病原體逃逸中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)機(jī)制

夏 杰， 王 蓉

(黃岡職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)藥衛(wèi)生學(xué)院，湖北 黃岡 438000)

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病原體逃逸中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)機(jī)制

夏 杰， 王 蓉

(黃岡職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)藥衛(wèi)生學(xué)院，湖北 黃岡 438000)

中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)是新發(fā)現(xiàn)的中性粒細(xì)胞抗病原機(jī)制，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。但病原體在進(jìn)化中形成了針對NETs的免疫逃逸機(jī)制。不同的病原體逃逸NET的機(jī)制不同，本文主要介紹3種機(jī)制：降解NETs-DNA、表面分子機(jī)制和NETosis調(diào)控。

中性粒細(xì)胞；中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)；免疫逃逸；病原體

中性粒細(xì)胞是人體天然免疫系統(tǒng)抗病原微生物的第一線效應(yīng)細(xì)胞。中性粒細(xì)胞通過吞噬作用、脫顆粒作用與形成胞外誘捕網(wǎng)(NETs)參與病原體感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)[1]。NETs是近年來發(fā)現(xiàn)的中性粒細(xì)胞新的抗病原體機(jī)制。2004年，Brinkmann等[2]發(fā)現(xiàn)IL-8或PMA處理過的中性粒細(xì)胞在胞外產(chǎn)生一種纖維狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這些纖維狀結(jié)構(gòu)由染色質(zhì)DNA、組蛋白以及顆粒源蛋白構(gòu)成并且具有抗菌作用。利用透射電子顯微鏡(TEM)、掃描電子顯微鏡(SEM)、免疫熒光和活細(xì)胞成像技術(shù)，Brinkmann等觀察到中性粒細(xì)胞在IL-8、PMA的刺激作用下，核膜和顆粒膜崩解，染色質(zhì)DNA、組蛋白以及顆粒源蛋白等成分混合，并隨著細(xì)胞膜的崩解而釋放出來，即NETs。中性粒細(xì)胞的這種死亡程序稱為NETosis。NETs是中性粒細(xì)胞針對病原體的天然免疫反應(yīng)。NETs結(jié)構(gòu)阻止了病原體擴(kuò)散，并維持抗菌物質(zhì)在局部聚集，有利于病原體及其毒力因子的清除和殺滅[3]。NETs對細(xì)菌、病毒、真菌等病原體都有不同程度的抗感染作用，而這些病原體也通過不同的策略逃逸NETs的捕獲[4]。本文主要討論病原微生物針對NETs的免疫逃逸機(jī)制。

1 降解NETs-DNA

1.1 脫氧核糖核酸酶(DNase)

許多病原菌可以產(chǎn)生DNase，早已證明這種酶利于感染菌的擴(kuò)散。最近的研究表明DNase與病原微生物逃逸NETs的捕殺有關(guān)。A群鏈球菌(GAS)與許多人類疾病相關(guān)。Sumby等[5]對M1血清型 GAS菌株MGAS5005 基因測序，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)編碼DNases的基因。進(jìn)一步通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這3個(gè)基因滅活的突變菌株毒性明顯較低，活體內(nèi)清除速度更快。Buchanan等[6]假設(shè)GAS通過DNase降解NETs-DNA逃逸NETs介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞殺傷作用，他們運(yùn)用等位基因替代、單基因互補(bǔ)和異源表達(dá)等分子遺傳學(xué)方法，利用壞死性筋膜炎小鼠模型作為感染載體，對能產(chǎn)生DNase的野生型M1血清型GAS菌株和不能產(chǎn)生DNase的同基因型M1ΔSda1突變菌株進(jìn)行對照試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DNase能促進(jìn)NETs的降解，從而增強(qiáng)GAS在體內(nèi)的存活能力和毒性；相反，DNase阻斷劑G-肌動蛋白(G-actin)可在體外增強(qiáng)中性粒細(xì)胞清除GAS，體內(nèi)降低GAS毒性。所以，表達(dá)DNase的GAS能對抗NET介導(dǎo)的殺菌途徑。因此，設(shè)計(jì)消除DNAse活性或維持NETs完整性的藥物，可以作為抗菌治療的輔助治療藥物。

1.2 核酸內(nèi)切酶A(Endonuclease A, EndA)

