一株褐煤內(nèi)源菌對(duì)平莊褐煤的溶解轉(zhuǎn)化*

成建國(guó) 馬力通，2 趙文淵 劉云穎 林 雨

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，014010 內(nèi)蒙古包頭；2.生物煤化工綜合利用內(nèi)蒙古自治區(qū)工程研究中心，014010 內(nèi)蒙古包頭；3.太原理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，030024 太原)

0 引 言

煤炭是我國(guó)的主體能源和重要工業(yè)原料，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年我國(guó)一次能源消費(fèi)中原煤占69.1%[1]。然而，利用方式粗放，能效低、污染重是制約煤炭能源發(fā)展的瓶頸。特別是褐煤，其煤化程度低，揮發(fā)分含量高，直接燃燒熱值低、污染嚴(yán)重，不能作為燃料直接燃燒使用[2-3]。我國(guó)褐煤資源豐富，儲(chǔ)量占到全國(guó)煤炭總儲(chǔ)量的13%，主要集中在內(nèi)蒙古、云南和黑龍江等地區(qū)。因此，利用微生物降解轉(zhuǎn)化褐煤，使其轉(zhuǎn)化為清潔燃料和高值化學(xué)品的意義重大，為褐煤的高值利用提供了新途徑[4-6]；并且微生物轉(zhuǎn)化褐煤具有條件溫和、能耗低、設(shè)備要求簡(jiǎn)單、綠色無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)[7-9]。

利用微生物轉(zhuǎn)化煤炭的研究始于20世紀(jì)80年代，COHEN et al[10]發(fā)現(xiàn)兩株真菌可以將粉碎的褐煤溶解形成黑色液滴。之后學(xué)者們針對(duì)微生物溶解轉(zhuǎn)化褐煤做了大量研究工作，結(jié)果表明一些真菌如青霉菌、曲霉、鐮刀菌，細(xì)菌如假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、枯草芽孢桿菌及放線菌均有不同程度溶解轉(zhuǎn)化低階煤的能力，但溶煤效率低[11-13]。所以要實(shí)現(xiàn)利用微生物溶解轉(zhuǎn)化褐煤制備高值化學(xué)品還需要進(jìn)一步的深入研究，特別是對(duì)高效溶解轉(zhuǎn)化褐煤微生物的篩選和馴化，以及如何控制化學(xué)品的定向轉(zhuǎn)化研究。

在篩選可溶解轉(zhuǎn)化褐煤的微生物過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，存在于特定煤樣中的內(nèi)源微生物與外源微生物相比，其對(duì)煤樣的溶解轉(zhuǎn)化性能及適應(yīng)性會(huì)更好。另外，褐煤是一種煤化程度較低的煤種，含有很多類木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，與精煤相比更容易被微生物降解[7,14-15]。同時(shí)也有研究[16]表明預(yù)處理包括酸處理、堿處理等可以提高微生物對(duì)褐煤的溶解轉(zhuǎn)化率。經(jīng)過(guò)分離純化和溶煤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，筆者從內(nèi)蒙古平莊褐煤中得到一株白色擬青霉HM-M5，其對(duì)酸處理后的褐煤有較好的溶解轉(zhuǎn)化效果，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)特征、溶煤效果及溶解產(chǎn)物進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 煤樣和試劑

褐煤樣品采自內(nèi)蒙古平莊煤礦區(qū)，煤樣的工業(yè)分析結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)試劑二氯甲烷為色譜純，愈創(chuàng)木酚、ABTS(2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)、藜蘆醇、硝酸等均為分析純。

表1 褐煤煤樣的工業(yè)分析Table 1 Proximate analysis of lignite samples

1.2 菌株的分離篩選

取新采集的褐煤，用無(wú)菌水反復(fù)洗滌三次，將表面的微生物清洗干凈，取50 g用研缽將其研磨成粉末，再取10 g煤粉于100 mL三角瓶中，加入50 mL無(wú)菌生理鹽水振蕩提取20 min，然后用稀釋平板法進(jìn)行微生物的分離篩選，培養(yǎng)基為PDA(Potato Dextrose Agar)，整個(gè)過(guò)程注意無(wú)菌操作。通過(guò)對(duì)分離出的微生物菌株進(jìn)行溶煤測(cè)定，最終得到一株溶煤效果較好的霉菌，命名為HM-M5。

