復(fù)方金釵石斛保健酒緩解小鼠體力疲勞的研究

牛曼思，童鈺琴，李 姝，楊 陽，汪小玉，張家偉，王松濤，稅丕先

（1.瀘州品創(chuàng)科技有限公司，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川瀘州 646000）

疲勞是指機(jī)體在生理過程中，不能維持其機(jī)能的特定水平或器官原有的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度時(shí)呈現(xiàn)的生理現(xiàn)象。長期處于疲勞狀態(tài)造成的機(jī)體免疫功能紊亂和器官損傷，會嚴(yán)重威脅人類健康[1-2]。長久以來，國際上在緩解疲勞治療中的主流對策為藥物治療，一方面藥物治療起效迅速，效果顯著；但另一方面常規(guī)藥物治療所帶來的副作用、成癮性和依賴性，極大地限制了其臨床應(yīng)用范圍[3-4]。中醫(yī)藥長期臨床研究表明，許多傳統(tǒng)中藥對緩解和治療疲勞有積極作用，并表現(xiàn)出低毒副作用等優(yōu)勢，受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視[5]。

金釵石斛（Dendrobium nobileLindl.）為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，味甘、淡，性屬微寒，是歷版《中國藥典》所記載的名貴中藥材，被國際藥用植物界稱為“藥界大熊貓”，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金釵石斛中含有的主要活性成分包括倍半萜類、黃酮類、多糖類以及相關(guān)衍生物[6]。因其具備的較高藥用價(jià)值，金釵石斛已被廣泛地開發(fā)成種類繁多的藥品和保健食品，產(chǎn)品功效主要包括抗氧化、增強(qiáng)免疫力、緩解體力疲勞、清咽潤喉等[7-9]。然而，單味中藥作用較為單一，中醫(yī)藥常以整體論治，通常認(rèn)為復(fù)方中藥相比起單味藥材可以從多靶點(diǎn)多角度緩解疲勞。根據(jù)中醫(yī)理論，研究將補(bǔ)虛扶正和祛疲安神作為出發(fā)點(diǎn)[10]，以金釵石斛配伍人參、黃芪、五味子、茯苓四味中藥組成復(fù)方，五藥配合，意在益氣生津，補(bǔ)陰助陽。同時(shí)，研究以白酒作為復(fù)方溶媒，能夠極大程度地將藥材中的多酚類、倍半萜類等醇溶性成分溶出，增強(qiáng)藥理活性[11-12]，最終成品可兼具口感好、功效強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。

根據(jù)衛(wèi)生部關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知（衛(wèi)法監(jiān)發(fā)[2002]51號）附件1及附件2中名單中的原料及其他保健食品可用原料，組方中人參、黃芪、茯苓為藥食同源中藥，石斛和五味子為可用于保健食品的中藥?；谥嗅t(yī)藥理論以及現(xiàn)代藥理研究，本研究依據(jù)《保健食品功能學(xué)評價(jià)程序和檢驗(yàn)方法》對復(fù)方金釵石斛保健酒進(jìn)行緩解體力疲勞功效驗(yàn)證，為開發(fā)天然、無毒副作用的緩解體力疲勞類保健食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）昆明種雄性小白鼠：體質(zhì)量18～22 g，雄性，由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2013-17，使用許可證號：SCXK（川）2013-065。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫22～24 ℃，濕度65%～80%。給藥期間，動(dòng)物分籠以全價(jià)顆粒飼養(yǎng)，自由飲水。

尿素氮試劑盒、全血乳酸檢測試劑盒：上海酶聯(lián)生物科技有限公司；肝糖原測定試劑盒：南京建成生物工程檢驗(yàn)所；金釵石斛藥材（經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)生藥教研室稅丕先教授鑒定為蘭科石斛屬植物金釵石斛）：采自瀘州合江金釵石斛種植基地；人參飲片、五味子飲片、黃芪飲片、茯苓飲片：瀘州百草堂中藥飲片有限公司；濃香型白酒（52%vol）：由瀘州老窖提供。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-I800PC 紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；Multiskan FC型酶標(biāo)儀：賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；FA2204B電子天平：上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；HHS.21-4恒溫水浴鍋：常州諾基儀器有限公司；BPX-272恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)方金釵石斛保健酒的生產(chǎn)工藝流程及操作要點(diǎn)

