響應(yīng)面法優(yōu)化白首烏發(fā)酵乳制備工藝

吳雋松，滕飛翔，楊留才

（江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，江蘇鹽城 224005）

發(fā)酵乳是以乳或乳制品為主要原料，通過接種乳酸菌發(fā)酵而成[1]，含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類、維生素和礦物質(zhì)外，還可通過微生物作用將原料中不易吸收的大分子成分轉(zhuǎn)化為易于吸收的小分子物質(zhì)，同時(shí)產(chǎn)生大量的乳酸、其他有機(jī)酸、B族維生素、氨基酸、酶類等[2-5]，研究證實(shí)，發(fā)酵乳有改善腸道菌群、預(yù)防腸道疾病、預(yù)防心血管疾病、抗衰老以及抗腫瘤等功效[6-8]。隨著生活水平的提高，人們對(duì)發(fā)酵乳的口味、香氣、質(zhì)地、營(yíng)養(yǎng)和功能的要求越來越多元化[9]，如草莓發(fā)酵乳、燕麥芒果發(fā)酵乳、藏靈菇發(fā)酵乳、黑豆番茄發(fā)酵乳、含醇發(fā)酵乳等[10-13]，深受人們喜愛。

白首烏（Cynanchum bungei）作為中國傳統(tǒng)中藥，味甘、苦，性微溫，具有補(bǔ)肝腎、益精血、強(qiáng)筋骨、烏須發(fā)、延年益壽等作用[14-16]。研究表明，白首烏含有粗多糖、粗蛋白、粗脂肪、維生素、氨基酸以及鈣、鐵、鋅、鎂等人體必需的礦物質(zhì)元素，其含有的多羥基孕甾烷苷酯類化合物和苯乙酮類化合物，已被證實(shí)具有抗腫瘤、抗衰老、抗炎、抗氧化和降血脂等功效[17-20]。目前，由白首烏加工得到的食品多為初加工，如制成白首烏粉、白首烏片、白首烏脯等形式，但存在即食性差、營(yíng)養(yǎng)損失嚴(yán)重，造成資源的浪費(fèi)和環(huán)境污染等問題[21]。利用微生物發(fā)酵作用制備白首烏酵素成為研究熱點(diǎn)，李凡等[22]以純白首烏清汁為發(fā)酵基質(zhì)，乳酸菌和酵母菌復(fù)合發(fā)酵制成一種含有大量活菌的白首烏酵素。但是市面上關(guān)于白首烏發(fā)酵乳制備及其抗氧化性研究較少。因此，本研究以江蘇鹽城市濱海白首烏粉和奶粉為原料，保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌為發(fā)酵劑，利用雙響應(yīng)值優(yōu)化白首烏發(fā)酵乳飲料制備工藝，得到一款風(fēng)味獨(dú)特、抗氧化性能較高的白首烏發(fā)酵乳，從而為白首烏資源開發(fā)和白首烏產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

白首烏、牛乳、蔗糖（食品級(jí)）：市售；德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbruechiisubsp.bulgaricus），CGMCC 1.2161、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus），CGMCC 1.1855：中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 試劑

MRS培養(yǎng)基：杭州百思生物技術(shù)有限公司；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒[2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）法]：北京盒子生工科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

S1-M81磨粉機(jī)：九陽股份有限公司；YP2001B電子天平：上海力辰儀器科技有限公司；PYX02電熱恒溫培養(yǎng)箱：FD-2D-80真空冷凍干燥機(jī)：上海繼譜電子科技有限公司；佰輝電子有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)：上海篤特科學(xué)儀器有限公司；UV752紫外分光光度計(jì)：山東博科科學(xué)儀器有限公司；PHS-25酸度計(jì)：上海越平科學(xué)儀器有限公司；DYCZ-24N垂直電泳儀：北京六一生物科技有限公司；Trans-Blot SD轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)：上海賽百奧科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 白首烏發(fā)酵乳制備工藝及操作要點(diǎn)

白首烏預(yù)處理→破碎過篩→加入奶粉及蔗糖→均質(zhì)→滅菌→接種→發(fā)酵→后熟→無菌灌裝→成品

操作要點(diǎn)：白首烏清洗后，切成厚0.5 cm左右的片狀，真空冷凍干燥12 h后破碎磨粉，過60～80目篩后按一定比例加入奶粉和蔗糖后于5 MPa、50～60 ℃條件下均質(zhì)，然后120～130 ℃條件下瞬時(shí)滅菌后，降至25～28 ℃，按1∶1比例接種德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌，在1%～5%接種量、28～32 ℃溫度一定條件下發(fā)酵6～30 h，然后在4 ℃冰箱中后熟12～24 h，最后無菌灌裝，得到一款營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特的白首烏發(fā)酵乳。

