乳及乳制品中β-內(nèi)酰胺酶常用檢測方法

陳少華 肖幸宇 劉鳳銀

摘 要：β-內(nèi)酰胺酶是一類可以催化水解β-內(nèi)酰胺類抗生素的水解酶，基于該原理，不法商販為了躲避β-內(nèi)酰胺類抗生素的檢查，人為向乳及乳制品中加入β-內(nèi)酰胺酶，營造“無抗奶”的假象，增加了乳品行業(yè)的安全風(fēng)險(xiǎn)。本文從乳及乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性、殘留危害、殘留現(xiàn)狀和檢測方法進(jìn)行闡述，通過分析當(dāng)前常用的檢測方法的優(yōu)劣勢，包括微生物分析法、儀器檢測方法、快速檢測方法，旨在為乳及乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法提供參考。

關(guān)鍵詞：乳及乳制品;β-內(nèi)酰胺酶;檢測方法;殘留

Common Detection Methods of β-Lactamase in Milk and Dairy Products

CHEN Shaohua， XIAO Xingyu， LIU Fengyin*

（College of Biology and Food Engineering， Guangdong University of Education， Guangzhou 510303， China）

Abstract： β-Lactamases are hydrolytic enzymes that can catalytically hydrolyze β-lactam antibiotics. Based on the principle， illegal providers add β-lactamases to milk and dairy products， hide from β-lactam antibiotics antibiotic inspections and create the illusion of “no anti milk”， increasing the safety risks to the dairy industry. In this paper， the stability， residual hazards， current status and detection methods of β-lactamases in dairy and dairy products are described. The advantages and disadvantages of current common detection methods， including microbiological analysis methods， instrumental detection methods，? and rapid detection methods are analyzed to provide a reference for the detection of β-lactamases in milk and dairy products.

Keywords： milk and dairy products; β-lactamase; detection methods; residues

β-內(nèi)酰胺酶是一類水解酶，可以催化水解β-內(nèi)酰胺類抗生素，導(dǎo)致抗生素失去抑菌活性。鑒于此，一些不法商販為了追求經(jīng)濟(jì)利益，沒有嚴(yán)格遵守休藥期的規(guī)定進(jìn)行采奶，導(dǎo)致牛奶中抗生素的殘留，為了躲避檢查，人為添加β-內(nèi)酰胺酶，營造“無抗奶”的假象。β-內(nèi)酰胺酶缺少安全性評價(jià)，其加入增加了乳品行業(yè)安全風(fēng)險(xiǎn)，因此針對乳及乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的檢測非常重要。目前尚未制定國家檢測標(biāo)準(zhǔn)，僅在《生乳中β-內(nèi)酰胺酶的測定》

（NY/T 3313—2018）中規(guī)定了生乳中β-內(nèi)酰胺酶的測定方法——杯碟法[1]。本文主要從乳及乳制品中

β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性、殘留危害、殘留現(xiàn)狀和檢測方法進(jìn)行闡述，分析常用檢測方法的優(yōu)勢與劣勢，旨在為選擇乳及乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法提供參考依據(jù)。

1 乳及乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性、殘留危害和殘留現(xiàn)狀

1.1 乳及乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性

β-內(nèi)酰胺酶具有較強(qiáng)的耐熱性和酸堿耐受性，市售牛奶大多采用巴氏滅菌或超高溫瞬時(shí)滅菌，貯存于低溫或常溫條件下，在該加工工藝和貯存條件下并不能使牛奶中β-內(nèi)酰胺酶完全失活，仍會有β-內(nèi)酰胺酶殘留。