1.3 菌株HM-M5的酶學(xué)性質(zhì)分析

以往研究[17-18]表明，白腐真菌引起木頭白色腐朽的主要原因是白腐真菌可以分泌多種胞外過(guò)氧化物酶類，包括木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、漆酶等。本研究從平莊褐煤中分離得到白色擬青霉HM-M5，在PDA培養(yǎng)基上其菌落周圍滴加50%愈創(chuàng)木酚，愈創(chuàng)木酚可被氧化為茶褐色產(chǎn)物。然后分別以ABTS和藜蘆醇為底物測(cè)定了該菌株胞外漆酶和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的活性。同時(shí)分析了在PDA液體培養(yǎng)基中添加秸稈粉及酸處理褐煤對(duì)擬青霉分泌產(chǎn)生漆酶和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性的影響。

1.3.1 漆酶(Lac)活性測(cè)定

漆酶活性測(cè)定是評(píng)定漆酶性質(zhì)以及確定漆酶穩(wěn)定性的常用檢測(cè)方法，測(cè)定酶活性的方法有多種，如愈創(chuàng)木酚法、丁香醛連氮法、鄰聯(lián)甲苯胺法和ABTS法等[19]。其中最準(zhǔn)確合理的方法為ABTS法，漆酶可分解ABTS為ABTS自由基，在波長(zhǎng)為420 nm處ABTS自由基的吸收系數(shù)遠(yuǎn)大于ABTS底物的吸收系數(shù)，且隨著自由基濃度的增大，其吸光度也會(huì)增大。吸光度在一定變化范圍所用的時(shí)間可反映生成ABTS自由基的速率即Lac活性，定義每分鐘氧化1 μmol ABTS所需的酶量為1個(gè)酶活力單位(U)[20-21]。測(cè)定條件：將2 mL 0.5 mmol/L的ABTS底物、1 mL粗酶液加入1 mL 0.1 mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 4.0)，于40 ℃下混勻，在420 nm下測(cè)定吸光度從0.15增加到0.20所用的時(shí)間t。漆酶活性計(jì)算公式為：

ZLac=V×α×ΔA×60×D/Δt

式中：ZLac為L(zhǎng)ac活性，U/L；V為溶液體積，V=1 000 mL；α為ABTS自由基在420 nm處的吸收系數(shù)，為0.184 4；ΔA為吸光度由0.15增加到0.20的差值，ΔA=0.05；D為稀釋倍數(shù)；t為吸光度從0.15增加到0.20所用的時(shí)間，s。

1.3.2 木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(Lip)活性測(cè)定

測(cè)定木質(zhì)素過(guò)氧化物酶常用的底物為藜蘆醇[22]。預(yù)先配制250 mmol/L pH 3.0的酒石酸緩沖溶液、20 mmol/L的H2O2、10 mmol/L的藜蘆醇溶液。在1 mL的反應(yīng)體系中加入0.2 mL藜蘆醇溶液、0.4 mL酒石酸緩沖液、0.4 mL粗酶液、20 μL H2O2，混勻后于30 ℃水浴條件下反應(yīng)5 min，用分光光度計(jì)測(cè)定310 nm波長(zhǎng)下吸光度變化ΔA，定義1 min內(nèi)吸光度變化0.01為一個(gè)酶活力單位。Lip活性計(jì)算公式為：

ZLip=ΔA×D/(0.01×Δt)

式中：ZLip為L(zhǎng)ip活性，U/L；ΔA為5 min～10 min吸光度的變化值；Δt為測(cè)量吸光度的時(shí)間間隔，s；D為稀釋倍數(shù)。

