溶藻細(xì)菌FS1的溶藻效果與機(jī)制初探

母銳敏， 賈靜靜， 張盛至

(1．山東建筑大學(xué) 市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101;2. 山東億能工程設(shè)計(jì)有限公司,山東 濟(jì)南 250101)

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溶藻細(xì)菌FS1的溶藻效果與機(jī)制初探

母銳敏1， 賈靜靜2， 張盛至1

(1．山東建筑大學(xué) 市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101;2. 山東億能工程設(shè)計(jì)有限公司,山東 濟(jì)南 250101)

近年來，由水體富營養(yǎng)化引發(fā)的藍(lán)藻水華頻繁暴發(fā)，對(duì)水體生態(tài)系統(tǒng)平衡產(chǎn)生了重大影響，給人類健康也帶來嚴(yán)重威脅。生物法除藻具有高效性、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，因此，如果能獲得具有較高溶藻效率的溶藻細(xì)菌，選擇生物法除藻更為理想。從菏澤一富營養(yǎng)化池塘分離得到1株溶藻細(xì)菌FS1，經(jīng)16S rDNA測(cè)序分析鑒定為芽胞桿菌屬。實(shí)驗(yàn)以銅綠微囊藻為研究對(duì)象，采用血球計(jì)數(shù)板法計(jì)算反應(yīng)前后藻細(xì)胞的濃度，對(duì)不同生長階段溶藻細(xì)菌FS1的溶藻效果進(jìn)行了探究。停滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期的除藻率分別為7.1%、24.3%、57.0%和45.5%，結(jié)果表明，處于穩(wěn)定期的FS1對(duì)銅綠微囊藻的去除效果最佳。細(xì)菌溶藻方式的研究結(jié)果表明，溶藻細(xì)菌是通過分泌溶藻物質(zhì)間接溶解藻細(xì)胞。

溶藻細(xì)菌；除藻率；溶藻方式；銅綠微囊藻

近年來，由水體富營養(yǎng)化引起的有害藻類水華頻繁暴發(fā)，嚴(yán)重影響著生態(tài)環(huán)境的平衡[1-3]，對(duì)人類的健康也產(chǎn)生了威脅。對(duì)于水體富營養(yǎng)化的治理，主要有物理方法、化學(xué)方法和生物方法[4-6]，但前兩者投資大，且對(duì)水環(huán)境產(chǎn)生二次污染[7-8]，而生物除藻由于具有高效性、環(huán)境友好等特點(diǎn)，使其作為生物控藻手段顯示出極大的潛力[9]。溶藻細(xì)菌被發(fā)現(xiàn)以來一直得到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。溶藻細(xì)菌的作用方式有直接溶藻和間接溶藻[10]，直接溶藻是溶藻細(xì)菌自身直接作用于藻細(xì)胞，使藻細(xì)胞溶解；間接溶藻是溶藻細(xì)菌通過分泌胞外溶藻物質(zhì)溶藻或者細(xì)菌同藻競(jìng)爭營養(yǎng)物質(zhì)。本研究以水華常見藻類銅綠微囊藻為研究對(duì)象，溶藻細(xì)菌FS1分離自菏澤一富營養(yǎng)化池塘，針對(duì)溶藻細(xì)菌FS1對(duì)銅綠微囊藻的溶藻效果及其溶藻機(jī)理進(jìn)行了初步探究，通過16S rDNA序列分析對(duì)FS1進(jìn)行鑒定，并建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藻種 供試藻種為銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)，來源于中國科學(xué)院水生生物研究所藻種保藏中心(FACHB)，編號(hào)905，藻種活化后接種于BG11培養(yǎng)基中，置于人工氣候室中靜置培養(yǎng)，溫度25 ℃，光照強(qiáng)度2 500 Lx，光暗周期比12 h∶12 h[11]。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) 細(xì)菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。液體LB培養(yǎng)基：NaCl 10，酵母粉5，胰蛋白胨10；固體LB培養(yǎng)基：NaCl 10，酵母粉5，胰蛋白胨 10，瓊脂15；銅綠微囊藻培養(yǎng)基為BG11培養(yǎng)基[12]：NaNO31.500，K2HPO40.040，MgSO4·7H2O 0.075，CaCl2·2H2O 0.036，檸檬酸0.006，檸檬酸鐵胺0.006，EDTA-2Na 0.001，NaCO30.020，A51 mL/L(A5溶液配方(g/L)：H3BO32.860，MnCl2·4H2O 1.810，ZnSO4·7H2O 0.222，NaMOO4·2H2O 0.030，CuSO4·5H2O 0.079，Co(NO3)2·6H2O 0.049)。

