TNF-α對大鼠肺泡 Ⅱ 型上皮細(xì)胞增殖及凋亡的影響*

石國翠， 馬希剛

1河北滄州市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，滄州 0610002寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，銀川 750001

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是以中性粒細(xì)胞聚集和肺屏障通透性增加為病理特征的臨床綜合征。全球每年急性肺損傷的患病率為1.5/10萬～6.5/10萬，病死率約為32%～55%[1]。目前急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制尚未明確，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolar typeⅡepithelial cells，AEC-Ⅱ)是其重要病理部位。大量研究發(fā)現(xiàn)急性肺損傷時(shí)伴有AEC-Ⅱ的凋亡[2]，上皮細(xì)胞的凋亡破壞肺屏障的完整性，導(dǎo)致肺上皮屏障功能損傷。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是急性肺損傷早期的重要炎癥因子，參與其發(fā)生發(fā)展[3]。本研究主要觀察TNF-α對正常大鼠AEC-Ⅱ細(xì)胞增殖及凋亡的影響，探討TNF-α在急性肺損傷中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

大鼠AEC-Ⅱ購自上海拜力生物技術(shù)有限公司，重組大鼠TNF-α購自PEPROTECH公司，DME/F-12細(xì)胞培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司，胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，DMSO購自美國Sigma公司，Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物公司，大鼠IL-6 ELISA試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 AEC-Ⅱ的復(fù)蘇與傳代培養(yǎng) 從液氮罐中取出凍存管(含AEC-Ⅱ)立即放入37℃水浴鍋中，迅速搖晃解凍。1000 r/min離心5 min，用含10%FBS的DME/F-12培養(yǎng)液重懸，并以1×106/mL的密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。光鏡下觀察AEC-Ⅱ生長狀態(tài)及形態(tài)。當(dāng)細(xì)胞單層融合至90%時(shí)用含0.25%的胰蛋白酶消化傳代，取第3～6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理 將細(xì)胞分為：對照組，用含10%FBS DME/F-12培養(yǎng)液與AEC-Ⅱ共培養(yǎng)；TNF-α不同濃度及不同時(shí)間干預(yù)組，分別用等體積的5、10、20、40 ng/mL TNF-α溶液與AEC-Ⅱ共培養(yǎng)24、48、72 h。均置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 透射電鏡鑒定及觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 收集生長狀況良好的AEC-Ⅱ，1000 r/min離心5 min，棄上清，用預(yù)冷的緩沖液重懸細(xì)胞，2%戊二醛4℃固定1 h，預(yù)冷緩沖液漂洗2次，乙醇逐步脫水，1%四氧鋨酸后固定，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察。

1.2.4 MTT法測定細(xì)胞增殖情況 取對數(shù)生長期的AEC-Ⅱ，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度為0.5×105個(gè)/mL，以5000個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，TNF-α各組每孔分別加入不同濃度TNF-α溶液200 μL，對照組加入等體積的完全培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24、48、72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，更換為無血清培養(yǎng)液，每孔加入1×MTT溶液20 μL及不含F(xiàn)BS的DME/F-12培養(yǎng)液90 μL，37℃避光溫育4 h，使MTT還原為甲瓚。棄上清，每孔加二甲基亞砜(DMSO)150 μL，平板搖床搖蕩10 min，于490 nm處測定吸光度值(A)，按公式計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(對照組A值-實(shí)驗(yàn)組的A值)/對照組A值×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率 將AEC-Ⅱ細(xì)胞接種于6孔板上，接種密度為2×105個(gè)/mL，貼壁24 h后按照上述分組進(jìn)行處理，處理結(jié)束后用不含EDTA的胰酶消化后離心，冷PBS洗滌細(xì)胞，用1×Annexin Ⅴ結(jié)合液400 μL懸浮細(xì)胞，加入Annexin Ⅴ-FITC染色液5 μL，輕輕混勻后于2～8℃避光孵育15 min。加入10 μL PI染色液后輕輕混勻于2～8℃避光孵育5 min。1 h內(nèi)送流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.6 夾心ELISA法測定細(xì)胞上清液中IL-6的含量 收集上述各組細(xì)胞上清液，3000 r/min離心10 min，取上清。采用酶聯(lián)免疫法檢測，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行，最后置于酶標(biāo)儀450 nm波長處測定各孔A值，用標(biāo)準(zhǔn)品濃度及對應(yīng)的A值(復(fù)孔均值)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IL-6的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 電子顯微鏡下大鼠AEC-Ⅱ的超微結(jié)構(gòu)