1.4 菌株HM-M5的鑒定

將菌絲接種于PDA平板上，于28 ℃培養(yǎng)3 d～4 d，觀察記錄菌落特征，并用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲和孢子絲，參照《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行分類鑒定。將菌絲接種于30 mL PDA液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)4 d，用10 mL滅過(guò)菌的離心管于1 000 r/min，4 ℃離心10 min，取沉淀菌絲，用無(wú)菌水反應(yīng)洗滌和重復(fù)離心3次，將菌絲利用改進(jìn)CTAB法提取總DNA[23]，采用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGC GG-3′)、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATG C-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為：10×Ex Taq Buffer K 2.0 μL，5U Ex Taq 0.2 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 1.6 μL，27F 1 μL，1492R 1 μL，模板DNA 0.5 μL，ddH2O 13.7 μL。PCR擴(kuò)增條件為DNA變性處理：95 ℃，15 min；擴(kuò)增階段：95 ℃，30 s→56 ℃，30 s→72 ℃，90 s，循環(huán)25次，72 ℃延伸10 min，ITS擴(kuò)增后用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳純化。電壓為120 V，電泳30 min，擴(kuò)增純化后的ITS序列由上海美吉生物公司進(jìn)行測(cè)序，序列信息提交Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得相似序列的物種信息，借助同源比對(duì)的方法輔助判斷物種信息，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行鑒定。

1.5 褐煤的預(yù)處理

先用球磨機(jī)將褐煤粉碎，取粒徑在0.08 mm～0.10 mm的褐煤樣品作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，加入去離子水反復(fù)洗滌去掉小顆粒煤粉，將處理過(guò)的煤樣于80 ℃烘干。用6 mol/L硝酸對(duì)煤樣進(jìn)行酸化處理24 h，期間每隔1 h用玻璃棒攪拌一次，使煤粉與酸液充分反應(yīng)。最后用去離子水對(duì)酸化處理后褐煤進(jìn)行反復(fù)洗滌至pH呈中性(6.5～7.0)，80 ℃下烘干備用。

1.6 菌株HM-M5對(duì)褐煤溶解特性分析

固體培養(yǎng)條件下溶煤實(shí)驗(yàn)：將40 mL PDA培養(yǎng)基置于200 mL組培瓶中，于121 ℃下滅菌20 min，凝固后將分離的擬青霉接種于固體培養(yǎng)基表面，于30 ℃下培養(yǎng)，待菌絲完全覆蓋培養(yǎng)基表面后，取0.5 g酸處理褐煤撒在菌絲表面，然后于30 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)，并記錄生長(zhǎng)和溶煤情況。

液體溶煤實(shí)驗(yàn)：取12個(gè)250 mL三角瓶，分別裝入100 mL PDA液體培養(yǎng)基，自然pH。滅菌冷卻后取6個(gè)三角瓶(剩余6個(gè)用于對(duì)照組，測(cè)定酸處理褐煤自然溶解效果)，將分離的擬青霉接種于三角瓶中，于30 ℃，120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)2 d待培養(yǎng)液中布滿菌絲球，然后各個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中加入5.0 g烘干的酸處理褐煤繼續(xù)培養(yǎng)，測(cè)定20 d內(nèi)溶煤效果，中間不斷取樣將菌絲與褐煤樣分離，測(cè)定褐煤溶解率。

1.7 掃描電子顯微鏡分析

利用Tescan公司GAIA3 SEM雙束場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡進(jìn)行煤樣表觀形貌的分析。取微生物降解前后的烘干煤樣，用無(wú)水乙醇將其清洗和分散，待自然揮發(fā)晾干后，用導(dǎo)電膠固定，經(jīng)過(guò)表面噴金后進(jìn)行掃描電子顯微鏡分析，觀察擬青霉降解后褐煤表觀結(jié)構(gòu)的變化[24]。

1.8 褐煤降解產(chǎn)物分析

將擬青霉降解后的褐煤培養(yǎng)液用二氯甲烷進(jìn)行液-液萃取，對(duì)有機(jī)相進(jìn)行濃縮后加入一定量無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行脫水處理2 h，再用0.45 μm有機(jī)系濾膜進(jìn)行過(guò)濾，然后利用Agilent公司GC-MS(7890B-7000C)分析降解產(chǎn)物[25]。將得到的產(chǎn)物質(zhì)譜總離子流圖在NIST14質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行對(duì)比和匹配，確定不同降解產(chǎn)物的種類和名稱。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株HM-M5酶學(xué)性質(zhì)特征