人參、金釵石斛、黃芪、五味子、茯苓→打粉→浸潤→滲漉→收集→提取液檢驗(yàn)→計(jì)量稱質(zhì)量→配液→初濾→精濾→灌裝→封口→燈檢→包裝→檢驗(yàn)

操作要點(diǎn)：

藥材前處理：將藥材粉碎至65～80目的藥粉，按人參∶金釵石斛∶黃芪∶五味子∶茯苓（9∶6∶6∶2∶2）的比例混合。

浸潤：按照藥材粉∶白酒=1∶9（g∶mL）的比例加入酒精度為52%vol的濃香型白酒，在室溫（25～28 ℃）條件下浸潤18h。

滲漉：以5 mL/（min·kg）的流速滲漉至料液比為1∶12（g∶mL）。

配液：以濃香型白酒為基礎(chǔ)將提取液調(diào)配成酒精度為38%vol。

廠家推薦成人（體質(zhì)量以60 kg計(jì)），每日攝入量為100 mL/60 kg。根據(jù)前期研究測定[13]，金釵石斛復(fù)方保健酒的功效成分及含量為石斛堿183.37 mg/L、總黃酮219.74 mg/L。

1.3.2 劑量設(shè)計(jì)

參照《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003版）保健酒緩解體力疲勞實(shí)驗(yàn)。將小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為樣品低劑量組（LD）、中劑量組（MD）、高劑量組（HD），溶媒基酒組（BC），空白對照組（NC）。灌胃給藥0.2 mL/10 g，每天1次，連續(xù)30 d，實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲水、攝食，稱量體質(zhì)量。各組給藥如下：實(shí)驗(yàn)組低、中、高劑量組小鼠灌胃給予劑量相當(dāng)于人體給藥量的5倍、10倍、20倍，即8.4 mL/kg、16.7 mL/kg、33.4 mL/kg；溶媒對照組小鼠灌胃給予：等體積15%vol濃香型白酒；空白對照組小鼠灌胃給予：等體積生理鹽水。

1.3.3 小鼠體質(zhì)量增長測定

小鼠連續(xù)灌胃30 d，每日1次。分別在小鼠灌胃0 d、15 d、30 d時(shí)稱量小鼠體質(zhì)量。

1.3.4 小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)

小鼠連續(xù)灌胃30 d，末次給試樣24 h后將小鼠負(fù)體質(zhì)量5%的鉛皮，放入水深30 cm，水溫（25±0.5）℃的游泳箱內(nèi)，記錄小鼠自放入游泳開始至死亡的時(shí)間（以小鼠頭部沉水后8 s無法上浮，放于平面無法完成翻正反射作為力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)）。

1.3.5 小鼠血乳酸（blood lactic acid，BLA）實(shí)驗(yàn)

連續(xù)灌胃30 d，末次灌胃給予受試酒24 h后尾靜脈采血50 μL，采血后在溫度為30 ℃的水中游泳10 min后停止，立即采血50 μL，休息20 min后眼球再采血50 μL。靜置3 h后分離得血清，按照試劑盒方法測血乳酸含量。并根據(jù)下式計(jì)算出血乳酸曲線下面積：

式中：S表示血乳酸曲線下面積；H0表示游泳前血乳酸值，mmol/L；H1表示游泳后0 min血乳酸值，mmol/L；H2表示游泳后休息20 min血乳酸值，mmol/L。

1.3.6 小鼠血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）實(shí)驗(yàn)

連續(xù)灌胃30 d，末次給受試物24 h后分別將各組小鼠無負(fù)重分別放入水溫30 ℃水中游泳90 min，休息60 min后采眼球血0.5 mL，放置3 h后分離血清，用酶法試劑盒測定尿素氮。

1.3.7 小鼠肝糖原實(shí)驗(yàn)

