回收試劑盒、DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基配制

Marine Agar (MA)培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨5.0，酵母提取粉1.0，葡萄糖0.5，檸檬酸鐵0.1，海水定容，pH值為 7.2—7.5。

MA固體培養(yǎng)基：在MA培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入10.0 g/L瓊脂，海水定容。

珊瑚內(nèi)環(huán)境原位模擬培養(yǎng)基[28]：0.22 μm有機(jī)過(guò)濾膜過(guò)濾珊瑚組織勻漿，去除細(xì)菌，制備無(wú)細(xì)胞珊瑚組織液(CFCF)。以CFCF∶MA固體培養(yǎng)基=1∶10體積比例配制模擬珊瑚內(nèi)環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)固體培養(yǎng)基。

2.0%瓊脂固體培養(yǎng)基：瓊脂20.0 g/L，海水定容。

Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨5.0，酵母提取粉1.0，氯化鈉10.0，雙蒸水定容，pH值為7.4。

LB固體培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入10.0 g/L瓊脂。

群體淬滅活性篩選培養(yǎng)基：融化的40℃ LB固體培養(yǎng)基200 mL，加入紫色桿菌CV12614發(fā)酵液200 μL混勻。

1.2 珊瑚共附生微生物的分離培養(yǎng)

1.2.1 菌體收集

參考文獻(xiàn)[28]的方法：稱(chēng)取1 g含骨骼、黏液及珊瑚組織的珊瑚樣品碎塊，同一種珊瑚樣品稱(chēng)取3份，分別用無(wú)菌海水浸泡在15 mL收集管中，1 920 r/min轉(zhuǎn)速下漩渦振動(dòng)15 min，獲得濃稠的珊瑚組織勻漿，放置在4℃冰箱內(nèi)短時(shí)間保存。

1.2.2 原位模擬培養(yǎng)

蔗糖密度梯度離心是將珊瑚組織勻漿中不同類(lèi)屬的微生物分層的有效方法，大大提高珊瑚共附生微生物的存活率，獲得更多種類(lèi)的可培微生物。參考文獻(xiàn)[29]的蔗糖密度梯度離心方法：在1.5 mL EP管中依次加入0.3 mL 40%、30%、20%、10%梯度濃度的蔗糖溶液；移液槍取0.4 mL各珊瑚組織勻漿0.5 μm過(guò)濾膜過(guò)濾液，移入EP管溶液上層，低速離心；以0.4 mL為1個(gè)級(jí)分，用移液槍定量移取不同級(jí)分離心液至EP管，用無(wú)菌海水稀釋至3個(gè)濃度(10-1、10-2、10-3)；取200 μL稀釋10-3倍后的不同級(jí)分菌液，在珊瑚內(nèi)環(huán)境原位模擬固體培養(yǎng)基上涂布，常溫培養(yǎng)24 h。

1.3 群體淬滅活性產(chǎn)生菌的篩選

1.3.1 單菌落分離純化

從1.2.2節(jié)培養(yǎng)的平板中挑出不同單菌落，在MA固體培養(yǎng)基平板上劃線，純化培養(yǎng)出單一菌落，再接種到10 mL MA液體培養(yǎng)基內(nèi)，160 r/min 25℃條件下擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.3.2 群體淬滅活性菌株的篩選

紫色桿菌CV12614具備顯著的群體感應(yīng)現(xiàn)象[27]，共附生菌株會(huì)抑制紫色菌素的分泌，產(chǎn)生透明圈，具備該現(xiàn)象的菌株即為群體淬滅活性菌株。實(shí)驗(yàn)中考慮到紫色桿菌CV12614在液體培養(yǎng)基中難以把控存活周期及紫色菌素分泌量，故利用固體培養(yǎng)基對(duì)群體淬滅活性菌株進(jìn)行篩選。

操作步驟：將群體淬滅活性篩選培養(yǎng)基劃分16格打孔，取200 μL 1.3.1節(jié)分離培養(yǎng)的菌株發(fā)酵液置于孔內(nèi)培養(yǎng)初篩，以產(chǎn)生透明抑菌圈為陽(yáng)性菌株[26]。牛津杯均勻排布在2.0%瓊脂固體培養(yǎng)基平板上，倒入群體淬滅活性篩選培養(yǎng)基，制成四孔雙層群體淬滅活性驗(yàn)證平板。待平板凝固后，每個(gè)孔加入200 μL陽(yáng)性菌株發(fā)酵液，30℃培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。

