啤酒酵母釀造葡萄酒及香氣成分GC-MS分析研究

劉永衡，陳 彬，王學(xué)英

（寧夏工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院能源化工學(xué)院，寧夏銀川 750021）

香氣是葡萄酒品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，其產(chǎn)生主要來自于釀酒葡萄品種、酵母以及工藝等因素的綜合作用下，世界著名產(chǎn)地的葡萄酒都有著自己獨(dú)特的香氣特征。酵母作為賦予葡萄酒香氣特征的主要因素之一，不同酵母發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物很大程度影響著葡萄酒感官特征以及消費(fèi)者喜好[1]。酵母菌的主要作用是催化糖類轉(zhuǎn)化為酒精，但除了酒精之外，酵母菌對(duì)最終的產(chǎn)品品質(zhì)也有著貢獻(xiàn)，例如香氣成分[2]。大量研究表明，酵母及其他微生物在葡萄酒香氣產(chǎn)生中的作用毋庸置疑[3-5]。酵母菌主要以兩種方式影響葡萄酒的香氣成分：一種是從頭產(chǎn)生香氣成分，另一種是通過修飾來自于葡萄的某些前體化合物產(chǎn)生[6]。選擇合適的釀酒酵母對(duì)于葡萄酒發(fā)酵非常重要，合適的酵母可以為葡萄酒帶來更加優(yōu)異的風(fēng)味表現(xiàn)。

啤酒酵母除用于釀造啤酒、酒精及其他的飲料酒外，還可發(fā)酵面包[7]。啤酒酵母按照發(fā)酵狀態(tài)可分為上層酵母（又稱為艾爾酵母）和下層酵母（又稱為拉格酵母）。目前國內(nèi)外尚無有關(guān)于啤酒酵母釀造葡萄酒的報(bào)道，利用啤酒酵母釀造果酒的報(bào)道僅見于張寶善等[8]利用啤酒酵母釀造石榴果酒的工藝研究。本研究中采用的弗曼迪斯清香高沉淀型拉格啤酒酵母S-189，其屬于下層酵母，具有發(fā)酵活力高、耐低溫的特點(diǎn)。利用啤酒酵母S-189單發(fā)酵、葡萄酒酵母單發(fā)酵以及S-189、葡萄酒酵母混菌發(fā)酵葡萄酒，采用頂空固相微萃?。╤ead space-solid phase microextraction，HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析其香氣成分差異，旨在為啤酒酵母、混菌釀造葡萄酒提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

黑比諾葡萄、梅鹿輒葡萄：寧夏西夏王葡萄酒業(yè)（集團(tuán)）有限公司；S-189啤酒酵母：寧夏工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院能源化工學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存；葡萄酒酵母F1：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 試劑

乙酸乙酯（色譜純）：美國Fisher公司；2-辛醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99.5%）：美國Sigma公司；無水硫酸鈉（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；焦亞硫酸氫鉀（分析純）：上海羅恩試劑公司；EX-V果膠酶：法國拉曼公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫科技有限公司；頂空固相微萃取纖維頭DVB/CA/PDMS（2 cm，50/30 μm）：美國Supelco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄酒釀造工藝流程

操作要點(diǎn)：采用黑比諾葡萄、梅鹿輒葡萄（1∶1比例）為釀酒原料，除梗破碎后加入焦亞硫酸氫鉀60 mg/L，果膠酶20 mg/L，浸漬24 h后加入活化酵母（S-189啤酒酵母用5%蔗糖水在25 ℃活化2 h，F(xiàn)1葡萄酒酵母用5%蔗糖水在37 ℃活化30 min），發(fā)酵方式為啤酒酵母S-189單獨(dú)發(fā)酵（SY）（發(fā)酵溫度為10 ℃）、葡萄酒酵母F1單獨(dú)發(fā)酵（AY）（發(fā)酵溫度為20 ℃）和混菌發(fā)酵（MY）（酵母S-189和F1 1∶1比例添加[9]，發(fā)酵溫度為10 ℃），酵母添加后每隔6 h測(cè)一次溫度及比重，待比重降到0.992～0.996時(shí)并維持不變后即為主發(fā)酵結(jié)束，隨后進(jìn)行皮渣分離，原酒分離后采用自然發(fā)酵的方式進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵，結(jié)束后添加焦亞硫酸氫鉀60 mg/L，倒罐降溫冷藏澄清，過濾機(jī)過濾，得到葡萄酒貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 GC-MS分析條件