精確稱取肝臟100 mg，生理鹽水洗凈濾紙吸干多余水分，按照試劑盒方法將樣本與堿液按1∶3加入試管，沸水浴20 min，流水冷卻，將肝糖原水解液配制成1%檢測液，配制空白與標(biāo)準(zhǔn)，混勻，沸水浴5 min，冷卻，于波長620 nm處比色，按照肝糖原測定試劑盒操作說明書計(jì)算肝糖原含量。

1.3.8 小鼠肝腎組織病理學(xué)檢查

連續(xù)灌胃30 d，末次給受試物24 h后取出肝和腎，放于10%甲醛溶液中。經(jīng)HE染色制作病理切片。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)均以表示。利用T檢驗(yàn)，首先檢驗(yàn)方差齊性，再對組間分析，P≤0.05則差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P≤0.01差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方金釵石斛保健酒對小鼠體質(zhì)量的影響

灌胃30 d期間，小鼠無異常反應(yīng)，皮毛光亮，精神狀態(tài)較好。由表1可知，各組小鼠初始體質(zhì)量均衡（P＞0.05），中期和末期各組小鼠的體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明樣品對小鼠的生長無不良影響。

表1 復(fù)方金釵石斛保健酒對小鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effect of compound Dendrobium nobile health wine on mice body mass

2.2 復(fù)方金釵石斛保健酒對小鼠負(fù)重游泳的影響

由表2可知，基酒組與空白組對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；中劑量組小鼠游泳時(shí)間顯著長于空白組和基酒組（P＜0.05）。

表2 復(fù)方金釵石斛保健酒對小鼠負(fù)重游泳的影響Table 2 Effect of compound Dendrobium nobile health wine on the loaded-swimming of mice

2.3 復(fù)方金釵石斛保健酒對小鼠血乳酸含量的影響

由表3可知，游泳前5組小鼠血乳酸含量差異不顯著（P＞0.05）；游泳10 min后中劑量組小鼠的血乳酸含量顯著低于空白組、基酒組（P＜0.05），高劑量組小鼠的血乳酸含量極顯著低于空白組、基酒組（P＜0.01）；游泳結(jié)束后20 min，5組小鼠血乳酸含量差異不顯著（P＞0.05）。經(jīng)計(jì)算，中劑量組、高劑量組小鼠的血乳酸曲線下面積極顯著低于空白組、基酒組（P＜0.01）。復(fù)方金釵石斛保健酒可以通過降低小鼠運(yùn)動(dòng)后血乳酸堆積緩解體力疲勞。

表3 復(fù)方金釵石斛保健酒對小鼠血乳酸的影響Table 3 Effect of compound Dendrobium nobile health wine on the blood lactic acid of mice

2.4 復(fù)方金釵石斛保健酒對小鼠血清尿素氮的影響

運(yùn)動(dòng)過程中機(jī)體蛋白質(zhì)和氨基酸分解，含氮物質(zhì)在體內(nèi)堆積，小鼠BUN含量升高。由表4可知，基酒組小鼠的血清尿素氮含量顯著低于空白組（P＜0.05），低劑量組、中劑量組以及高劑量組小鼠的血清尿素氮含量均極顯著低于基酒組（P＜0.01）。說明酒精會減慢尿素氮在血液中的代謝分解速率，而復(fù)方金釵石斛保健酒可以加快尿素氮的代謝從而降低小鼠運(yùn)動(dòng)后體內(nèi)的尿素氮含量。

表4 復(fù)方金釵石斛保健酒對小鼠血清尿素氮的影響Table 4 Effect of compound Dendrobium nobile health wine on the blood urea nitrogen of mice

2.5 復(fù)方金釵石斛保健酒對小鼠肝糖原的影響

肝糖原為機(jī)體可以利用的糖儲存，糖原儲存水平直接影響運(yùn)動(dòng)耐力水平。由表5可知，五組小鼠肝糖原含量差異不顯著（P＞0.05），說明復(fù)方金釵石斛保健酒不能通過增加小鼠肝糖原的儲存達(dá)到緩解體力疲勞的效果。

表5 復(fù)方金釵石斛保健酒對小鼠肝糖原的影響Table 5 Effect of compound Dendrobium nobile health wine on the hepatic glycogen of mice