肺炎鏈球菌是社區(qū)獲得性肺炎最常見的病原體，大量中性粒細(xì)胞浸潤是其主要特點(diǎn)之一。由于肺炎鏈球菌表達(dá)抗吞噬莢膜，所以在感染早期中性粒細(xì)胞吞噬作用起效甚微。已知肺炎鏈球菌TIGR4(血清型4)endA基因是化膿性鏈球菌DNase基因spd和sda的同源基因，表達(dá)一種膜結(jié)合核酸內(nèi)切酶(EndA)。Beiter等[7]用TIGR4感染PMA處理的中性粒細(xì)胞，5 min后觀察到TIGR4被NETs捕獲，但并沒有檢測到TIGR4被NETs或吞噬作用殺滅，他們將釋放NETs的中性粒細(xì)胞分別與牛胰源DNase、TIGR4Δ(endA)(endA敲除突變體)和TIGR4共培養(yǎng)30 min，結(jié)果顯示，牛胰源DNase或TIGR4能降解NETs，破壞NETs完整性，而TIGR4Δ(endA)不能破壞NETs完整性。因此，EndA具有DNase功能，能破壞NETs的結(jié)構(gòu)。為了證實(shí)EndA是否有助于GAS逃逸NETs，Beiter等[7]進(jìn)一步將PMA處理的中性粒細(xì)胞分別感染 TIGR4(血清型4)、TIGR4Δ(endA)(endA敲除突變體)和TIGR4Δ(endA) (endA) (逆轉(zhuǎn)體)3種菌株，30 min后，不能產(chǎn)生EndA的TIGR4Δ(endA)依然被NETs纏繞，而能產(chǎn)生EndA的TIGR4和TIGR4Δ(endA)(endA)逃離NETs，并且NETs被嚴(yán)重破壞。因此，EndA能夠有效降解NET-DNA骨架，逃逸NETs的捕殺；將這種核酸內(nèi)切酶作為靶點(diǎn)是一種有前途的抗菌治療策略[8]。Beiter等[7]還檢測了7種不同莢膜型(血清型1、3、4、7F、14、19F)肺炎鏈球菌菌株，表明除血清型1菌株外，其他都表現(xiàn)出很強(qiáng)的EndA活性。因此，降解NETs是各型肺炎鏈球菌逃逸NETs的普遍策略。盡管所有致病肺炎鏈球菌都被檢測出表達(dá)EndA并能破壞NETs，但不同類型菌株表達(dá)EndA水平不同，相應(yīng)致病能力也不同。因此，對于這種高度可變菌種而言，不同菌株可能被賦予不同的致侵襲性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

2 病原表面分子機(jī)制

2.1 分子模擬

唾液酸(Sias)一般只在多細(xì)胞生物細(xì)胞表面表達(dá)，是一類定位于復(fù)合多糖末端的九碳糖酸[9]。人類嗜中性粒細(xì)胞 Siglec-9是一種能夠識別Sias的凝集素，Siglec-9識別宿主細(xì)胞Sias作為“自我”的標(biāo)志，負(fù)性調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞活性[10]。少數(shù)細(xì)菌也表達(dá)Sias，如B群鏈球菌(GBS)、大腸埃希菌K1(EscherichiacoliK1)、腦膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)、空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)等[9]。BSAb是一種能阻斷Sias與Siglec-9結(jié)合的抗Siglec-9IgG單克隆抗體，NBSAb是一種不能阻斷Sias與Siglec-9結(jié)合的抗Siglec-9IgG單克隆抗體，Carlin等[10]利用這兩種抗體作為區(qū)分是否阻斷Sias結(jié)合位點(diǎn)的試劑，研究了GBS與中性粒細(xì)胞的相互作用關(guān)系。實(shí)驗(yàn)顯示，存在BSAb情況下，相對于NBSAb，GBS刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生更強(qiáng)的氧爆作用，釋放更多的顆粒蛋白酶和產(chǎn)生更多的NETs。因此，GBS可通過Sias或Siglec-9依賴的方式反式作用于中性粒細(xì)胞，降低其活性。