透射電鏡下可見細(xì)胞表面有長短不一的微絨毛，細(xì)胞核較大，胞質(zhì)內(nèi)含有大小不一的特征性板層小體，沿細(xì)胞核分布，數(shù)量不等，可看到不同的成熟階段(圖1)。

圖1 AEC-Ⅱ透射電鏡下的超微結(jié)構(gòu)(箭頭所示為板層小體)Fig.1 Ultrastructure of AEC-Ⅱ under transmission electron microscope(lamellar bodies are indicated by arrows)

2.2 TNF-α對AEC-Ⅱ增殖的影響

不同濃度TNF-α相同作用時(shí)間下細(xì)胞增殖抑制率的比較：當(dāng)作用時(shí)間為24 h時(shí)，TNF-α 40 ng/mL組細(xì)胞的增殖抑制率明顯高于其它濃度組(均P<0.05)；48 h、72 h時(shí)TNF-α各濃度組細(xì)胞的增殖抑制率與對照組比較均明顯升高(均P<0.05)，且隨著濃度的增加，對細(xì)胞增殖的抑制率也隨之上升，各濃度組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。相同作用濃度不同作用時(shí)間下細(xì)胞增殖抑制率的比較：與24 h時(shí)比較，作用48、72 h時(shí)各濃度組細(xì)胞抑制率均明顯增加(均P<0.05)；TNF-α作用72 h后細(xì)胞的抑制率均較48 h明顯增加(均P<0.05)。見表1。

表1 TNF-α對AEC-Ⅱ增殖的影響Table 1 The effect of TNF-α on AEC-Ⅱ proliferation

同一作用時(shí)間不同TNF-α濃度組間比較：與對照組(TNF-α 0 ng/mL)比較，aP<0.05；與TNF-α 5 ng/mL組比較，bP<0.05；與TNF-α 10 ng/mL組比較，cP<0.05；與TNF-α 20 ng/mL組比較，dP<0.05。同一TNF-α濃度不同作用時(shí)間組間比較：與24 h組比較，*P<0.05；與48 h組比較，#P<0.05

2.3 TNF-α對AEC-Ⅱ凋亡的影響

作用時(shí)間24 h時(shí)，TNF-α 20 ng/mL組和TNF-α 40 ng/mL組的凋亡率與對照組比較明顯增加(均P<0.05)；在作用時(shí)間為48、72 h時(shí)，TNF-α的各濃度組AEC-Ⅱ細(xì)胞的凋亡率與對照組比較均明顯增加，且隨著濃度增加，細(xì)胞凋亡率逐漸增加，各濃度組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。TNF-α各濃度組細(xì)胞的凋亡率隨作用時(shí)間的延長而增加，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見圖2。

與對照組比較，*P<0.05；相同作用時(shí)間下各濃度組間兩兩比較，▲P<0.05圖2 TNF-α對AEC-Ⅱ凋亡的影響Fig.2 Effect of TNF-α on AEC-Ⅱ apoptosis

2.4 TNF-α對AEC-Ⅱ細(xì)胞上清液中IL-6含量的影響

在TNF-α同一作用時(shí)間下，各濃度組間兩兩比較，TNF-α 40 ng/mL組IL-6水平較對照組及TNF-α 5 ng/mL組明顯升高(均P<0.05)，其余各濃度組間兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。在同一作用濃度下，各時(shí)間點(diǎn)組間兩兩比較，細(xì)胞上清液中IL-6的水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 TNF-α對體外培養(yǎng)的AEC-Ⅱ上清液中IL-6水平的影響Table 2 The effect of TNF-α on the level of IL-6 in the supernatant of AEC-Ⅱin vitro

3 討論

肺屏障主要由肺泡表面液體層、肺泡上皮細(xì)胞層、上皮基底膜層、肺泡上皮和毛細(xì)血管之間的間隙(基質(zhì)層)、毛細(xì)血管基底膜、肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞層共同組成，維持肺內(nèi)外氣體交換及液體平衡。肺泡上皮細(xì)胞是肺與外界環(huán)境進(jìn)行氣體交換的物理屏障，主要由AEC-Ⅰ(占肺泡表面積的95%以上)和AEC-Ⅱ(合成和分泌表面活性物質(zhì))組成[4]。AEC-Ⅱ是肺泡上皮的祖細(xì)胞，可以自我增殖并分化為AEC-Ⅰ，促進(jìn)肺泡的組織修復(fù)[5]。因此，AEC-Ⅱ?qū)S持肺泡張力，防止肺泡萎陷及修復(fù)損傷的肺組織尤為重要。且研究發(fā)現(xiàn)，在AEC-Ⅱ受損時(shí)，即可導(dǎo)致肺水腫的形成，造成肺損傷[6]。故本研究選用AEC-Ⅱ作為研究對象，用透射電鏡鑒定，可見其胞漿豐富，含有不同成熟階段的板層小體，分布于細(xì)胞核的周圍。