2.6 復(fù)方金釵石斛保健酒對小鼠肝、腎組織的影響

由圖1A～圖1E可知，小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝索排列整齊，呈放射狀。空白組、低劑量組、中劑量組、高劑量組的肝細(xì)胞大小一致，核呈圓形，核仁清晰，可見肝細(xì)胞漿粉染，無腫脹和空泡，匯管區(qū)無炎細(xì)胞浸潤，細(xì)胞核明顯，細(xì)胞之間邊界清晰。而溶媒組出現(xiàn)輕微細(xì)胞空泡現(xiàn)象。由圖1F～圖1J可知，腎皮質(zhì)髓質(zhì)分界清晰，腎被膜未增厚，腎小球結(jié)構(gòu)正常，未見增生萎縮或纖維化，腎小管上皮細(xì)胞呈立方形，細(xì)胞排列緊密，管腔未見異常管。其中基酒組腎臟切片，均有不同程度的中性粒細(xì)胞炎性浸潤。以上結(jié)果表明酒精對腎組織有損傷作用，而復(fù)方金釵石斛保健酒對肝、腎無損傷作用。

圖1 復(fù)方金釵石斛保健酒對小鼠肝、腎組織的影響Fig.1 Effect of compound Dendrobium nobile health wine on pathological section of liver and kidney tissue in different dose groups

2.7 討論

復(fù)方金釵石斛保健酒運(yùn)用傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論配伍組方，兼顧了滋陰和補(bǔ)氣兩大抗疲勞治法。組方中金釵石斛一直以來是中醫(yī)藥用于治療“虛損羸弱”的常用藥材，因其明確獨(dú)特的功效，近年來被廣泛研究，但藥理活性主要集中在抗腫瘤和降血糖等方面[14]，關(guān)于金釵石斛緩解體力疲勞的研究報(bào)道較少，梁鈞淞等[15]提取金釵石斛中的堿溶性多糖，發(fā)現(xiàn)提取物能夠通過提高血糖和甘油三酯含量、增加脂肪利用并延緩乳酸和氨積累等功效機(jī)理達(dá)到緩解體力疲勞的效果。組方其他四味藥材在不同程度上均有一定的緩解體力疲勞活性[16-19]。復(fù)方金釵石斛保健酒作為復(fù)合醇提物，緩解體力疲勞的藥理活性非五種藥材的機(jī)理相疊加，多種成分互相作用改變了各自原有的緩解體力疲勞作用途徑，甚至可能會產(chǎn)生毒副作用[20]。因此本研究對小鼠進(jìn)行了負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)以及血乳酸、血清尿素氮、肝糖原三個(gè)相關(guān)生化指標(biāo)的檢測，以達(dá)到闡明復(fù)方金釵石斛保健酒對小鼠緩解體力疲勞機(jī)理的目的；同時(shí)對肝、腎組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，觀察復(fù)方金釵石斛保健酒對肝、腎這兩個(gè)主要代謝組織是否有毒副作用。