1.1.3 儀器 高速冷凍離心機(jī)(CR21GⅡ)，立式壓力蒸汽滅菌器(澄醫(yī)LS-B35L型)，超凈工作臺(tái)(博科13BS-SDC)，恒溫?fù)u床(上海天呈TS-100B)，顯微鏡(XSP-4C)，紫外分光光度計(jì)(VARIAN Cary50Probe)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離 用無菌移液管吸取1 mL取自富營養(yǎng)化池塘的水樣，加入9 mL無菌水中，制成10-1稀釋液，依此類推，制成10-2、10-3、10-4、10-5和10-6梯度稀釋液[13-14]。各吸取0.2 mL稀釋液置于相應(yīng)編號(hào)的平板中，每個(gè)梯度3個(gè)平行樣，將平板倒置于人工氣候室中培養(yǎng)72 h后，采用劃線法進(jìn)一步純化，得到純菌株。

1.2.2 細(xì)菌溶藻效果 挑取純化的菌落轉(zhuǎn)接到50 mL滅菌的液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)至OD600值為2.0(菌體含量在109個(gè)/mL左右)。向菌液中按1∶3的比例加入150 mL稀釋藻液(將實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)至穩(wěn)定期的銅綠微囊藻液稀釋10倍，藻細(xì)胞個(gè)數(shù)在107個(gè)/mL左右)。4 d 內(nèi)觀察溶藻效果。采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)方法[15]對(duì)藻細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)藻細(xì)胞數(shù)量的變化描述溶藻效果。

本研究中計(jì)數(shù)板為1 mm×1 mm方格25×16型，計(jì)數(shù)時(shí)，數(shù)左上、左下、右上、右下和中間5個(gè)(80小格)藻細(xì)胞數(shù)，計(jì)算公式：

藻細(xì)胞數(shù)(mL)=(80小格細(xì)胞總數(shù)/80)×400×10 000×稀釋倍數(shù)

式中,C1為實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞數(shù)，C2為對(duì)照組藻細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 細(xì)菌溶藻方式 將細(xì)菌轉(zhuǎn)接到50 mL液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)至OD600值為2.0(菌體含量在109個(gè)/mL左右)，制成原菌液。采取高溫滅菌和高速離心處理原菌液[15-17]，得到高溫滅菌(121 ℃，20 min)后的菌液、離心(12 000 r/min，20 min)沉降后的上清液和離心后的菌體。離心后的菌體加入150 mL無菌水，制成菌懸液。按1∶3的比例加入150 mL稀釋藻液，對(duì)照組為50 mL液體培養(yǎng)基加150 mL稀釋藻液。放入搖床(30 ℃，180 r/min)中反應(yīng)，4 d內(nèi)觀察對(duì)比溶藻效果。

1.2.4 細(xì)菌生長曲線 用無菌移液管吸取1 mL 1.2.3中培養(yǎng)的原菌液于200 mL滅菌的培養(yǎng)基中，再于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，進(jìn)入穩(wěn)定期前每隔1 h取樣，進(jìn)入穩(wěn)定期后每隔2 h取樣，用分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)取菌液吸光度值，繪制生長曲線[18]。

1.2.5 細(xì)菌不同生長期對(duì)銅綠微囊藻生長的影響 根據(jù)1.2.4中的生長曲線，分別選取處于停滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期菌液。向菌液中按1∶3的比例加入150 mL稀釋藻液，設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組為50 mL滅菌的培養(yǎng)基加150 mL稀釋藻液。加入藻液4 d內(nèi)觀察溶藻效果。

1.2.6 16S rDNA序列分析 16S rDNA序列的相似性分析有助于溶藻細(xì)菌的分子生物學(xué)研究，也是溶藻細(xì)菌屬性分類的關(guān)鍵指標(biāo)[19]。本研究溶藻細(xì)菌FS1的16S rDNA序列分析由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司測(cè)定。對(duì)測(cè)定的溶藻細(xì)菌FS1的16S rDNA序列應(yīng)用Blast程序和GenBank中的已知序列進(jìn)行相似性對(duì)比，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶藻細(xì)菌分離

從水樣中分離得到6株細(xì)菌，編號(hào)為FS1～FS6，其中FS1的溶藻效果最為明顯，其菌落為微凸型白色圓形菌落。

FS1菌液剛加入藻液時(shí)與加入藻液4 d后進(jìn)行對(duì)比。加入藻液4 d后，對(duì)照組仍為綠色；實(shí)驗(yàn)組中的菌藻混合液由綠色變成黃色，最終完全黃化。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，視野中藻細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。通過對(duì)比可知，在溶藻細(xì)菌FS1的作用下，藻細(xì)胞大量死亡并且葉綠素被破壞，所以藻菌混合液顏色變黃，可初步判定細(xì)菌FS1為溶藻細(xì)菌。圖1為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中藻細(xì)胞的數(shù)量變化對(duì)比，根據(jù)1.2.2中除藻率計(jì)算公式，計(jì)算出加入藻液后1、2、3和4 d的除藻率分別為32.6%、42.8%、51.2%和54.8%，具有顯著的溶藻效果。