1.3.2 白首烏發(fā)酵乳制備條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

為使產(chǎn)品風(fēng)味獨(dú)特、口感更為柔和，對(duì)其過篩目數(shù)、白首烏粉、奶粉和蔗糖的添加比例、菌種接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，以感官品評(píng)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。選定白首烏粉過篩目數(shù)為50、60、70、80、90目，白首烏、奶粉和蔗糖的添加質(zhì)量比為1∶1∶1、1∶2∶1、1∶1∶2、2∶1∶1、1∶2∶2，菌種接種量為1%、2%、3%、4%、5%，發(fā)酵溫度分別為28 ℃、29 ℃、30 ℃、31 ℃、32 ℃，發(fā)酵時(shí)間分別為6 h、12 h、18 h、24 h、30 h，研究這幾個(gè)因素對(duì)白首烏發(fā)酵乳感官評(píng)分影響。

1.3.3 白首烏發(fā)酵乳制備條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

選取單因素試驗(yàn)中對(duì)響應(yīng)值（感官評(píng)分）有顯著影響的因素，菌種接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）和發(fā)酵時(shí)間（C），設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 白首烏發(fā)酵乳制備條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for preparation process optimization of Cynanchum bungei fermented milk

1.3.4 測(cè)定方法

感官評(píng)定：由50名評(píng)審員（具有食品感官品評(píng)經(jīng)驗(yàn)的學(xué)生）從色澤、滋味與香味、口感、組織狀態(tài)等方面進(jìn)行評(píng)分，感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 白首烏發(fā)酵乳感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of Cynanchum bungei fermented milk

ABTS法抗氧化活性測(cè)定：依據(jù)參考文獻(xiàn)[23]的操作方法，繪制的得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=5.152 4x-3.680 1，相關(guān)系數(shù)R2為0.996。然后以同樣的方法測(cè)定白首烏發(fā)酵乳維生素C含量，ABTS值以維生素C當(dāng)量（vitamin C equivalent，VCE）表示。

活菌數(shù)的測(cè)定：依據(jù)參考文獻(xiàn)[24]的操作方法，計(jì)算白首烏發(fā)酵乳中的活菌數(shù)。

酸度測(cè)定：依據(jù)參考文獻(xiàn)[25]的操作方法，記錄白首烏發(fā)酵乳消耗標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液體積，計(jì)算白首烏發(fā)酵乳酸度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 過篩目數(shù)對(duì)白首烏發(fā)酵乳感官及抗氧化能力的影響

由圖1可知，在50～90目范圍內(nèi)，隨著過篩目數(shù)的增大，感官評(píng)分呈先增高后降低趨勢(shì)，在80目時(shí)達(dá)到最高，此時(shí)感官評(píng)分達(dá)到88分，增高的原因可能是由于目數(shù)增加，白首烏粉粒度越來越小，口感及組織狀態(tài)更為細(xì)膩、柔和，從而感官評(píng)分上升，當(dāng)粉碎過細(xì)時(shí)，易于粘結(jié)成塊，不利于微生物作用，從而使得發(fā)酵不完全導(dǎo)致感官評(píng)分下降；與此同時(shí)，在50～80目范圍內(nèi)，ABTS值隨目數(shù)增加呈先增高后降低趨勢(shì)，在80目時(shí)達(dá)到最高值，為575.45 mgVCE/L，表明隨著白首烏粒度越小，原料利用率越高，活性成分形成越多，但當(dāng)粒度過細(xì)時(shí)易于粘結(jié)成塊，不利于微生物作用，從而使得發(fā)酵不完全導(dǎo)致抗氧化性能下降。因此，選擇過篩篩目為80用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 過篩目數(shù)對(duì)白首烏發(fā)酵乳感官評(píng)分和抗氧化能力影響Fig.1 Effect of meshes on sensory score and antioxidant capacity of Cynanchum bungei fermented milk

2.1.2 白首烏粉、奶粉和蔗糖添加質(zhì)量比對(duì)白首烏發(fā)酵乳感官及抗氧化能力的影響

圖2 添加原料質(zhì)量比對(duì)白首烏發(fā)酵乳感官評(píng)分和抗氧化能力影響Fig.2 Effect of addition mass ratio of material on sensory score and antioxidant capacity of Cynanchum bungei fermented milk