TNF-α是肺損傷時(shí)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要因子，主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞產(chǎn)生。在炎癥反應(yīng)時(shí)，TNF-α過表達(dá)可以上調(diào)肺上皮及內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥介質(zhì)及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)，并促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化與凋亡[7]。本研究結(jié)果顯示：TNF-α與體外培養(yǎng)的大鼠AEC-Ⅱ共培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞的凋亡率明顯增加，且呈現(xiàn)時(shí)間-劑量依賴關(guān)系。說明急性肺損傷時(shí)，TNF-α誘導(dǎo)AEC-Ⅱ的凋亡，損傷肺泡組織。有研究顯示，AEC-Ⅱ的凋亡參與肺上皮屏障功能的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞旁通透性增加，增加水分子及其他溶質(zhì)分子通過細(xì)胞旁途徑進(jìn)入肺泡內(nèi)，引起肺水腫[8]。因此，ACE-Ⅱ細(xì)胞凋亡導(dǎo)致結(jié)構(gòu)細(xì)胞數(shù)量減少，肺表面活性物質(zhì)釋放減少，肺泡塌陷，肺組織病理變化加重，這可能與破壞了肺屏障的連續(xù)性及完整性，增加肺屏障的通透性有關(guān)。

在各種原因?qū)е碌募毙苑螕p傷模型中，TNF-α參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化、炎癥級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫功能[9-11]。研究證實(shí)，急性肺損傷時(shí)，TNF-α大量釋放，肺泡灌洗液中及血清中TNF-α的水平明顯升高[12-13]。過量的TNF-α可誘導(dǎo)炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子瀑布式釋放，加重肺部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肺損傷。因此，TNF-α在肺損傷的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。本研究將TNF-α與AEC-Ⅱ共培養(yǎng)后測定細(xì)胞的增殖抑制率，結(jié)果顯示TNF-α作用24 h時(shí)，只有TNF-α 40 ng/mL組細(xì)胞的增殖抑制率高于對照組，當(dāng)TNF-α作用時(shí)間延長至48 h、72 h時(shí)，TNF-α各組細(xì)胞的增殖均明顯受到抑制，說明TNF-α對細(xì)胞增殖的抑制作用與TNF-α的濃度及作用時(shí)間相關(guān)，濃度越高，作用時(shí)間越長，其對細(xì)胞的增殖抑制越明顯，這可能與TNF-α對細(xì)胞造成炎性損傷，并抑制細(xì)胞的有絲分裂有關(guān)。說明在急性肺損傷時(shí)，釋放入血的TNF-α刺激AEC-Ⅱ，誘導(dǎo)其凋亡，破壞肺屏障，導(dǎo)致肺損傷，進(jìn)而使更多的炎性介質(zhì)、液體、蛋白等滲透入肺泡，形成肺水腫，影響肺通氣及換氣功能，加重組織缺氧。同時(shí)過量釋放的TNF-α抑制AEC-Ⅱ的自我增殖，影響損傷肺組織的自我修復(fù)，從而進(jìn)一步加重肺損傷。

此外，TNF-α是損傷時(shí)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要因子，始動(dòng)炎癥級聯(lián)反應(yīng)和細(xì)胞因子瀑布效應(yīng)。研究證實(shí)，在急性肺損傷時(shí)，大鼠肺泡灌洗液及血清中的IL-6的水平明顯升高[14]。研究認(rèn)為這可能與TNF-α激活了NF-κB，促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生及釋放有關(guān)[15]。在本研究中，高濃度TNF-α組細(xì)胞上清液中IL-6的含量高于對照組及低濃度TNF-α組，說明TNF-α誘導(dǎo)IL-6水平的增加與TNF-α的作用濃度明顯相關(guān)，具有一定的劑量依賴效應(yīng)。而在同一濃度條件下，作用時(shí)間的長短并不影響IL-6水平的改變。說明TNF-α單獨(dú)作用于AEC-Ⅱ時(shí)，IL-6升高與TNF-α的濃度相關(guān)，而與作用時(shí)間無明顯關(guān)系。

綜上，TNF-α通過誘導(dǎo)AEC-Ⅱ的凋亡，導(dǎo)致肺損傷，并通過抑制其增殖，阻礙損傷肺組織的自我修復(fù)；同時(shí)，高濃度TNF-α誘導(dǎo)IL-6水平的上調(diào)，加重肺部的炎癥反應(yīng)，加重肺損傷。