圖1 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞數(shù)量變化Fig.1 The changment of control group and experimental group with Microcystis aeruginosa cells

2.2 溶藻細(xì)菌FS1的溶藻方式

反應(yīng)4 d后，不同方式處理后菌液的溶藻效果如圖2所示，原菌液和上清液的除藻率分別為54.8%和62.0%，高溫?zé)崽幚硪汉途鷳乙旱某迓史謩e為6.4%和9.6%。高溫?zé)崽幚砗途鷳乙旱娜茉逍Ч伙@著，然而菌懸液的除藻率高于高溫?zé)崽幚硪?，說明實(shí)驗(yàn)過程中菌懸液中的細(xì)菌恢復(fù)了溶藻能力，但是處于無菌水中的菌體沒有在液體培養(yǎng)基中活性高，所以溶藻效果與原菌液差距較大。上清液仍有較好的溶藻效果，而菌懸液除藻率僅為9.6%，說明細(xì)菌FS1不是與藻細(xì)胞直接接觸溶藻，而是通過分泌溶藻物質(zhì)間接溶藻[20]。

圖2 反應(yīng)4 d后不同方式處理后的FS1菌液的溶藻效果Fig.2 The algicidal effect of bacterium FS1 with different treatment after four days

2.3 細(xì)菌生長曲線的測(cè)定

由圖3可看出細(xì)菌FS1在0～1 h處于停滯期，1～8 h處于對(duì)數(shù)生長期，8～18 h處于穩(wěn)定期，18 h后進(jìn)入衰亡期。FS1是從液體培養(yǎng)基接種到液體培養(yǎng)基，生長環(huán)境基本沒變，停滯期較短。參考《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[21]代時(shí)計(jì)算公式，計(jì)算出代時(shí)G=1.93 h，因?yàn)榇鷷r(shí)短細(xì)菌生長速率大，濃度增長快，所以溶藻細(xì)菌FS1能夠在短時(shí)間內(nèi)滿足溶藻對(duì)細(xì)菌濃度的要求[16]。

圖3 細(xì)菌FS1的生長曲線Fig.3 Growth curve of bacterium FS1

2.4 細(xì)菌不同生長期對(duì)銅綠微囊藻的溶解效果

不同生長期菌液的溶藻效果如圖4所示。停滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期的除藻率分別為7.1%、24.3%、57.0%和45.5%。不同生長期的細(xì)菌均有一定的溶藻效果，但停滯期和對(duì)數(shù)期的菌液的溶藻能力遠(yuǎn)不及穩(wěn)定期和衰亡期，這可能與細(xì)菌在生長階段合成的溶藻物質(zhì)積累有關(guān)，對(duì)于間接溶藻的細(xì)菌FS1來說，溶藻物質(zhì)越多除藻率越高，穩(wěn)定期和衰亡積累的溶藻物質(zhì)最多，溶藻效果最好。但衰亡期的除藻率低于穩(wěn)定期，推斷是衰亡期的次代謝產(chǎn)物對(duì)溶藻效果產(chǎn)生了一定的抑制作用。盧蘭蘭等[22]也討論了溶藻細(xì)菌不同生長期的溶藻效果，穩(wěn)定期與衰亡期的溶藻能力最強(qiáng)。

圖4 反應(yīng)4 d后不同生長期菌液的溶藻效果Fig.4 The algicidal effect of different growth periods after four days

2.5 溶藻細(xì)菌FS1的16S rDNA序列分析

將FS1的16S rDNA序列分析結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast相似性檢索分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖5)。由圖5可知，F(xiàn)S1與芽胞桿菌同源性為99%，初步鑒定為芽胞桿菌屬，GenBank中收錄號(hào)為KC523393。

圖5 溶藻細(xì)菌FS1系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of bacterium FS1

3 討 論

本文以探究藍(lán)藻水華的微生物控制為目的，選擇導(dǎo)致藍(lán)藻水華暴發(fā)的常見藻類銅綠微囊藻為研究目標(biāo)，詳細(xì)研究了溶藻細(xì)菌FS1的溶藻特性，初步探究了FS1的溶藻機(jī)理，并從分子生物學(xué)水平上對(duì)溶藻細(xì)菌FS1進(jìn)行了鑒定。