（1）葡萄酒樣前處理

采用頂空固相微萃?。℉S-SPME）方法進(jìn)行前處理，取葡萄酒樣5 mL于15 mL頂空瓶中，加入1 g氯化鈉、5 μL內(nèi)標(biāo)物2-辛醇（稀釋比例1∶200）和磁力轉(zhuǎn)子后迅速擰緊瓶蓋，將萃取頭插入樣品頂空瓶，置于磁力攪拌器于60 ℃吸附30 min。吸附后將萃取頭取出插入氣相色譜進(jìn)樣口，于200 ℃解吸5 min，進(jìn)樣量1 μL[10]。

（2）葡萄酒樣GC-MS檢測(cè)條件

氣相色譜條件：色譜柱為HP-INNO-Wax毛細(xì)管柱（30.0m×0.25 mm×0.25 μm），載氣氦氣（He）（純度99.99%），流速1.10 mL/min；進(jìn)樣口溫度200 ℃；升溫程序：35 ℃保持3 min，以4 ℃/min的升溫速度升至120 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的升溫速度升至230 ℃。

質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，傳輸線溫度250 ℃，電子能量70 eV，光電倍增管電壓350 V，質(zhì)量掃描范圍30～350 amu。

定性方法：由GC-MS分析得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算機(jī)在美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）17標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索及WILEY質(zhì)譜圖庫比對(duì)，譜庫比對(duì)時(shí)要求匹配度＞700，定性鑒定出大部分峰。

定量方法：葡萄酒樣采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析，內(nèi)標(biāo)為2-辛醇；待測(cè)香氣成分定量分析計(jì)算公式為：香氣組分的含量（μg/L）=[（各組分的峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積）×內(nèi)標(biāo)質(zhì)量（μg）]/樣品體積（L）。

1.3.3 香氣活力值分析

氣味活力值（odor activity value，OAV）是評(píng)價(jià)香氣成分對(duì)飲料、酒以及其他食品物質(zhì)香氣的貢獻(xiàn)指標(biāo)，樣品中OAV＞1的香氣成分是樣品香氣特征的主要來源。OAV=香氣物質(zhì)濃度/香氣物質(zhì)閾值，根據(jù)文獻(xiàn)[11-13]查找每個(gè)香氣物質(zhì)在葡萄酒中的閾值，計(jì)算各個(gè)香氣成分的OAV，并統(tǒng)計(jì)OAV＞1的香氣物質(zhì)，表征各個(gè)香氣物質(zhì)對(duì)葡萄酒樣品香氣貢獻(xiàn)的大小。

1.3.4 分析檢測(cè)

（1）感官指標(biāo)

參照GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[14]以及李華《葡萄酒品嘗學(xué)》[12]，由8名專業(yè)人員從外觀（10分）、香氣強(qiáng)弱（30分）及滋味（40分）、典型性（20分）四個(gè)方面綜合評(píng)價(jià)，滿分100分，每個(gè)樣品隨機(jī)編號(hào)盲品3次求平均值。

（2）理化指標(biāo)

酒精度、總酸度、還原糖、總SO2含量檢測(cè)參照國標(biāo)GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，其中酒精度采用酒精計(jì)法；總酸度采用酸堿滴定指示劑法，結(jié)果以酒石酸計(jì)；還原糖采用直接滴定法，結(jié)果以葡萄糖計(jì)；總SO2采用直接碘量法，結(jié)果以游離SO2（mg/L）計(jì)；單寧參照李華[15]《葡萄酒分析檢驗(yàn)》中的福林-丹尼斯法。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄酒感官指標(biāo)分析

如圖1所示，AY葡萄酒在外觀評(píng)定上的得分最高，其次為MY葡萄酒，SY葡萄酒最低；香氣、滋味、典型性等項(xiàng)目得分順序均表現(xiàn)為MY葡萄酒＞SY葡萄酒＞AY葡萄酒；最終綜合評(píng)定表示MY葡萄酒風(fēng)味最佳，SY葡萄酒風(fēng)味其次，以啤酒酵母或混菌釀造葡萄酒風(fēng)味較為獨(dú)特。