雖然沒有文獻(xiàn)報(bào)道銅綠假單胞菌(PA)可以合成Sias，但Khatua等[11]證實(shí)PA可以從周圍環(huán)境中直接吸附Sias，并通過與中性粒細(xì)胞siglec-9 的交互作用減少其活性氧族(ROS)和彈性蛋白酶(elastase)的產(chǎn)生，進(jìn)而弱化ROS和elastase介導(dǎo)的 NETs形成。PA通過這種方式實(shí)現(xiàn)了免疫逃逸。在某些病理情況下血清Sias水平顯著升高，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨髓瘤、晚期癌和肺結(jié)核等[12]。而這些疾病對PA高度易感，可能與 PA吸附Sias有關(guān)。和PA一樣，某些革蘭陰性菌也可以從周圍環(huán)境吸附Sias，如嗜血桿菌(Haemophilusinfluenza)、多殺巴斯德菌(Pasteurellamultocida)和 杜克雷嗜血桿菌(Haemophilusducrey)等[13]。Khatua等[11]認(rèn)為，吸附Sias可能是那些不能合成Sias病原體實(shí)現(xiàn)免疫逃逸的一種普遍性的方式。

2.2 分子限定

煙曲霉菌(A.fumigatus)是一種重要的空氣傳播致病真菌，致使免疫力低下的患者發(fā)生致命感染。分生孢子(conidia)是真菌產(chǎn)生的一種形態(tài)較小的無性繁殖體，被吸入呼吸道后遭遇由巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞構(gòu)成的天然免疫系統(tǒng)。分生孢子主要由巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞殺滅，菌絲由中性粒細(xì)胞殺滅[14]。已知疏水蛋白RodA(hydrophobin RodA)是煙曲霉菌表面主要的蛋白質(zhì)組分， RodA主要表達(dá)于休眠分生孢子(resting conidia),在腫脹分生孢子(swollen conidia)上數(shù)量減少，菌絲(hyphae)完全缺乏[15]。Aimanianda等[16]證實(shí)RodA可以降低天然免疫系統(tǒng)的活性。Bruns等[14]用雙光子顯微鏡技術(shù)(two-photon microscopy)適時(shí)觀察了煙曲霉菌感染小鼠的肺組織，發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞浸潤并形成NETs。為了進(jìn)一步明確RodA與NETs的關(guān)系，Bruns等[14]分析了因ΔrodA突變RodA缺陷的休眠和腫脹分生孢子，明確了RodA對NETs形成的影響。結(jié)果表明，與野生型相比，中性粒細(xì)胞遇到ΔrodA突變腫脹和休眠分生孢子時(shí)NETs形成顯著增加。其中ΔrodA突變休眠分生孢子誘導(dǎo)NETs形成的作用比任何形式的菌絲還強(qiáng)。將純化RodA 加入ΔrodA突變分生孢子可減少NETs形成。這表明RodA是抑制中性粒細(xì)胞NETs形成的主要因素，同時(shí)也提示，休眠體分生孢子本身能強(qiáng)效誘導(dǎo)NETs形成，只是這種作用被RodA所屏蔽。Bruns等[14]推測是RodA隱藏了免疫活性蛋白或胞壁糖等成分，這種推測可以解釋為何菌絲比休眠或腫脹分生孢子具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)NETs形成的能力。因此, RodA有利于曲霉菌逃逸NETs介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，構(gòu)成了煙曲霉菌逃逸中性粒細(xì)胞的一個(gè)分子限定途徑。

3 NETs/NETosis調(diào)控

Jenne等[17]通過小鼠感染模型實(shí)驗(yàn)證明病毒感染可以使中性粒細(xì)胞在肝臟脈管系統(tǒng)募集并誘導(dǎo)NETs形成，同時(shí)指出NETs在早期抗病毒免疫，限制病毒擴(kuò)散方面發(fā)揮重要作用。然而，很多研究表明在某些炎癥性疾病中NETs表現(xiàn)出組織損傷特性，包括某些病毒性肺炎。

貓白血病病毒(Feline leukemia virus ，F(xiàn)eLV)是一種在貓科動物間傳播的逆轉(zhuǎn)錄病毒，60%的感染動物可建立體液免疫形成高滴度中和抗體，30%不能建立有效體液免疫而發(fā)生持久病毒感染，可導(dǎo)致致命的腫瘤，造血系統(tǒng)的退化以及免疫系統(tǒng)缺陷，因此，F(xiàn)eLV感染常被人類用來作為研究HIV的模型[18]。已知FeLV可以降低中性粒細(xì)胞的功能。為了明確FeLV對NETs形成的影響，Wardini等[19]對FeLV陰性和FeLV陽性無癥狀以及 FeLV陽性有癥狀的3組貓的中性粒細(xì)胞進(jìn)行對照研究。在利士曼原蟲前鞭毛體(Leishmaniapromastigotes)的刺激下，F(xiàn)eLV陰性和FeLV陽性無癥狀貓中性粒細(xì)胞NETs形成量顯著高于FeLV陽性有癥狀貓中性粒細(xì)胞。然而，在沒有利士曼原蟲前鞭毛體的刺激時(shí)候，情況卻完全相反。這些現(xiàn)象表明NETs被FeLV調(diào)節(jié)；FeLV感染耗竭了NETs抗菌機(jī)制，為其他病原體逃逸NET創(chuàng)造了條件。