漆酶(Lac)和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(Lip)是促進(jìn)微生物溶解轉(zhuǎn)化褐煤的關(guān)鍵胞外酶，其表達(dá)量和酶活性對(duì)褐煤的溶解轉(zhuǎn)化具有重要作用。在固體平板其菌落周圍滴加50%愈創(chuàng)木酚，30 min后HM-MS可將愈創(chuàng)木酚氧化為茶褐色物質(zhì)(見(jiàn)圖1b)，表明分離的擬青霉有較強(qiáng)的分泌胞外過(guò)氧化物酶的能力。

將擬青霉液體培養(yǎng)物分成3組，分別在500 mL三角瓶中裝入300 mL PDA液體培養(yǎng)基，其中在第一組PDA培養(yǎng)基中不添加其他物質(zhì)(對(duì)照組)，在第二組PDA培養(yǎng)基中加入0.5 g秸稈粉，在第三組PDA培養(yǎng)基中加入0.5 g酸處理褐煤煤粉，然后滅菌，冷卻后接入1 mL液體培養(yǎng)的擬青霉菌液，置于30 ℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)，不同時(shí)間取樣測(cè)定胞外酶活性。擬青霉在不同培養(yǎng)條件下Lac和Lip活性變化如圖2所示。由圖2可以看出，擬青霉具有較強(qiáng)的Lac和Lip活性。由圖2a可知，在第一組實(shí)驗(yàn)中不添加秸稈粉和酸處理褐煤，培養(yǎng)到第8天時(shí)Lac活性最高，可達(dá)到1 170 U/L，然后隨著培養(yǎng)時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，酶活性開(kāi)始降低；添加秸稈粉和酸處理褐煤均可以促進(jìn)擬青霉分泌產(chǎn)生Lac，且加入秸稈粉和酸處理褐煤后擬青霉產(chǎn)生Lac相對(duì)滯后，培養(yǎng)第8天時(shí)加入秸稈粉的實(shí)驗(yàn)組中Lac活性為733 U/L，加入酸處理褐煤的實(shí)驗(yàn)組中Lac活性為352 U/L。然后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，加入秸稈粉和酸處理褐煤的實(shí)驗(yàn)組中Lac活性繼續(xù)增加，加入秸稈粉的實(shí)驗(yàn)組在第12天時(shí)Lac活性達(dá)到最高，為2 640 U/L，繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，Lac活性開(kāi)始緩慢下降；加入酸處理褐煤的實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)第11天Lac活性最高，可達(dá)到1 920 U/L，繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，Lac活性開(kāi)始迅速下降，第14天時(shí)下降到470 U/L，與第11天相比酶活性降低了75.5%。

圖1 HM-M5對(duì)愈創(chuàng)木酚氧化結(jié)果Fig.1 Oxidation result of guaiacol by HM-M5a—Control；b—Experimental

由圖2b可知，加入秸稈粉和酸處理褐煤同樣可以誘導(dǎo)擬青霉產(chǎn)生更多的Lip，不添加秸稈粉和酸處理褐煤時(shí)，培養(yǎng)第9天生成的Lip活性最高，為6 300 U/L，繼續(xù)培養(yǎng)到14天時(shí)Lip活性變化較小；加入秸稈粉和酸處理褐煤的實(shí)驗(yàn)組Lip活性最高值均大于對(duì)照組Lip活性最高值，加入秸稈粉的實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)第10天時(shí)Lip活性達(dá)到最高，為25 700 U/L，繼續(xù)培養(yǎng)Lip活性開(kāi)始下降；加入酸處理褐煤的實(shí)驗(yàn)組Lip活性在第11天達(dá)到最大值，為16 100 U/L，在培養(yǎng)12 d之后培養(yǎng)液中Lip活性迅速降低，第14天時(shí)降低到7 570 U/L，與第11天相比酶活性降低了53.0%。

分析擬青霉胞外過(guò)氧化物酶活性測(cè)定結(jié)果認(rèn)為，擬青霉分泌胞外過(guò)氧化物酶類與生長(zhǎng)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量和形態(tài)有直接關(guān)系，在一開(kāi)始PDA培養(yǎng)基中含有大量的糖類如淀粉、葡萄糖，可作為擬青霉直接利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可被細(xì)胞分泌的淀粉酶快速分解，為菌體生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這個(gè)過(guò)程菌體分泌產(chǎn)生的過(guò)氧化物酶包括Lac和Lip較少。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)直接營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，擬青霉被誘導(dǎo)合成大量的胞外過(guò)氧化物酶(Lac/Lip)用于分解環(huán)境中較難利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如木質(zhì)纖維素、腐植酸等，將其分解為細(xì)胞可直接利用的碳源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，供菌體正常生長(zhǎng)。