由圖2可知，隨白首烏粉、奶粉和蔗糖添加比例的變化，白首烏發(fā)酵乳的感官評(píng)分呈先降低后升高再降低的趨勢(shì)，當(dāng)白首烏粉∶奶粉∶蔗糖=1∶2∶2時(shí)感官評(píng)分達(dá)到最高，為90分，此時(shí)白首烏發(fā)酵乳奶香突出，有淡淡藥香，且酸甜可口，原因是此時(shí)奶粉、蔗糖、白首烏粉發(fā)酵生成的糖酸比合適，且白首烏香氣不突出；當(dāng)白首烏粉∶奶粉∶蔗糖=2∶1∶1時(shí)，白首烏發(fā)酵乳ABTS值最高，為581.32 mgVCE/L，其次為1∶2∶2，ABTS值為573.2 mgVCE/L，但此時(shí)白首烏粉比例為最低，原因可能是由于奶粉、蔗糖比例較高，微生物發(fā)酵作用較好，導(dǎo)致的白首烏中抗氧化成分溶于發(fā)酵乳以及微生物作用生成較多抗氧化物質(zhì)所致。因此，綜合考慮感官評(píng)分和ABTS值，選擇白首烏粉∶奶粉∶蔗糖=1∶2∶2添加比例用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 接種量對(duì)白首烏發(fā)酵乳感官及抗氧化能力的影響

圖3 接種量對(duì)白首烏發(fā)酵乳感官評(píng)分和抗氧化能力影響Fig.3 Effect of inoculum on sensory score and antioxidant capacity of Cynanchum bungei fermented milk

由圖3可知，在接種量1%～4%范圍內(nèi)，隨著接種量的增加，感官評(píng)分逐漸增加，當(dāng)接種量為4%時(shí)達(dá)到最高，最高為86分，此時(shí)白首烏發(fā)酵乳酸度較為適中，酸甜比較為合適，當(dāng)接種量＞4%時(shí)，酸度過高，導(dǎo)致感官評(píng)分下降；接種量對(duì)白首烏發(fā)酵乳抗氧化活性也有一定影響，ABTS值在接種量為1%～3%范圍內(nèi)逐漸增高，3%達(dá)到最高，為554.4 mgVCE/L，隨后趨于平緩，表明接種量增加在1%～3%范圍內(nèi)可以加快發(fā)酵過程中抗氧化活性物質(zhì)的形成。由于接種量的增加，微生物對(duì)原料的利用率增加，白首烏粉中抗氧化物質(zhì)（如多酚黃酮等）成分會(huì)隨著微生物的作用從其細(xì)胞壁中釋放到發(fā)酵體系中，從而引起抗氧化活性增高。但是，如果接種量過多，微生物生長(zhǎng)也會(huì)消耗更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致部分抗氧化物質(zhì)轉(zhuǎn)化或分解，使得抗氧化活性降低。因此，選擇最適接種量為4%用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)白首烏發(fā)酵乳感官及抗氧化能力的影響

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)白首烏發(fā)酵乳感官評(píng)分和抗氧化能力影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on sensory score and antioxidant capacity of Cynanchum bungei fermented milk

由圖4可知，在28～32 ℃范圍內(nèi)，感官評(píng)分隨著發(fā)酵溫度的升高呈先增加后降低趨勢(shì)，發(fā)酵溫度為31 ℃時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最高為83分，溫度過低或過高，會(huì)造成微生物較少或者較多，菌種活性較差，同時(shí)發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸過低或過高，從而使得感官評(píng)分較低；ABTS值隨發(fā)酵溫度變化趨勢(shì)與感官評(píng)分變化趨勢(shì)與一致，發(fā)酵溫度為31 ℃時(shí)，ABTS值達(dá)到最高為562.3 mgVCE/L，可能是由于適宜的溫度使得白首烏發(fā)酵乳菌的數(shù)量和活性較為適中，從而通過微生物作用，使得白首烏發(fā)酵乳抗氧化活性較高。因此，選擇發(fā)酵溫度為31 ℃用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)白首烏發(fā)酵乳感官及抗氧化能力的影響

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)白首烏發(fā)酵乳感官評(píng)分和抗氧化能力影響Fig.5 Effect of fermentation time on sensory score and antioxidant capacity of Cynanchum bungei fermented milk