細(xì)菌溶藻技術(shù)研究的基礎(chǔ)是溶藻細(xì)菌的分離，篩選出高效、專一的溶藻細(xì)菌，并開發(fā)出安全、高效的生物殺藻劑，已日漸成為控制與治理藍(lán)藻水華的新思路。本研究以藍(lán)藻水華水體為分離源，共分離出6株純細(xì)菌，選擇溶藻效果顯著的FS1溶藻細(xì)菌作為實(shí)驗(yàn)菌株，對(duì)溶藻細(xì)菌FS1利用16S rDNA序列分析方法進(jìn)行鑒定，通過序列同源性比較分析和建立系統(tǒng)發(fā)育樹表明溶藻細(xì)菌FS1屬于芽胞桿菌屬。對(duì)FS1的溶藻機(jī)理進(jìn)行初步探究，研究不同方式處理的菌液的溶藻效果，結(jié)果表明，上清液的溶藻效果最好。通過分析得知FS1是通過釋放溶藻物質(zhì)間接溶藻，釋放的胞外溶藻物質(zhì)為非耐高溫物質(zhì)，在高溫下失去溶藻活性。溶藻細(xì)菌的溶藻效果與細(xì)菌生長周期密切相關(guān)。對(duì)FS1處于停滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期的菌液進(jìn)行溶藻效果研究，結(jié)果表明，F(xiàn)S1對(duì)銅綠微囊藻的溶藻效果在穩(wěn)定期最好，衰亡期次之。這可能與細(xì)菌在生長階段合成的溶藻物質(zhì)積累有關(guān)，隨著細(xì)菌的生長溶藻物質(zhì)積累越多，溶藻效果越好，而在衰亡期，產(chǎn)生的次代謝產(chǎn)物對(duì)溶藻效果產(chǎn)生了一定的抑制作用。

本研究中分離的溶藻細(xì)菌FS1來源于自然水體，與環(huán)境有很好的相容性，與其他來源的細(xì)菌相比安全性更高，溶藻能力更具有針對(duì)性。由于FS1是通過分泌溶藻物質(zhì)間接溶解藻細(xì)胞，對(duì)不同生長期細(xì)菌的溶藻效果進(jìn)行研究是為了確定細(xì)菌何時(shí)溶藻效果最強(qiáng)，進(jìn)而為今后的實(shí)際應(yīng)用提供參考。生物除藻法是利用生物間的營養(yǎng)競(jìng)爭和食物鏈關(guān)系來控制藍(lán)藻水華，從整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的管理角度深入，具有經(jīng)濟(jì)性、合理性和高效性的特點(diǎn)，將成為控藻的主要手段。

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Initial Investigation on Algicidal Effect and Mechanism of Algae-lytic Bacteria FS1

MU Rui-min1, JIA Jing-jing2, ZHANG Sheng-zhi1

(1.Schl.ofMuni. &Environm’lEngin.,ShandongArchitec.Uni., 2.ShandongYiNengEngineeringDdsignCo.,Ltd,Jinan250101)

In recent years, frequent breaking out of algal blooms caused by eutrophication of waters have affected balance of waters ecological system eventfully, also seriously threatened human health. The algae elimination with biological method has the advantages of efficiency and environmental friendly. Therefore, it is an ideal matter to select biological method to eliminate the algae if a fairly effective an algae-lytic bacterium could be obtained. In this study, an algae-lytic bacterium named FS1 was isolated from an eutrophication pond in Heze, and identified asBacillussp. by the 16S rDNA sequence analysis. The experiment tookMicrocystisaeruginosaas the subject of the study. The algae-lytic effect of the algae-lytic bacterium FS1 in its different stage of growth was investigated adopting hemacytometer to calculate the concentration of algae cell. The algicidal effect of FS1 in its stagnant, logarithmic, stationary, and declining periods were at 7.1%, 24.3%, 57.0%, and 45.5% respectively. The results showed that the bacterium FS1 in its stationary growth period had the best removal rates againstMicrocystisaeruginosa. The research result of algicidal mode suggested that the bacterium FS1 lysedM.aeruginosaby excreting algae-lytic substance to lyse the algae cell indirectly.

algae-lytic bacteria; algicidal rate; algae-lytic mode;Microcystis aeruginosa

國家自然科學(xué)基金(51078224)；山東省中青年科學(xué)家獎(jiǎng)勵(lì)基金(BS2011SW024)；山東建筑大學(xué)博士基金(XNBS0910)

母銳敏 女，副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)樗廴究刂评碚撆c技術(shù)研究。E-mail: ruiminmu@163.com

2014-04-01；

2015-01-15

Q939.99;X172

A

1005-7021(2015)06-0016-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.06.003