1.4 16S rDNA序列分析

使用16S rDNA通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGGY-TACCTTGTATACGACTT-3′)對(duì)群體淬滅活性菌株的基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增[28]。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共30個(gè)循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證條帶后,將PCR產(chǎn)物送深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)定序列通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)鑒定。

1.5 菌株發(fā)酵和活性物質(zhì)提取

取群體淬滅活性菌株各100 μL置于10 mL MA培養(yǎng)基中，恒溫過(guò)夜振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)液的OD600為1，即得純化培養(yǎng)后的菌株發(fā)酵液。發(fā)酵液于8 000 r/min離心5 min取上清液，用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，除菌保存，獲得無(wú)菌陽(yáng)性菌株的發(fā)酵液上清，即為含有群體淬滅活性物質(zhì)的溶液。

1.6 群體淬滅活性物質(zhì)對(duì)珊瑚病原菌V545和Z-14生長(zhǎng)的影響

以比濁法測(cè)定海洋病原菌生長(zhǎng)曲線[30,31]。微生物生長(zhǎng)曲線是描述微生物生長(zhǎng)狀況的基本指標(biāo)[32]。比濁法測(cè)定生長(zhǎng)量的原理是以細(xì)菌懸浮液的生物量與懸浮液的混濁程度成正比為基礎(chǔ)，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定OD600，間接推斷樣品中微生物總量[33]。

操作步驟：將病原菌V545和Z-14接種到MA液體培養(yǎng)基中，恒溫過(guò)夜振蕩培養(yǎng)至OD600為1，即為病原菌液。取2 mL無(wú)菌陽(yáng)性菌株發(fā)酵液上清與10 mL MA液體培養(yǎng)基混合，接種1%病原菌液。以12 mL MA接種1%病原菌液為空白對(duì)照。25℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間測(cè)定OD600并記錄。至菌株生長(zhǎng)進(jìn)入衰弱期時(shí)停止培養(yǎng)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.7 群體淬滅活性物質(zhì)對(duì)珊瑚病原菌V545和Z-14運(yùn)動(dòng)性的影響

弧菌具有極性鞭毛，可在液體環(huán)境中游動(dòng)，并可在半固態(tài)表面上顯示出運(yùn)動(dòng)性[34]，本實(shí)驗(yàn)采用半固體培養(yǎng)基法分析病原菌運(yùn)動(dòng)性[35]。

操作步驟：將珊瑚病原菌V545和Z-14分別接種至MA培養(yǎng)基中，恒溫過(guò)夜振蕩培養(yǎng)至OD600為1。以MA液體培養(yǎng)基∶菌液=100∶1的比例稀釋珊瑚病原菌發(fā)酵液，將稀釋后的珊瑚病原菌發(fā)酵液與無(wú)菌陽(yáng)性菌株發(fā)酵液上清按1∶1的比例混合，取0.5 μL接種于LB固體培養(yǎng)基平板；將稀釋后的珊瑚病原菌發(fā)酵液與MA液體培養(yǎng)基1∶1混合，取0.5 μL作為空白對(duì)照，每株菌種平行點(diǎn)樣3個(gè)；室溫靜置過(guò)夜培養(yǎng)，記錄菌團(tuán)直徑(mm)。

1.8 群體淬滅活性物質(zhì)對(duì)珊瑚病原菌V545和Z-14生物被膜生成的影響

采用96孔微量板法[36]并參考文獻(xiàn)[36-38]的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行一定改動(dòng)。采用1.7節(jié)培養(yǎng)的珊瑚病原菌V545和Z-14，然后用MA/2液體培養(yǎng)基(濃度為MA液體培養(yǎng)基的一半)將病原菌發(fā)酵液稀釋至OD600為0.05。取100 μL稀釋后的病原菌發(fā)酵液和100 μL無(wú)菌陽(yáng)性菌株發(fā)酵液上清混合，加入96孔聚苯乙烯微培養(yǎng)板，每孔200 μL。另外取100 μL稀釋后的病原菌發(fā)酵液與100 μL MA培養(yǎng)基混合，作為空白對(duì)照，每孔200 μL。每組設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

將微孔板室溫放置24 h后，孔壁上附著一層厚度均勻的薄膜(生物被膜)，小心除去培養(yǎng)液，以一級(jí)水浸洗微孔板，風(fēng)干后用1%結(jié)晶紫染色20 min。待染色完全后，以一級(jí)水浸微孔洗板并風(fēng)干，再加入200 μL無(wú)水乙醇充分溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD570，取3個(gè)復(fù)孔均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 珊瑚共附生菌株的分離與群體淬滅活性