長時(shí)間重復(fù)的體力勞動(dòng)會導(dǎo)致疲勞，引起一系列內(nèi)分泌系統(tǒng)改變，運(yùn)動(dòng)耐力的下降是疲勞最主觀的表現(xiàn)形式和最客觀的指標(biāo)[21]，因此負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)是評價(jià)小鼠緩解體力疲勞能力最好的模型。在本次研究中，中劑量的復(fù)方金釵石斛保健酒能延長小鼠游泳時(shí)間（P＜0.05）。為了更進(jìn)一步研究復(fù)方金釵石斛保健酒對小鼠的抗疲勞機(jī)理，測定了幾種疲勞生化指標(biāo)說明作用途徑。劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)機(jī)體相對缺氧，糖酵解加快，產(chǎn)生大量乳酸，使肌肉中H+濃度上升pH值下降，乳酸大量堆積后，會降低肌肉反應(yīng)度，使肌肉負(fù)荷和運(yùn)動(dòng)能力大大降低，產(chǎn)生疲勞感[22-23]。因此，加快乳酸分解或減少其產(chǎn)生都能緩解疲勞，BLA水平能反應(yīng)疲勞程度。較長時(shí)間運(yùn)動(dòng)后，機(jī)體蛋白質(zhì)與氨基酸分解代謝加強(qiáng)，血尿素氮明顯增加，身體對負(fù)荷的適應(yīng)性減弱，產(chǎn)生的尿素氮增加，BUN含量能反應(yīng)機(jī)體負(fù)荷能力[24]。糖是肌肉活動(dòng)時(shí)能量的主要來源，長時(shí)間的運(yùn)動(dòng)，體力和糖原的耗竭會同時(shí)發(fā)生[25]，糖原的含量高低能說明疲勞的深淺程度。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，中、高劑量的復(fù)方金釵石斛保健酒能夠減少運(yùn)動(dòng)后堆積在小鼠體內(nèi)的BLA（P＜0.01）；低、中、高劑量的復(fù)方金釵石斛保健酒能減少小鼠血清中的BUN堆積（P＜0.01）；肝糖原水平未發(fā)生變化。這說明在負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)中，耐力的增強(qiáng)和減少BLA、BUN的堆積這兩種機(jī)理有關(guān)，而非通過提高糖原儲存來達(dá)到緩解體力疲勞效果。

數(shù)據(jù)表明，小鼠運(yùn)動(dòng)后基酒組BUN含量高于空白對照組（P＜0.05），這說明酒精的損傷作用，導(dǎo)致機(jī)體不能及時(shí)清除BUN，使身體負(fù)荷能力變差。為了進(jìn)一步探究酒精作用機(jī)理，對小鼠的肝和腎進(jìn)行HE染色切片觀察。結(jié)果顯示空白組和三個(gè)劑量組小鼠肝、腎組織未發(fā)生病變?；平M的肝細(xì)胞的輕微空泡可能為脂肪肝，機(jī)體長期攝入乙醇，乙醇脫氫酶使乙醇脫氫氧化，此過程影響三羧酸循環(huán)從而導(dǎo)致脂肪代謝減弱，脂肪堆積于肝中形成脂肪肝，在病理切片中體現(xiàn)為細(xì)胞空泡。腎組織有炎性浸潤，基酒中的醇類屬于水溶性外源物質(zhì)，進(jìn)入體內(nèi)后除部分被胃吸收，容易在腎臟細(xì)胞和間質(zhì)內(nèi)沉積，對腎造成腫脹、損傷、炎癥反應(yīng)等不同程度的損害，造成機(jī)體氧化應(yīng)激產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[26]。復(fù)方金釵石斛中的成分與基酒中不易被吸收的物質(zhì)締合，削弱了純基酒對肝、腎的損傷，與純基酒對比復(fù)方金釵石斛保健酒對肝腎的毒副作用不明顯。

3 結(jié)論

通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對小鼠緩解體力疲勞活性進(jìn)行考察，結(jié)果表明復(fù)方金釵石斛保健酒對體重不產(chǎn)生明顯影響。中劑量（16.7 mL/kg）復(fù)方金釵石斛保健酒能顯著增加小鼠游泳時(shí)間（P＜0.05），給予中（16.7 mL/kg）、高劑量（33.4 mL/kg）復(fù)方金釵石斛保健酒能極顯著降低運(yùn)動(dòng)后小鼠BLA水平（P＜0.01）。低（8.4mL/kg）、中（16.7mL/kg）、高劑量（33.4mL/kg）可極顯著降低運(yùn)動(dòng)后小鼠BUN含量（P＜0.01），但復(fù)方金釵石斛保健酒不能通過改變小鼠肝糖原緩解體力疲勞（P＞0.05）。各劑量組肝和腎細(xì)胞完整清晰，均未受損傷。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》，負(fù)重游泳結(jié)果為陽性，且血乳酸、血清尿素和肝糖原三項(xiàng)生化指標(biāo)中任意兩項(xiàng)為陽性，可判定復(fù)方金釵石斛保健酒具有緩解小鼠體力疲勞的功效，研究結(jié)果為開發(fā)安全有效的緩解體力疲勞保健食品提供了參考。