HIV-1屬于慢病毒亞科的一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，通過感染人CD4+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞摧毀人的免疫系統(tǒng)，最終發(fā)展為AIDS。已知髓過氧化物酶(MPO)和α-防御素(α-defensin)存在于NETs上，可滅活HIV-1[20]。Saitoh等[21]對NETs抗HIV-1反應(yīng)進(jìn)行了深入研究。研究顯示HIV誘導(dǎo)NETosis，并且通過超分辨率結(jié)構(gòu)照明顯微鏡(SR-SIM)觀察到HIV被NETs捕獲。NETs不僅能限制HIV，還能通過MPO和α-防御素降低其感染性。因此，NETs在天然免疫抗HIV中發(fā)揮重要作用。然而，HIV可以雇傭某些免疫細(xì)胞以促其繁殖，尤其是樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs) 。如HIV與DCs特異性細(xì)胞間粘附分子DC-SIG N(也稱為CD209)結(jié)合，促進(jìn)感染CD4+T 細(xì)胞[22]。Saitoh等[21]研究表明，HIV與孤立DCs結(jié)合導(dǎo)致一種NETosis抑制因子產(chǎn)生；重組gp120(HIV的一種膜糖蛋白)處理DCs可產(chǎn)生相同效應(yīng)；抗CD209中和抗體可阻斷此效應(yīng)，深入的分析發(fā)現(xiàn)，這種抑制因子是 IL-10。因此，HIV不僅通過DCs的CD209感染CD4+T細(xì)胞,也通過依賴gp120-CD209途徑下調(diào)NETosis，逃避NETs的捕殺。HIV感染個(gè)體容易繼發(fā)肺結(jié)核、肺炎鏈球菌等感染。所以，這些發(fā)現(xiàn)在抗艾滋病治療中如何維持天然免疫功能有重大指導(dǎo)意義。

綜上所述，NET是新發(fā)現(xiàn)的中性粒細(xì)胞抗病原機(jī)制。病原體在進(jìn)化中形成了針對NETs的免疫逃逸現(xiàn)象。這種針對NETs的免疫逃逸現(xiàn)象反過來也證明了NETs在天然免疫中的重要作用。病原體逃逸NETs的原理在臨床上已經(jīng)有所運(yùn)用，如臨床上使用重組脫氧核糖核酸酶(rhDNAse)清除肺囊性纖維化(CF)患者氣道內(nèi)的濃稠黏液，主要成分是NETs，其實(shí)是模仿鏈球菌的策略；對 AIDS而言，如果能消減 IL-10的效應(yīng)可能有利于降低繼發(fā)性感染率。然而，針對病原體逃逸NETs機(jī)制的臨床療法還有待進(jìn)一步研究。所以，深入研究病原逃逸NETs的分子機(jī)制，為預(yù)防和治療感染性疾病提供新的研究方向和前景。

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Mechanism of Pathogen Escape from Neutrophil Extracellular Traps (NETs)

XIA Jie, WANG Rong

(Med&HealthColl.,HuanggangPolytech.Uni.,Huanggang438000)

Neutrophil extracellular trap (NET) is a new discovered pathogen-resistant mechanism of neutrophil, it is considered to be the important component of the human innate immunity system. However, during the evolution process the pathogens have formed the mechanism of immune escape against NETs. Different pathogens have different NET escaping mechanisms, such as NETs-DNA degradation, surface molecule and modulation of NETosis were briefly introduced in this paper.

neutrophils; neutrophil extracellular traps (NETs); immune escape; pathogen

夏杰 男，主治醫(yī)師。現(xiàn)從事生物化學(xué)與免疫學(xué)的教學(xué)與研究工作。Tel：0713-8346091，E-mail:1787315922@qq.com

2014-10-30；

2015-04-21

Q939.91;R392.1

A

1005-7021(2015)06-0086-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.06.017