本研究通過(guò)蔗糖密度梯度離心法和原位模擬培養(yǎng)法，共從7類(lèi)不同珊瑚的樣品中分離出256株共附生菌種(未鑒定物種)。如圖1為蔗糖密度梯度離心法稀釋樣品后，在原位模擬環(huán)境下培養(yǎng)出的角珊瑚共附生菌菌落。

圖1 原位模擬培養(yǎng)平板

紫色桿菌 CV12614具備顯著的群體感應(yīng)現(xiàn)象[2]，本研究通過(guò)判斷其紫色菌素的分泌，篩選出群體淬滅活性菌株。由圖2可見(jiàn)，鹿角珊瑚中分離培養(yǎng)出的共附生菌株周?chē)a(chǎn)生透明圈，且仍可見(jiàn)密集無(wú)色的紫色桿菌菌落，說(shuō)明該菌為具群體淬滅活性的陽(yáng)性菌株。同樣原理，從256株共附生菌種中初步篩選出20株具備潛在群體淬滅活性的菌株。

圖2 群體淬滅活性篩選平板

2.2 16S rDNA序列檢測(cè)結(jié)果

對(duì)篩選得到的20株群體淬滅活性菌株進(jìn)行16S rDNA測(cè)序鑒定及BLAST同源性比對(duì)，編號(hào)依次為GXU-HJ-1—20。測(cè)序結(jié)果顯示(表1)：GXU-HJ-1、GXU-HJ-2、GXU-HJ-3、GXU-HJ-4、GXU-HJ-7以及GXU-HJ-13—20等13個(gè)菌株屬于Vibrio屬；GXU-HJ-5、GXU-HJ-6、GXU-HJ-8、GXU-HJ-10、GXU-HJ-11等5個(gè)菌株屬于Ralstonia屬；GXU-HJ-9屬于Bacillus屬，GXU-HJ-12屬于Sphingomonas屬。

2.3 群體淬滅活性物質(zhì)對(duì)病原菌V545和Z-14生長(zhǎng)的影響

菌株GXU-HJ-5、GXU-HJ-8、GXU-HJ-10、GXU-HJ-12、GXU-HJ-18因濃度過(guò)低，無(wú)法獲得有效的生長(zhǎng)曲線，進(jìn)而無(wú)法研究其對(duì)致病菌的運(yùn)動(dòng)情況及對(duì)生物被膜生長(zhǎng)的影響，故不列入后續(xù)研究項(xiàng)目。通過(guò)生長(zhǎng)曲線來(lái)判斷菌株是否有抑制作用，并對(duì)有抑制作用的菌株平穩(wěn)期OD600與空白對(duì)照平穩(wěn)期OD600進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用方差檢驗(yàn)(P值)，檢驗(yàn)抑制作用是否具有顯著差異。結(jié)果顯示(圖3，4)：GXU-HJ-1、GXU-HJ-3、GXU-HJ-7、GXU-HJ-15對(duì)溶珊瑚弧菌V545有抑制作用；其中，GXU-HJ-15抑制作用較輕微，平穩(wěn)期較空白對(duì)照濃度降低了0.53×107cfu/mL；GXU-HJ-1、GXU-HJ-3、GXU-HJ-7抑制作用較明顯，平穩(wěn)期較空白對(duì)照濃度分別降低了0.87×107，0.82×107，2.00×107cfu/mL (P<0.05)。GXU-HJ-4、GXU-HJ-7、GXU-HJ-9、GXU-HJ-19對(duì)溶藻弧菌Z-14有抑制作用。其中GXU-HJ-19抑制作用較輕微，平穩(wěn)期較空白對(duì)照濃度降低了0.73×107cfu/mL，GXU-HJ-4、GXU-HJ-7、 GXU-HJ-9抑制作用較明顯，平穩(wěn)期較空白對(duì)照濃度分別降低了1.63×107，1.83×107，1.39×107cfu/mL (P<0.05)。

表1 群體淬滅菌株

圖3 群體淬滅活性菌株發(fā)酵液對(duì)V545生長(zhǎng)的影響(P<0.05)