圖1 SY、AY、MY發(fā)酵方式釀造葡萄酒感官評(píng)價(jià)Fig.1 Sensory evaluation of wines produced by SY,AY and MY fermentation mode

2.2 葡萄酒基本理化指標(biāo)分析

釀造葡萄酒儲(chǔ)存40 d后，取3種葡萄酒進(jìn)行理化指標(biāo)檢測(cè)，結(jié)果見表1。由表1可知，SY、AY、MY葡萄酒的理化指標(biāo)均滿足國標(biāo)GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》要求，并且MY葡萄酒的理化指標(biāo)優(yōu)于SY、AY葡萄酒。

表1 SY、AY、MY發(fā)酵方式釀造葡萄酒酒樣基本理化指標(biāo)Table 1 Basic physical and chemical indexes of wines produced by SY,AY and MY fermentation mode

2.3 葡萄酒樣GC-MS檢測(cè)結(jié)果分析

葡萄酒樣SY、AY及MY中香氣成分的GC-MS總離子流譜圖見圖1，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索比對(duì)，葡萄酒樣SY、AY及MY中各組分鑒定分析結(jié)果分別見表2。

圖2 SY（A）、AY（B）及MY（C）發(fā)酵方式釀造葡萄酒樣香氣成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of aroma components in wines produced by SY (A),AY (B) and MY (C) fermentation mode analysis by GC-MS

表2 3種葡萄酒樣香氣成分GC-MS分析結(jié)果Table 2 Aroma components in 3 kinds of wines analysis by GC-MS

續(xù)表

由圖2、表2可知，3種葡萄酒樣品共檢出34種揮發(fā)性香氣成分，SY葡萄酒樣GC-MS分析檢測(cè)總共鑒定出15個(gè)化合物，其中醇類化合物總計(jì)6種，含量最高的為3-甲基-1-丁醇（4 906.83 μg/L）；酯類化合物總計(jì)9種，含量最高的為山梨酸甲酯（1 419.38 μg/L）；AY葡萄酒樣GC-MS分析檢測(cè)總共鑒定出20個(gè)化合物，其中醇類化合物總計(jì)6種，含量最高的為3-甲基-1-丁醇（6 030.48 μg/L）；酯類化合物總計(jì)5種，含量最高的為乙酸苯乙酯（833.28 μg/L）；有機(jī)酸類總計(jì)4種，含量最高的為辛酸（2 607.05 μg/L）；此外還鑒定出2-庚酮、苯甲醛、β-紫羅蘭酮、丁子香酚、胡椒醛等其他5種化合物；MY葡萄酒樣GC-MS分析檢測(cè)中總共鑒定出22個(gè)化合物，其中醇類化合物總計(jì)5種，含量最高的為3-甲基-1-丁醇（18 590.83 μg/L）；酯類化合物總計(jì)12種，含量最高的為2,4-己二烯酸乙酯（1 711.98 μg/L）；有機(jī)酸類總計(jì)4種，含量最高的為辛酸（1 439.61 μg/L）；此外也鑒定出化合物胡椒醛。SY和MY兩種葡萄酒中醇類化合物含量所占比例均最高，其次為酯類化合物；AY中醇類化合物含量所占比例最高，其次為有機(jī)酸類化合物，最后為酯類化合物。

2.2 葡萄酒樣OAV分析

由表3可知，三個(gè)樣品中總計(jì)有6種特征香氣組分（OAV＞1），其中包括5種酯類化合物和1種有機(jī)酸化合物；SY、AY、MY樣品中OAV＞1的香氣化合物分別有3、3、4種，SY樣品特征香氣組分全部為酯類，其中OAV最大的香氣組分為辛酸乙酯；AY、MY樣品特征香氣組分除了酯類還有有機(jī)酸，其中OAV最大的香氣組分都為己酸乙酯。