由圖5可知，在6～24 h范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，感官評(píng)分呈先增加后降低趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為24 h時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最高，為86分，隨后降低，表明隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，菌的數(shù)量逐漸增加，乳酸等有機(jī)酸逐漸增加，在24 h達(dá)到較優(yōu)的甜酸比，隨后，酸度繼續(xù)增加，引起過酸的不適感，導(dǎo)致感官評(píng)分降低；在6～18 h范圍內(nèi)隨著發(fā)酵時(shí)間，ABTS值逐漸增加，發(fā)酵時(shí)間為18 h時(shí)，達(dá)到最高為583.6 mgVCE/L，隨后呈降低趨勢(shì)，可能是由于發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)引起白首烏發(fā)酵乳中活性成分的分解。同時(shí)發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)引起生產(chǎn)周期長(zhǎng)、成本高等，因此，選定發(fā)酵時(shí)間為18 h。

2.2 雙響應(yīng)值聯(lián)合優(yōu)化白首烏發(fā)酵乳工藝

采用Design Expert 10軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)，在過篩數(shù)目為80目，白首烏粉∶奶粉∶蔗糖=1∶2∶2條件下，以白首烏發(fā)酵乳感官評(píng)分（R）為響應(yīng)值，優(yōu)化接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）及發(fā)酵時(shí)間（C），獲得白首烏發(fā)酵乳最佳發(fā)酵條件。Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

響應(yīng)值（感官評(píng)分）所得的回歸方程為：

回歸方程方差分析見表4。由表4可知，所設(shè)定的各發(fā)酵因素對(duì)感官評(píng)分影響順序?yàn)锳＞B＞C，即接種量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間，三者對(duì)于感官評(píng)分影響顯著（P＜0.05），交互項(xiàng)BC以及二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)感官評(píng)分的影響顯著（P＜0.05），交互項(xiàng)AC對(duì)感官評(píng)分影響極顯著（P＜0.01）；感官評(píng)分回歸模型達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），失擬項(xiàng)P值不顯著，表明回歸方程擬合度較好，在自變量范圍內(nèi)能較好的反映響應(yīng)值變化，可用于白首烏發(fā)酵乳優(yōu)化工藝參數(shù)的理論值預(yù)測(cè)。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken tests

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

發(fā)酵條件交互作用對(duì)感官評(píng)分影響的立體分析圖分別如圖6。由圖6可知，接種量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度這三個(gè)因素交互作用在感官評(píng)分響應(yīng)面立體圖上均存在極值，發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間的側(cè)剖面圖弧度大于接種量的側(cè)剖面弧度，表明發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)感官評(píng)分模型的影響大于接種量的影響，從響應(yīng)面立體圖的投影，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間的等高線圖更接近橢圓，表明二者交互作用較顯著。

預(yù)測(cè)白首烏發(fā)酵乳最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為：接種量4.86%、發(fā)酵溫度為30.25 ℃、發(fā)酵時(shí)間為10.8 h。在此條件下，感官評(píng)分理論值為90分、ABTS理論值為585.7 mgVCE/L。為操作方便，對(duì)預(yù)測(cè)最優(yōu)值進(jìn)行調(diào)整，選定接種量5%、發(fā)酵溫度為30 ℃、發(fā)酵時(shí)間為11 h作為最佳發(fā)酵工藝參數(shù)。然后進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示，在此條件下感官評(píng)分實(shí)際值為88分、ABTS實(shí)際值580.2mgVCE/L，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值無顯著性差異。

圖6 接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間交互作用對(duì)白首烏發(fā)酵乳感官評(píng)分影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between inoculum,fermentation temperature and time on sensory score of Cynanchum bungei fermented milk

2.3 白首烏發(fā)酵乳活菌數(shù)與酸度測(cè)定

測(cè)定優(yōu)化后工藝制備的白首烏發(fā)酵乳中的活菌數(shù)和酸度，結(jié)果顯示，白首烏發(fā)酵乳中乳酸菌活菌數(shù)為2.2×108個(gè)/mL≥1×106個(gè)/mL，大腸桿菌數(shù)≤1 CFU/mL；致病菌未檢出，其酸度測(cè)定值為85°T≥70°T，均符合GB 19302—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》。

3 結(jié)論

以白首烏粉、奶粉和蔗糖為原料，德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌為發(fā)酵劑，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化白首烏發(fā)酵乳工藝參數(shù)，最終得到：在過篩目數(shù)70目、白首烏粉∶奶粉∶蔗糖添加質(zhì)量比為1∶2∶2、接種量為4%、發(fā)酵溫度為30 ℃、發(fā)酵時(shí)間為11 h條件下，感官評(píng)分和ABTS值最高，分別為88分和580.2 mgVCE/L，此時(shí)活菌數(shù)2.2×108個(gè)/mL，酸度為85°T，即得到一款口感柔和、風(fēng)味獨(dú)特、滋味鮮美、抗氧化活性高的白首烏發(fā)酵乳。