2.4 病原菌V545和Z-14的運(yùn)動(dòng)情況

圖5顯示，GXU-HJ-6對(duì)溶珊瑚弧菌V545運(yùn)動(dòng)性有輕微抑制作用，其運(yùn)動(dòng)范圍直徑較空白對(duì)照縮減0.2 mm。圖6顯示，GXU-HJ-1、GXU-HJ-6、GXU-HJ-7、GXU-HJ-14、GXU-HJ-15、GXU-HJ-16、GXU-HJ-19、GXU-HJ-20對(duì)溶藻弧菌Z-14有抑制作用；其中GXU-HJ-1、GXU-HJ-6、GXU-HJ-14、GXU-HJ-19抑制作用較輕微，運(yùn)動(dòng)范圍直徑較空白對(duì)照分別縮減0.3，0.3，0.2，0.3 mm；GXU-HJ-7、GXU-HJ-15、GXU-HJ-16、GXU-HJ-20抑制作用較明顯，運(yùn)動(dòng)范圍直徑較空白對(duì)照分別縮減3.0，0.7，0.5，0.5 mm。

圖5 群體淬滅活性菌株發(fā)酵液對(duì)V545運(yùn)動(dòng)性的影響

圖6 群體淬滅活性菌株發(fā)酵液對(duì)Z-14運(yùn)動(dòng)性的影響

2.5 病原菌V545和Z-14生物被膜生長(zhǎng)情況

如圖7所示，9株菌株對(duì)病原菌V545生物被膜形成具有抑制作用，在溶珊瑚弧菌V545生物被膜形成階段，相同培養(yǎng)條件下，加入GXU-HJ-2、GXU-HJ-3、GXU-HJ-6、GXU-HJ-7、GXU-HJ-11、GXU-HJ-16、GXU-HJ-17、GXU-HJ-19、GXU-HJ-20的提取物后，其形成的生物膜吸光值均低于空白組，抑制率分別為(67.09±7.61)%、(84.18±3.27)%、(73.47±7.98)%、(30.26±1.82)%、(82.95±2.36)%、(72.68±4.70)%、(56.28±6.99)%、(20.29±11.97)%、(81.87±4.85)%(圖7a)。14株菌株對(duì)溶藻弧菌Z-14生物被膜形成具有抑制作用，在相同培養(yǎng)條件下，GXU-HJ-1、GXU-HJ-2、GXU-HJ-3、GXU-HJ-4、GXU-HJ-6、GXU-HJ-7、GXU-HJ-9、GXU-HJ-11、GXU-HJ-13、GXU-HJ-14、GXU-HJ-15、GXU-HJ-16、GXU-HJ-17、GXU-HJ-19對(duì)病原菌Z-14生物被膜生長(zhǎng)的抑制率分別為(93.76±7.13)%、(93.30±5.00)%、(94.31±3.94)%、(95.93±8.62)%、(79.30±3.38)%、(94.51±2.64)%、(91.66±2.55)%、(51.20±1.52)%、(91.19±2.02)%、(93.77±1.76)%、(88.71±4.04)%、(89.62±6.05)%、(95.82±5.25)%、(14.83±0.53)%(圖7b)，有11個(gè)菌株抑制率超過(guò)85%。GXU-HJ-2、GXU-HJ-3、GXU-HJ-6、GXU-HJ-11、GXU-HJ-16、GXU-HJ-17等6個(gè)菌株對(duì)兩種病原菌的生物被膜形成均具有較強(qiáng)的抑制作用。

圖7 群體淬滅活性菌株發(fā)酵液對(duì)病原菌生物被膜生長(zhǎng)的影響

3 討論

本研究在珊瑚共附生微生物中成功篩選出具有群體淬滅活性，且能抑制珊瑚病原菌V545和Z-14生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)及生物膜形成的菌株，說(shuō)明三亞鹿回頭半島三亞灣的珊瑚中具備大量未開(kāi)發(fā)的群體淬滅活性菌種資源。受限于培養(yǎng)條件，本研究中部分菌種難以擴(kuò)大培養(yǎng)，優(yōu)化培養(yǎng)基后或有機(jī)會(huì)發(fā)掘更多群體淬滅活性菌株資源，進(jìn)而在一定程度上改善珊瑚疾病防治現(xiàn)狀。