培養(yǎng)12 d以后，Lac和Lip活性降低，這是由Lac和Lip對(duì)木質(zhì)素結(jié)構(gòu)降解生成的一些酚類或芳香類有毒物質(zhì)的積累對(duì)酶活性和擬青霉細(xì)胞有一定抑制作用導(dǎo)致的，或者培養(yǎng)環(huán)境中可利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡導(dǎo)致擬青霉細(xì)胞代謝能力下降。

圖2 不同培養(yǎng)條件下HM-M5胞外過(guò)氧化物酶分泌情況Fig.2 Results of extracellular peroxidase activity of HN-M5 in different conditionsa—Lac activity；b—Lip activity□—PDA；○—PDA+straw；△—PDA+acid treated lignite

2.2 菌株HM-M5的描述與鑒定

在PDA平板上培養(yǎng)3 d，菌落為直徑2 cm～3 cm的近似圓形，呈白色絨毛狀，中間凸起邊緣整齊，菌絲致密不易挑取，該菌分生孢子梗側(cè)生無(wú)隔膜，菌絲透明成分枝狀，表面光滑，分枝菌絲明顯變細(xì)，在分枝菌絲頭部形成球形子囊孢子，孢子囊和孢子均呈透明狀，孢子為長(zhǎng)橢圓形或者近似菱形(如圖3所示)。在三角瓶中液體培養(yǎng)時(shí)可形成直徑3 mm～5 mm白色絨狀菌絲球，對(duì)固體顆粒有較強(qiáng)吸附性。將經(jīng)過(guò)上海美吉生物公司測(cè)序獲得的ITS序列提交Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)，得到的登錄號(hào)為AB604005.1，將該序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知真菌序列進(jìn)行BLAST對(duì)比檢索，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(見(jiàn)圖4)。由圖4可知，菌株HM-M5與Simplicilliumlanosoniveum親源性最近，基因系列同源度高達(dá)95%，因此結(jié)合形態(tài)學(xué)分析和基因鑒定結(jié)果最終將分離的菌株HM-M5鑒定為白色擬青霉(Simplicilliumlanosoniveum)。

圖3 菌株HM-M5顯微鏡鏡檢結(jié)果Fig.3 Results of microscopic examination of the strain HM-M5a—Mycelial morphology；b—Spore morphology

圖4 菌株HM-M5基于rDNA ITS-1/ITS-4序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on analysis of rDNA ITS-1/ITS-4 sequences of strain HM-M5

2.3 菌株HM-M5對(duì)褐煤的溶解效果

擬青霉在固體平板培養(yǎng)基內(nèi)部溶解褐煤效果如圖5所示。先將擬青霉接種于PDA固體瓊脂表面，于30 ℃下培養(yǎng)3 d～4 d，待菌絲覆蓋培養(yǎng)基表面后，稱取0.5 g酸處理褐煤撒在菌絲表面，然后繼續(xù)培養(yǎng)1 d～2 d，觀察發(fā)現(xiàn)菌絲可以在酸處理褐煤煤粉表面生長(zhǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)10 d～15 d后在菌絲表面以及固體瓊脂內(nèi)部均有棕褐色褐煤溶解液滲出，表明褐煤顆粒在擬青霉作用下發(fā)生了溶解。

在液體培養(yǎng)條件下，擬青霉對(duì)褐煤的溶解效果見(jiàn)表2。由表2可以看出，在未接擬青霉的無(wú)菌培養(yǎng)基內(nèi)加入5 g酸處理褐煤，30 ℃振蕩提取20 d褐煤的自溶效果較差，僅為4.4%；在含有擬青霉菌絲的液體培養(yǎng)基中加入5 g酸處理褐煤，擬青霉對(duì)褐煤的溶解從第8天開(kāi)始比較顯著，連續(xù)培養(yǎng)20 d，最終對(duì)褐煤的溶解率可達(dá)到66.2%，溶煤效果顯著。結(jié)合2.1節(jié)中Lac和Lip活性變化特征分析，表明胞外過(guò)氧化物酶類的分泌可以促進(jìn)酸處理褐煤的溶解。