范美婧等[2]探究了牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性，采用青霉素酶活性檢測試劑盒，從牛奶的保存時(shí)間、滅菌方法和酸堿處理3個方面對β-內(nèi)酰胺酶活性的影響進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低溫條件對酶活性影響不大，≤4 ℃貯存一周仍能檢出各個濃度的β-內(nèi)酰胺酶;常溫條件下，牛奶放置時(shí)間越長，酶活性越小，且減少程度與貯存溫度呈正相關(guān)關(guān)系，25 ℃和37 ℃條件下牛奶樣品貯存一周，酶活性降低;長時(shí)間高溫加熱會掩蓋低濃度β-內(nèi)酰胺酶的檢出，巴氏滅菌和超高瞬時(shí)滅菌等常規(guī)滅菌方法并不能使β-內(nèi)酰胺酸堿完全失活;市售酸奶pH為4～5，酸堿處理均會抑制低濃度β-內(nèi)酰胺酶的活性，但未完全失活，當(dāng)β-內(nèi)酰胺酶濃度>3 U/mL時(shí)仍能檢出，pH為6和7時(shí)最為穩(wěn)定。

1.2 乳及乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的殘留危害

①乳及乳制品中β-內(nèi)酰胺酶添加來源不明確，缺乏安全評價(jià)數(shù)據(jù)，這對我國乳及乳制品的質(zhì)量管理埋下了安全隱患;②β-內(nèi)酰胺酶水解抗生素生成的青霉噻唑酸分解產(chǎn)物具有細(xì)胞毒性，抑制細(xì)胞繁殖能力，殘留產(chǎn)物會在肝臟蓄積，成為潛在的健康風(fēng)險(xiǎn);③非法加入β-內(nèi)酰胺酶掩蓋抗生素超標(biāo)的現(xiàn)實(shí)，不僅極易造成奶制品市場抗生素使用泛濫，而且增加了耐藥基因的水平和縱向傳播風(fēng)險(xiǎn)，使人們抵抗傳染病能力下降、腸道菌群紊亂，從而對人體健康造成危害。

1.3 乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的殘留現(xiàn)狀

2008年衛(wèi)生部發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用性物質(zhì)名單》中將β-內(nèi)酰胺酶列為重點(diǎn)監(jiān)控指標(biāo)。各個地區(qū)的乳及乳制品檢測中均有不同程度的β-內(nèi)酰胺酶殘留，部分地區(qū)β-內(nèi)酰胺酶的檢出率較高，因此加強(qiáng)乳及乳制品中殘留的β-內(nèi)酰胺酶監(jiān)管力度，定期執(zhí)行檢測任務(wù)至關(guān)重要。

齊欣等[3]（2021）采用杯碟法對遼寧省原料乳進(jìn)行檢測，結(jié)果186批次樣品中β-內(nèi)酰胺酶的檢出率為12.4%;邱正勇（2019）等[4]采用膠體金檢測法對河南省鄭州市每月采集的60份生乳進(jìn)行檢測，結(jié)果β-內(nèi)酰胺酶檢出率波動較大，部分高達(dá)73.3%;秦婧[5]（2016）對陜西省149份生鮮乳進(jìn)行檢測，其陽性檢出率為11.4%;候海燕（2015）[6]對江蘇省淮安市149份牛奶樣品進(jìn)行檢測，其陽性率為16.8%。

2 乳及制品中β-內(nèi)酰胺酶常用檢測方法

2.1 微生物分析法

杯碟法檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的方法已經(jīng)較為成熟，該法采用對青霉素敏感的藤黃微球菌，利用舒巴坦能夠特異性抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性的性質(zhì)，以青霉素作為對照，通過比較加入舒巴坦和未加入舒巴坦產(chǎn)生的抑菌圈大小，從而間接測定牛奶中是否含有β-內(nèi)酰胺酶。

《生乳中β-內(nèi)酰胺酶的測定》（NY/T 3313—2018）農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了生乳中β-內(nèi)酰胺酶測定方法杯碟法[1]，其檢出限為生牛乳4 U/mL、生羊乳3 U/mL;劉旸等[7]研究兩種添加藤黃微球菌的方法對牛奶中β-內(nèi)酰胺酶檢出限的影響，方法1制備成15 cm厚的單層培養(yǎng)基，方法2制備成雙層培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)方法2其抑菌圈邊緣更加清晰，便于觀察和測量，該方法靈敏度更高，其檢出限在0.000 05～0.00 01 U/mL。