經(jīng)16S rDNA測(cè)序鑒定，本研究篩選出的群體淬滅活性菌株以弧菌為主，目前關(guān)于群體淬滅活性弧菌的研究較少，如田曉榮等[39]采用平板交互劃線和高通量篩選的方法，從青島近海沉積物生物被膜中分離得到83株共54種具有群體感應(yīng)和群體淬滅活性的細(xì)菌，其中優(yōu)勢(shì)屬為弧菌屬和魯杰氏菌屬；于敏等[40]發(fā)現(xiàn)，纖維弧菌科海洋細(xì)菌中的AHL?；D(zhuǎn)移酶與阿古菌素的AHL酰基轉(zhuǎn)移酶具有同源性。由此推測(cè)，海洋中可能有更多具有群體淬滅活性的弧菌，仍需科研人員進(jìn)一步深入挖掘。

群體淬滅活性微生物的應(yīng)用現(xiàn)今正被一步步開(kāi)發(fā)?？股氐陌l(fā)現(xiàn)與濫用導(dǎo)致病原菌抗性廣泛出現(xiàn)，而群體淬滅能減弱病原菌的致病毒性且不會(huì)產(chǎn)生相關(guān)抗藥性，是近年來(lái)替代抗生素的最有希望策略[41]。如Nhan等[42]應(yīng)用一種N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯降解菌富集培養(yǎng)物(ECs)取代抗生素來(lái)控制疾病，從而實(shí)現(xiàn)更可持續(xù)的水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)。以微生物繁殖代謝為主要原因的高蛋白食品腐敗以及果蔬產(chǎn)品病害對(duì)食品流通及銷(xiāo)售造成了巨大的障礙，阻礙相關(guān)產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，以群體淬滅活性菌作為微生物群體感應(yīng)抑制劑成為食品工業(yè)中新的研究熱點(diǎn)[43]。Vinoj等[44]發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)DAHB1產(chǎn)生的AHL內(nèi)酯酶AiiA能夠抑制弧菌生物被膜的產(chǎn)生，同時(shí)顯著降低蝦的感染率和死亡率。本實(shí)驗(yàn)篩選出的多株群體淬滅活性菌株可為珊瑚疾病的防治提供一定的原材料，推動(dòng)群體淬滅活性菌在珊瑚疾病防治中的研究，并給予生物被膜污染治理提供較新的研究路徑和理論支持。

在后續(xù)研究中，應(yīng)對(duì)以上20株活性菌株進(jìn)行大量發(fā)酵，分離活性物質(zhì)，探究其抑制紫色桿菌QS效應(yīng)的有效成分及抑制機(jī)制；優(yōu)化菌株的培養(yǎng)基配方及外界培養(yǎng)環(huán)境，將具備較高群體淬滅活性的菌株進(jìn)行大批量發(fā)酵；提取純化其活性物質(zhì)，分析其化合物結(jié)構(gòu)，并于珊瑚實(shí)驗(yàn)缸中進(jìn)行初步抑制珊瑚白化的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。相關(guān)成果可為國(guó)內(nèi)珊瑚礁生態(tài)修復(fù)工作提供支持，為研發(fā)新藥物抑制群體感應(yīng)型細(xì)菌感染提供有力依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究選用蔗糖密度梯度離心法稀釋珊瑚提取物，模擬珊瑚原生內(nèi)環(huán)境配制原位模擬培養(yǎng)基，在三亞鹿回頭半島三亞灣珊瑚礁的7類(lèi)珊瑚中分離出256株珊瑚共生菌。根據(jù)紫色桿菌嚴(yán)格受QS調(diào)控產(chǎn)紫色菌素的特性，利用紫色桿菌CV12614作模式菌，對(duì)珊瑚共生菌進(jìn)行多次篩選培養(yǎng)，得到20株具群體淬滅活性的菌株。經(jīng)16S rDNA測(cè)序鑒定，群體淬滅活性菌株大部分為弧菌屬。結(jié)合比濁法以及半固體培養(yǎng)基法，分析群體淬滅活性菌株對(duì)兩種珊瑚病原菌溶珊瑚弧菌V545和溶藻弧菌Z-14生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)的影響，結(jié)果顯示，5株菌株對(duì)溶珊瑚弧菌V545的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)有抑制作用，10株菌株對(duì)溶藻弧菌Z-14的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)有抑制作用。擴(kuò)展研究表明，9株菌株對(duì)溶珊瑚弧菌V545生物被膜形成具有抑制作用，14株菌株對(duì)溶藻弧菌Z-14生物被膜形成具有抑制作用。上述結(jié)果證實(shí)珊瑚共附生的群體淬滅活性菌對(duì)弧菌的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)及生物被膜形成具有抑制作用。