圖5 固體平板內(nèi)HM-M5對(duì)褐煤溶解效果Fig.5 Dissolving effect of lignite on solid medium by HM-M5a—Day 1；b—Day 3；c—Day 15

2.4 掃描電子顯微鏡分析

采用掃描電子顯微鏡分別對(duì)原褐煤、酸處理褐煤及擬青霉溶解后的褐煤進(jìn)行表觀分析，結(jié)果如圖6所示。由圖6a和圖6d可以看出，未經(jīng)預(yù)處理的褐煤表面平整光滑，裂紋和孔隙較少。

表2 菌株HM-M5對(duì)褐煤的溶解Table 2 Dissolution of lignite by HM-M5

由圖6b和圖6e可以看出，經(jīng)6 mol/L硝酸處理的褐煤表面裂紋增多，粗糙度增加，在褐煤表面和內(nèi)部的孔隙增多，而且經(jīng)過(guò)硝酸氧化處理后褐煤的含氧基團(tuán)增多也一定程度增加了褐煤的親水性，牛晨凱等[24]研究也表明煤樣含氧極性基團(tuán)多少是反映煤炭親水性的重要指標(biāo)。因此，硝酸處理利于微生物及過(guò)氧化物酶進(jìn)入褐煤內(nèi)部對(duì)其進(jìn)行溶解轉(zhuǎn)化。由圖6c和圖6f可以看出，與未經(jīng)過(guò)擬青霉處理的褐煤相比，擬青霉溶解轉(zhuǎn)化后的褐煤表面變得褶皺不平，在表面及孔隙內(nèi)部附著有大量的微生物細(xì)胞，孔隙增多說(shuō)明微生物進(jìn)入褐煤內(nèi)部，在微生物分泌胞外酶作用下進(jìn)一步促進(jìn)了褐煤的溶解?？梢?jiàn)擬青霉可以很好地附著于酸處理褐煤表面生長(zhǎng)，利用其分泌的胞外酶將酸處理褐煤溶解轉(zhuǎn)化，部分溶解產(chǎn)物作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供擬青霉生長(zhǎng)，一些較難利用的溶解產(chǎn)物如芳香環(huán)類物質(zhì)繼續(xù)留在培養(yǎng)液中，為利用微生物溶解轉(zhuǎn)化褐煤，從溶解液中提取有用化學(xué)品提供了可能。

圖6 煤樣的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.6 SEM photos of lignite samplesa,d—Raw lignite；b,e—Acid treated lignite；c,f—Lignite degradated by HM-M5；a,b,c—Magnified 2.5 thousand times；d,e,f—Magnified 20 thousand times

2.5 褐煤溶解液組成分析

以二氯甲烷為萃取劑，分別對(duì)褐煤自然溶解樣品和擬青霉菌溶解褐煤產(chǎn)物進(jìn)行萃取，并將有機(jī)相提取物利用GC-MS進(jìn)行分析，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，褐煤自然溶解液經(jīng)過(guò)萃取，檢測(cè)到一種溶解產(chǎn)物1-甲基-7-(1-甲基乙基)菲，且其含量遠(yuǎn)低于其在菌株HM-M5溶解轉(zhuǎn)化褐煤樣品中的含量。HM-M5溶解轉(zhuǎn)化褐煤樣品，經(jīng)過(guò)液-液萃取共得到4種主要產(chǎn)物，將其與NIST14質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，分別為：1,6-二甲基-4-(1-甲基乙基)萘、鄰苯二甲酸辛二酯、7-異丙基-1,1,4a-三甲基-1,2,3,4,4a, 9,10,10a-八氫菲、1-甲基-7-(1-甲基乙基)菲。4種產(chǎn)物的相對(duì)含量占總萃取物含量的91.4%(以峰面積計(jì)算相對(duì)含量)，其中1-甲基-7-(1-甲基乙基)菲相對(duì)含量最高，為41.1%。菲是一種重要的化工原料中間體，可用于制造農(nóng)藥、燃料和炸藥穩(wěn)定劑，鄰苯二甲酸辛二酯是一種重要的高分子材料增塑劑，萘類化合物是合成鄰苯二甲酸酐的重要中間體。此外，在溶解液中未檢測(cè)到單鏈有機(jī)化合物，說(shuō)明擬青霉可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)范圍較廣，一些單鏈烴類、醇類、有機(jī)酸等均可作為擬青霉菌的碳源被利用，而單環(huán)和多環(huán)芳烴類如鄰苯二甲酸酯類、萘類、菲類等不能被擬青霉利用，殘留在溶解液中。從提取物分析結(jié)果看，利用擬青霉溶解轉(zhuǎn)化褐煤制備有用化學(xué)品是一種可行的高值利用褐煤的途徑。