杯碟法是我國乳品行業(yè)認(rèn)可的常用微生物檢測方法，成本低，適用大批量檢測，檢測結(jié)果相對準(zhǔn)確，但實(shí)驗(yàn)過程煩瑣，周期長，容易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，不能進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)，對環(huán)境要求較高，不適用現(xiàn)場檢測，具有一定的局限性。

2.2 儀器檢測方法

2.2.1 高效液相色譜法

β-內(nèi)酰胺酶能酶解青霉素，且青霉素濃度的減少量與酶活性呈線性關(guān)系，因此可以通過測定青霉素濃度減少量來間接檢測β-內(nèi)酰胺酶的含量?；诖嗽?，李雪芳等[8-9]通過離心除脂、無水乙醇除蛋白，采用高效液相色譜法測定了奶粉中β-內(nèi)酰胺酶的含量，當(dāng)β-內(nèi)酰胺酶濃度在0.2～1.4 mg/L，與青霉素鉀的減少量呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，回收率89.0%～95.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差3.0%～3.5%。

高效液相色譜法因其高靈敏度和高回收率得到廣泛應(yīng)用，但樣品前處理較為煩瑣，檢測成本高，常用于實(shí)驗(yàn)室檢測，不適合現(xiàn)場高通量檢測。

2.2.2 分光光度法

利用β-內(nèi)酰胺酶水解β-內(nèi)酰胺類抗生素，其主要產(chǎn)物青霉噻唑酸具有還原性的性質(zhì)，李濱等[10]建立檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的硫酸銅-紫外分光光度法，按照1∶1的比例加入三氯乙酸，輔以冷凍離心沉淀蛋白后，其最低檢出限為5 U/mL;戴興德等[11]基于青霉素分子的硫原子具有還原性，能將Fe3+還原成Fe2+，與[Fe（CN）6]3-生成可溶性普魯士藍(lán)，而酶水解產(chǎn)物和堿水解產(chǎn)物青霉素噻唑酸均不能與Fe3+反應(yīng)，具有選擇性。利用該原理，建立檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺酶含量的普魯士藍(lán)顯色光度法，該方法耗時(shí)短，僅35 min，β-內(nèi)酰胺酶在4～24 U/mL與吸光值呈線性關(guān)系，檢出限為0.32 U/mL，加標(biāo)回收率為98.8%～101.2%。

分光光度法具有設(shè)備簡單、維修方便、操作簡單、實(shí)用性廣、準(zhǔn)確度和精密度好等優(yōu)點(diǎn)，但提高其方法的選擇性和降低檢出限，一直是遏待解決的問題。

2.3 快速測定方法

β-內(nèi)酰胺酶能水解青霉素，通過間接競爭法快速測定與β-內(nèi)酰胺酶反應(yīng)后殘留青霉素的含量，從而間接檢測出β-內(nèi)酰胺酶的含量。

利用青霉噻唑酸能還原Cu2+為Cu+，與2，2-聯(lián)喹啉生成紫紅色絡(luò)合物的性質(zhì)，施春煜[12]將醋酸纖維素膜浸泡于亞銅試劑溶液中，真空干燥制成顯色層，將過濾層、顯色層和吸收材料粘貼在基板上，制成檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺酶半定量快速測試紙，再結(jié)合分光測定儀制作標(biāo)準(zhǔn)比色卡，該方法最低檢出限為6 U/mL，相對誤差范圍為7.51%～15.38%;張威等[13]采用Charm Rosa β-內(nèi)酰胺酶試劑盒對150批乳及乳制品進(jìn)行批量篩查，其檢出限為4 U/mL，假陽性率為2%，靈敏度100%，特異性97.8%，具有高靈敏度和特異性，符合試劑盒快速篩查檢測要求。

快速測試法具有較高的靈敏度，操作簡單，檢測速度快，基本能滿足大批量篩選的要求，但容易出現(xiàn)假陽性，需結(jié)合杯碟法進(jìn)一步驗(yàn)證。

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