表3 三種葡萄酒樣OAV值大于1的香氣物質(zhì)Table 3 Volatile compounds (OAV＞1) in 3 kinds of wines

3 討論

本研究表明采用兩種酵母混菌發(fā)酵相對(duì)于酵母單發(fā)酵葡萄酒香氣物質(zhì)種類有所增加，三個(gè)葡萄酒樣品含量最高的化合物均為異戊醇；這與他人的研究成果一致，例如趙現(xiàn)華等[16]研究了共發(fā)酵對(duì)蛇龍珠葡萄酒香氣成分的影響，最終共檢出39種揮發(fā)性成分，其中異戊醇含量最高；且兩種酵母共發(fā)酵相比較于單酵母發(fā)酵香氣成分、含量都有所增加。胡雪蓮等[17]研究了四株啤酒酵母的釀造特性以及其釀造的啤酒中的風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)在四種啤酒中醇類風(fēng)味物質(zhì)含量最高的都是異戊醇。然而，從香氣成分種類數(shù)量來看，相對(duì)于已報(bào)道的其他葡萄酒香氣成分，三個(gè)樣品香氣成分種類明顯較少。例如姚瑤等[18]從4個(gè)產(chǎn)區(qū)的赤霞珠干紅葡萄酒鑒定出91種香氣成分，4個(gè)樣品分別鑒定出29種、30種、49種、50種香氣成分。余歡等[19]利用不同的7株酵母釀造葡萄酒，GC-MS共檢測(cè)到68種香氣成分，其中每個(gè)樣品檢測(cè)到50種左右香氣成分；馮濤等[20]葡萄園土壤中分離到4株釀酒酵母并分別用于發(fā)酵葡萄酒，從釀造的4種葡萄酒共檢測(cè)到45種香氣成分，其中每個(gè)樣品檢測(cè)到35種左右香氣成分；三個(gè)樣品中檢測(cè)出的香氣成分較少的原因極大程度上可能與發(fā)酵溫度較低有關(guān)，SY、MY樣品發(fā)酵溫度為10 ℃，而AY樣品為20 ℃，發(fā)酵溫度均低于上述文獻(xiàn)中的葡萄酒。另外，SY樣品未檢測(cè)到揮發(fā)酸，揮發(fā)酸是葡萄酒香氣成分中經(jīng)常能夠檢測(cè)到的成分，例如乙酸、己酸等，對(duì)于葡萄酒香氣風(fēng)味有一定的影響[21]，推測(cè)SY樣品未檢測(cè)到揮發(fā)酸可能是采用啤酒酵母、酸類成分含量太低等原因。有些酵母菌（特別是德爾布魯克氏酵母，一種啤酒酵母）在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸類會(huì)明顯減少[22]，這也可能是SY樣品風(fēng)味相對(duì)于AY、MY樣品較為獨(dú)特的原因，OAV分析也顯示，AY、MY樣品香氣特征除了酯類的香氣貢獻(xiàn)外還有有機(jī)酸類的貢獻(xiàn)；近年來，人們對(duì)混菌發(fā)酵越來越關(guān)注，大量的研究表明，混菌發(fā)酵可以產(chǎn)生更多的香氣，尤其是構(gòu)成酒體香氣主要成分的酯類[23-26]；混菌發(fā)酵可以是兩種釀酒酵母，也可以是一種非釀酒酵母和一種釀酒酵母混合發(fā)酵，這種共培養(yǎng)可以引起香氣特征的改變，以及相對(duì)較低的乙醇含量[27-28]。本實(shí)驗(yàn)的研究成果與上述研究較一致，相對(duì)于SY、AY樣品，MY混菌發(fā)酵樣品中的酯類香氣成分從種類到含量都有所增加，OAV進(jìn)一步分析也明顯可以看出，MY樣品OAV＞1相對(duì)較多且數(shù)值較大，尤其是酯類成分，也進(jìn)一步說明酯類成分是葡萄酒香氣特征的主要貢獻(xiàn)來源。

4 結(jié)論

綜上所述，為探究啤酒酵母釀造葡萄酒的可行性，本研究從感官、理化、香氣成分以及OAV分析等方面對(duì)啤酒酵母釀造葡萄酒的整體質(zhì)量進(jìn)行了分析。試驗(yàn)結(jié)果表明：啤酒酵母釀造的葡萄酒SY、MY樣品基本理化指標(biāo)符合相關(guān)國標(biāo)，表明啤酒酵母S-189可以用于釀造風(fēng)味獨(dú)特葡萄酒，SY、MY葡萄酒感官綜合評(píng)定均優(yōu)于AY葡萄酒，且混菌發(fā)酵有助于提升葡萄酒風(fēng)味，但其變化規(guī)律仍需進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)為啤酒酵母S-189混菌發(fā)酵釀造葡萄酒的研究提供了一定的科學(xué)依據(jù)。