圖7 褐煤溶解液GC-MS分析結(jié)果Fig.7 Analysis results of lignite solution by GC-MS

表3 褐煤溶解轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與NIST14數(shù)據(jù)庫(kù)匹配結(jié)果Table 3 Matching results for lignite dissolved products with NIST14 database

3 結(jié) 論

1) 在秸稈粉和酸處理褐煤誘導(dǎo)條件下，擬青霉具有較強(qiáng)的分泌胞外過(guò)氧化物酶的能力，特別是在環(huán)境營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)貧乏的環(huán)境中，會(huì)促進(jìn)擬青霉分泌胞外過(guò)氧化物酶類包括漆酶和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶等，對(duì)環(huán)境中存在的難利用有機(jī)碳如木質(zhì)素、褐煤等進(jìn)行降解，轉(zhuǎn)化為可被微生物利用的碳源為其生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此，擬青霉對(duì)酸處理褐煤的溶解轉(zhuǎn)化與其分泌的漆酶和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶有直接關(guān)系。

2) 擬青霉對(duì)酸處理褐煤有較強(qiáng)的溶解轉(zhuǎn)化能力，經(jīng)過(guò)酸處理的褐煤其表面出現(xiàn)較多的裂紋和孔隙，為擬青霉菌絲的附著生長(zhǎng)和過(guò)氧化物酶的接觸氧化降解提供了有利條件，在液體培養(yǎng)條件下處理20 d菌株對(duì)酸處理褐煤溶解轉(zhuǎn)化率可達(dá)到66.2%。通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察，經(jīng)過(guò)擬青霉溶劑轉(zhuǎn)化后，殘留煤渣變得褶皺、多孔且空隙內(nèi)有大量微生物細(xì)胞附著生長(zhǎng)，表明擬青霉可以侵入褐煤內(nèi)部通過(guò)分泌胞外酶將褐煤溶解轉(zhuǎn)化。

3) 與褐煤的化學(xué)或者熱溶解不同，微生物溶解褐煤后會(huì)將部分褐煤溶解物包括單鏈小分子有機(jī)物如烴類、有機(jī)酸類、酮類、含氮含硫小分子有機(jī)物等作為碳源和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供自身生長(zhǎng)，而最終經(jīng)過(guò)溶解轉(zhuǎn)化形成的一些難以被微生物利用的多環(huán)芳烴物質(zhì)如鄰苯二甲酸酯類、萘、菲等會(huì)殘留在溶解液中，這些物質(zhì)都是重要的化工原料，可用來(lái)制備增塑劑、農(nóng)藥、染料等。

4) 擬青霉HM-M5屬于半知菌亞門(mén)，對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)要求較低，且有較強(qiáng)的分泌產(chǎn)生胞外過(guò)氧化物酶能力，是一種理想的溶解轉(zhuǎn)化褐煤的微生物，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用微生物溶解轉(zhuǎn)化褐煤存在巨大潛力。

5) 該褐煤內(nèi)源真菌菌株HM-M5具有對(duì)褐煤環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、溶解轉(zhuǎn)化褐煤效率高、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物種類少易于分離純化和工業(yè)化的優(yōu)點(diǎn)，是理想的溶解轉(zhuǎn)化褐煤制備高值化學(xué)品的工業(yè)微生物。要實(shí)現(xiàn)利用該菌株制備高值化學(xué)品的工業(yè)化，還需進(jìn)一步優(yōu)化微生物溶解褐煤條件和研究產(chǎn)物的分離純化方法。